Ringraziamo i membri del laboratorio Gelfand che hanno contribuito allo sviluppo di questi protocolli. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Science del National Institutes of Health con il numero aggiudicazione R01GM052111 di VIG e basco Government Department of Education, dell&#39;Università e della Ricerca con il numero award BFI-2011-295 a UdC.

1. Cellule di Drosophila S2 <ol><li> Preparazione di vetrini ConA rivestiti <ol><li> Mettere coprioggetto in un rack ceramica e lavarli per immersione acido cromico per 1 ora. [ATTENZIONE: acido cromico è corrosivo e può causare irritazione di occhi, naso, gola e pelle]. </li><li> Sciacquare accuratamente con coprioggetto costantemente in esecuzione dH 2 O per 30 minuti fino a quando l&#39;acido è completamente lavato fuori. </li><li> Lasciare asciugare all&#39;aria coprioggetto e cappotto con ConA (soluzione 0,5 mg / ml di dH 2 O) per 30 minuti. </li><li> Sciacquare coprioggetto con dH 2 O per 15 minuti e lasciarli asciugare all&#39;aria. Coprioggetto ConA rivestiti possono essere memorizzati fino a 1 mese. </li></ol></li><li> Placcatura le cellule <ol><li> Consentono alle cellule S2 di crescere in modo esponenziale T25 o T75 cm 2 palloni a seconda del numero di cellule necessario per l&#39;esperimento. </li><li> Contare la densità cellulare utilizzando un emocitometro. Aggiungere 1 ml di crescita medium (per esempio Insect-Xpress) in un piatto di 35 millimetri di tessuto cultura con coprioggetto ConA rivestite, e delicatamente trasferire ~ 1 x 10 5 cellule al piatto. Questa densità cellulare è ottimale per l&#39;imaging perché i processi di celle diverse non si sovrappongano. </li><li> Al fine di indurre la formazione di processi, subito dopo la placcatura aggiungi medio 1ml con 5 mM CytoD al piatto (alla concentrazione finale di 2,5 mM CytoD). Consentire il completo sviluppo di processi incubando le cellule per almeno 2 ore a 25 ° C prima di imaging. </li></ol></li></ol> 2. Drosophila primaria Neuron Cultura <ol><li> Preparazione per la cultura neurone <ol><li> Preparare Drosophila mezzo di crescita neuronale (media di Schneider supplementato con siero: 20% fetale bovino, inattivati ​​termicamente a 55 ° C per 30 min; 5 mcg / insulina ml; 100 pg / ml di penicillina, 100 mg / streptomicina ml; 10 mcg / tetraciclina ml) . Questo supmezzo di pre realizzate Schneider può essere conservato a 4 ° C per 6 mesi. </li><li> Preparare fiale succo di mela agar per la raccolta di Drosophila embrioni (22,5 g di agar, 12,0 g di saccarosio e 750 ml di H 2 O in un pallone da 2 litri, autoclave per 20-25 minuti, aggiungere 250 ml di succo di mela e versare ~ 10 ml in ogni Drosophila fiala, dopo la solidificazione, collegare fiale con batuffoli di cotone, e avvolgere fiale con pellicola di plastica per alimenti per evitare di essiccazione del cibo). Il succo di mela in flaconcini di agar può essere conservato a 4 ° C in sacchetti di plastica ben chiusi per 4 settimane. </li><li> Cappotto lavata con acido 25 millimetri coprioggetto cerchio con ConA (vedi dettagli nel protocollo per le cellule di Drosophila S2) e sterilizzare sotto la luce UV per 10-15 min. Questi vetrini possono essere conservati per un mese. </li></ol></li><li> Drosophila cultura neuroni embrionali <ol><li> Mantenere giovane adulto vola in fiale di succo di mela agar addizionato con lievito secco per 1-2 giorni prima di raccogliere embrioni fo la preparazione neurone. </li><li> Il giorno di raccolta, al fine di sincronizzare gli embrioni raccolti, il trasferimento adulto vola a una mela fresco succo di agar fiala per 1 ora Precollection in luce e scartare questi embrioni. </li><li> Trasferimento vola a un nuovo flacone succo di mela agar, raccogliere embrioni per 1 ora, e trasferire le mosche per un altro flacone per un&#39;altra ora, sia nel buio per aumentare la resa embrione. </li><li> Rimuovere le mosche adulte dal succo di mela agar flacone e lasciare che gli embrioni si sviluppano altri 4 ore a 9-11 fasi a temperatura ambiente (4-6 embrioni hr-old sono tra palco 9-11). </li><li> Rimuovere gli embrioni spruzzando acqua in fiale e allentando gli embrioni dal succo di agar mela con un pennello piccolo (almeno 10 embrioni sono necessari per una buona neurone prep). </li><li> Trasferire gli embrioni a 100 micron maglia di nylon filtro cella con una pipetta di trasferimento per drenare l&#39;acqua (Prerisciacquare la pipetta di trasferimento in Drosophila tampone di lavaggio embrione, 0.4% NaCl, 0,03% TritonX-100). </li><li> Raccogliere gli embrioni dal filtro con un piccolo pennello, e trasferirli in una provetta da 1,5 ml riempita con 1 ml di Drosophila embrione di lavaggio (Nota: pulire le fibre di agar o di cotone utilizzando il pennello o puntali delle pipette). In questo protocollo, provetta da 1,5 ml dotato di un pellet usa e getta pestello di corrispondenza. </li><li> Lavare gli embrioni in Drosophila embrione lavaggio 3x. </li><li> Dechorionate gli embrioni in una soluzione fresca 1:01 di candeggina commerciale e il 95% di etanolo per 10 minuti [ATTENZIONE: candeggina può causare irritazione a occhi, naso, gola e pelle]. </li><li> Passare alla cappa coltura tissutale, e lavare gli embrioni 2x integrato nel mezzo di Schneider. </li><li> Lascia 200-300 microlitri di media nel tubo con gli embrioni, e delicatamente dissociare meccanicamente embrioni dechorionated utilizzando Kimble Chase pestelli pellet usa e getta che sono stati sterilizzati del 70% di etanolo (macinare 10-15x). </li><li> Centrifugare la miscela omogeneizzata a 20 xg per 2 minuti, e TRAnsfer il surnatante in una nuova provetta. [Questo passaggio è opzionale, aiuta a rimuovere i detriti embrione] </li><li> Centrifugare il surnatante a 550 xg per 2 minuti a pellet cellule. </li><li> Risospendere il pellet in 500 ml integrati cellule medie e di spin di Schneider giù di nuovo a 550 xg per 2 minuti, ripetere il ciclo di risospensione filatura volta. </li><li> Infine risospendere il pellet in ~ 100 ml, completata medio di Schneider e piastra le cellule su un vetrino ConA rivestito 25 millimetri in una sterile 35 millimetri piastra di Petri. Incubare per 10 min per permettere l&#39;adesione delle cellule. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno integrato di Schneider, con 5 micron CytoD per immergere il vetrino con le cellule attaccate. </li><li> Incubare il piatto in un umidificata 25 ° C incubatore notte prima di imaging. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence.</a> 3, 606-611 (2008).</li><li>Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. 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U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).</li><li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+and+dynein+move+a+peroxisome+in+vivo:+a+tug-of-war+or+coordinated+movement.">Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement.</a> Science. 308, 1469-1472 (2005).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+binding+by+dynactin+is+required+for+microtubule+organization+but+not+cargo+transport.">Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport.</a> J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).</li><li>Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+heavy+chain+mediates+microtubule+sliding+to+drive+changes+in+cell+shape.">Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).</li><li>Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule-binding+protein+ensconsin+is+an+essential+cofactor+of+Kinesin-1.">The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1.</a> Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).</li><li>Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin.">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441, 1162-1166 (2006).</li><li>Gunawardena, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila.">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li><li>Koo, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+of+amyloid+protein+in+Alzheimer+disease+undergoes+fast+anterograde+axonal+transport.">Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).</li><li>Stokin, G. B., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+Alzheimer's+disease.">Axonal transport and Alzheimer's disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).</li><li>Bilsland, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+axonal+transport+precede+ALS+symptoms+in+vivo.">Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).</li><li>Lloyd, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p150(Glued)+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini.">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74, 344-360 (2012).</li><li>Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+required+for+transport+initiation+from+the+distal+axon.">Dynactin is required for transport initiation from the distal axon.</a> Neuron. 74, 331-343 (2012).</li><li>Lorenzo, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrin+mutations+that+cause+spinocerebellar+ataxia+type+5+impair+axonal+transport+and+induce+neurodegeneration+in+Drosophila.">Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila.</a> J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).</li><li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages.">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li><li>Furst, A., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+primary+embryonic+neuroblasts+in+purified+neural+cell+cultures+from+Drosophila.">Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila.</a> Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).</li><li>Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neuronal+differentiation+of+Drosophila+embryo+cells.">In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells.</a> J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).</li><li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells:+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules.">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).</li><li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues.">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li><li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains.">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).</li><li>Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal+compartment+as+intracellular+calcium+store+in+MDCK+cells:+a+possible+involvement+in+InsP3-mediated+Ca2++release.">The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release.</a> Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui vi presentiamo protocolli dettagliati per studiare il trasporto di merci microtubuli-dipendente in cellule di Drosophila S2 e la cultura neurone primario. Entrambi i processi S2 e neuriti sono strutture riempito dal bundle microtubuli matrici che fungono da binari per il trasporto degli organelli. Due strategie sono tipicamente utilizzati per organelli etichetta: trasfezione di vettori che codificano una proteina fluorescente con una sequenza-organello il targeting o la colorazi...

Cellule di Drosophila S2 hanno guadagnato crescente popolarità per studiare molti processi cellulari. Queste cellule sono stati originariamente ottenuti da trypsinized embrioni fase tardiva della OregonR Drosophila melanogaster e mantengono le caratteristiche macrofagi-like 1. Cellule di Drosophila S2 offrono molti vantaggi rispetto ad altre linee cellulari. Essi sono coltivate a 25 ° C senza CO 2, e possono essere esposte per molte ore a temperatura ambiente senza la necessità di riscaldamento o scambio di gas. Ancora più importante, le cellule di Drosophila S2 sono molto sensibili al trattamento RNAi permettendo alta efficienza knockdown di proteine ​​di interesse. Cellule S2 sono altamente transfectable e linee cellulari stabili possono essere selezionati in meno di quattro settimane per permettere l&#39;espressione ectopica stabile di proteine ​​di interesse. Cellule S2 normalmente crescono sia liberamente associate, ma non si diffondono su un pallone o in sospensione. Essi possono essere indotti a diffondersi su vetrini rivestiti con una conca impianto lectinanavalin A (ConA). La periferia delle cellule spread è particolarmente sottile e quindi ideale per microscopia cellule vive. Protocolli dettagliati per coltura cellule S2, trattamento RNAi, imaging luce diretta e immunostaining possono essere trovati nel 2,3 letteratura. Il nostro laboratorio ha adottato le cellule S2 come sistema modello per studiare il trasporto merci basato microtubuli. Cellule di Drosophila S2 trattate con farmaci che depolimerizza o recide F-actina, come citocalasina D (CytoD), crescono lunghi processi pieni di microtubuli uniformemente polarizzati 4 -10, che lo rende un sistema ideale per studiare il movimento del carico lungo array microtubuli. Diversi parametri di trasporto in questi processi. (Cioè traiettorie lunghezze, velocità, direzionalità ecc) possono essere facilmente misurate utilizzando software particella di monitoraggio automatico, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Queste caratteristiche rendono le cellule S2 di un sistema interessante per studiare il trasporto di merci lungo i microtubuli in cellule di coltura di tessuti. Esperienze pilota in cellule S2 può essere esteso ad un modello fisiologicamente importante di studi trasporto merci in Drosophila neuroni primari. Simili alle cellule S2, colture di neuroni da embrioni dissociate sono permeabili a piccole molecole come coloranti e inibitori, e immagini ad alta risoluzione in tempo reale di trasporto organello possono essere eseguite in neuroni a temperatura ambiente. Utilizzo di Drosophila con differenti background genetico, possiamo esaminare la funzione dei geni nei neuroni primari per KO (mutazioni genetiche perdita-di-funzione), knockdown (dsRNA iniezione o espressione) o espressione ectopica (mosche transgeniche). In particolare, la frammentazione dei filamenti di actina mediante trattamento CytoD non impedisce crescita dei neuriti, invece crescono più velocemente, e quindi possiamo studiare microtubuli dependent trasporto organello nei neuroni CytoD trattati senza l&#39;influenza di actina Filamenti 11. Pertanto, colture neuronali primarie uniscono i vantaggi delle cellule di coltura di tessuti e volano genetica, che lo rende un ottimo sistema per studiare il trasporto di merci in un sistema fisiologico rilevante 10,12. Dal momento che diverse malattie neurodegenerative familiari potrebbero essere causati da o associate a difetti di trasporto merci (ad esempio, malattia di Parkinson 13, la malattia di Huntington 14, Morbo di Alzheimer 15,16, la Sclerosi Laterale Amiotrofica / ALS 17, HMN7B e Perry sindrome 18,19, e atassia spinocerebellare di tipo 5/SCA5 20), colture neuronali primarie possono essere utili per l&#39;analisi degli effetti di mutazioni specifiche che causano queste malattie sul trasporto microtubuli-dipendente. Infine, importanti proprietà di trasporto microtubuli-dipendente sono ben conservati tra i mammiferi e le mosche, ma <em&gt; Cultura genetica e delle cellule di Drosophila è meno costoso e richiede molto tempo, giustificando l&#39;uso di cellule in coltura di Drosophila per studiare aspetti essenziali del trasporto degli organelli in condizioni normali e patologiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="435">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Powder Insect cell medium (Schneider&#8217;s)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:179px;">S9895</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Insect &#8211;Xpress medium</td>
			<td style="width:133px;">Fisher</td>
			<td style="width:179px;">BW12730Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Insulin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">I6634</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Penicillin</td>
			<td style="width:133px;">Research Products International</td>
			<td style="width:179px;">P93000</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:124px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:133px;">Research Products International</td>
			<td style="width:179px;">S62000</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">T7660-5G</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:133px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:179px;">S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">C2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:124px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">IC15077105</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">LysoTracker Red DND-99</td>
			<td style="width:133px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:179px;">L7528</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">100 &#181;m Cell strainer</td>
			<td style="width:133px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">22363549</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">25 mm Circle cover glass</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">48380 080</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:124px;">Drosophila Vials</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:179px;">89092-730</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:124px;">Disposable pellet pestles with matching microtubes</td>
			<td style="width:133px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:179px;">749520-0000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organelle transport in cultured drosophila cells: s2 cell line and primary neurons.

Cellule di Drosophila S2 placcato su un vetrino in presenza di lunghi processi ramificati forma farmaco-actina depolimerizzante pieni di microtubuli uniformemente polarizzati. Organelli si muovono lungo questi processi da motori microtubuli. Facilità di manutenzione, elevata sensibilità alla proteina RNAi mediato knock-down e procedure efficienti per la creazione di linee cellulari stabili rendere le cellule di Drosophila S2 un sistema modello ideale per studiare il trasporto merci con immagini dal vivo. I risultati ottenuti con le cellule S2 possono essere ulteriormente applicate a un sistema più fisiologicamente rilevanti: trasporto assonale nei neuroni primari in coltura da embrioni dissociate Drosophila. Neuroni in coltura crescono lunghi neuriti piene di microtubuli in bundle, molto simili ai processi S2. Come in cellule S2, organelli in neuroni in coltura possono essere visualizzate da entrambi i coloranti fluorescenti specifici per organelli o utilizzando marcatori fluorescenti organelli codificate dal DNA iniettato in embrioni precoci o espresse in transgenderic vola. Pertanto, il trasporto degli organelli può essere facilmente registrato in neuroni coltivati ​​su vetrini utilizzando immagini viventi. Qui si descrivono le procedure per la coltura e la visualizzazione di trasporto merci in cellule di Drosophila S2 e neuroni primari. Noi crediamo che questi protocolli rendono entrambi i sistemi accessibili per i laboratori che studiano il trasporto merci.

Cellule di Drosophila S2 attaccate sulla diffusione vetrino ConA rivestite in un piatto rotondo di forma &quot;pancake&quot; (Figure 1A e 1C). Tuttavia, quando le cellule S2 piastrate su vetrini in presenza di CytoD e propagate per 2-3 ore, formano processi sottili lunghi riempito dal microtubuli parallele (Figure 1B e 1D). Questi microtubuli hanno polarità uniforme con più-termina fuori 7. Time-lapse imaging di fluorescenza di <em...

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Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Cellule di Drosophila S2 e neuroni in coltura sono grandi sistemi per l&#39;imaging dei trasporti organello motorizzata in vivo. Qui si descrive protocolli dettagliati per la coltura di entrambi i tipi di cellule, la loro rappresentazione e analisi di trasporto.

Organelle Trasporti in Colta<em&gt; Drosophila</em&gt; Celle: Cell Line S2 e Primaria neuroni.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

13.6K Views.  Feinberg School of Medicine, Northwestern University.  Cellule di Drosophila S2 e neuroni in coltura sono grandi sistemi per l'imaging dei trasporti organello motorizzata in vivo. Qui si descrive protocolli dettagliati per la coltura di entrambi i tipi di cellule, la loro rappresentazione e analisi di trasporto. 