Bragonzi의 실험실에서 연구는 이탈리아 낭포 성 섬유증 재단 (CFaCore) 및 EU-F​​7-2009-223670에 의해 투자되었다. 이 작품의 일부는 증류기, 고급 현미경 실험실에서 실시하고, 마우스의 조직 병리학은 병리학 해부학 (산 라파엘 과학 연구소) 단위로 수행되었다.

1. 만성 감염에 대한 준비 박테리아 (이전 마우스 도전에 세 이틀) <ol><li> 해당 P.에게 선택 루기 노자 균주는 시험한다. </li><li> P.의 백금이를 접종한다 Trypticase 간장 한천 (TSA) 플레이트에 -80 ° C 주식 문화에서 녹농균과 하룻밤 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 하나의 식민지를 선택하고 15 ML 스냅 덮인 관에 5 ㎖ Trypticase 간장 국물 (TSB)에 접종, 200 rpm에서 진탕 배양기에서 하룻밤 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 2. 만성 감염에 대한 한천 구슬에 박테리아를 포함 (이전의 감염에 한 일) <ol><li> 세균의 하룻밤 문화의 작은 나누어지는을 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 1:50 희석 및 600 nm에서 광학 밀도 (OD)를 측정한다. </li><li> 신선한 TSB 20 ㎖를 포함하는 새로운 스냅 덮인 관에서 2 OD를 추가하여 밤새 세균성 문화를 희석. </li><li> 약 3 ~ 37 ° C에서 알을 품다 -10-15 OD의 전체가 도달 될 때까지, 200 rpm에서 진탕 배양기에서 위상을 기록하는 4 시간. </li><li> 한편, 1.5 % 한천, 오토 클레이브와 수조에서 50 ° C로 평형화와 TSB 이루어지는 TSA를 준비한다. 물을 욕조에 50 ° C에서 삼각 플라스크에 preautoclaved 무거운 미네랄 오일 150 ㎖를 평형. </li><li> 일단 P. 녹농균은 4 ° C에서 15 분 동안 2,700 XG에서 원심 분리하여 박테리아 세포를 수집하고 상층 액을 버린다, 로그 단계에 도달한다. </li><li> 철저하게 완전히 펠렛을 재현 탁 할 1 멸균 PBS ㎖의 소용돌이에 박테리아 펠렛을 재현 탁. </li><li> 액체 TSA 9 ㎖를 50 ℃에서 사전 평형과 혼합 1 ㎖의 세균 현탁액 </li><li> 10 ㎖ TSA-P를 추가 바로 녹농균 (50 ° C에서 데워진) 중광 오일 혼합물은 실온에서 6 분 동안 교반 하였다. 교반은 기름에 보이는 소용돌이를 생성한다. </li><li> 최소 SP에서 교반, 4 ° C에 혼합물을 냉각35 분 (그림 1)에 대한 EED. </li><li> 추가로 20 분 동안 얼음에 한천 비즈 - 오일 혼합물을 휴식. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 2,700 XG에서 (50) ML 팔콘 튜브와 원심 분리기에 한천 구슬로 이동 </li><li> 정확히 미네랄 오일을 제거하고 단계 2.11에 설명 된대로, 멸균 PBS로 여섯 번 씻는다. 세 세척 후, 비드 대신 원심 분리기를 사용하여 중력에 의해 펠릿 화 될 수있다. 마지막으로 세척 한 후, 20 ~ 30 ㎖의 PBS에서 한천 구슬을 재현 탁. </li><li> 구슬 (약 0.5 ㎖)의 분취 량을 가지고 무균 균질화. </li><li> 균질화 된 구슬의 100 μl를 타고 멸균 PBS 900 μL로 희석. 직렬 10-6까지 1:10 희석. </li><li> 아래로 10-6, 37 ° C에서 접시를 배양 원액 샘플을 포함 TSA 플레이트 접시에 시리얼 희석, </li><li> 여러 분야에 거꾸로 광학 현미경을 사용하여 구슬의 직경을 측정합니다. 구슬의 직경 (100 ~ 200 μm의 사이에 있어야합니다 <str사연&gt; 그림 1). </li><li> 4 ℃에서 밤새 구슬을 저장 </li></ol><img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> 그림 1. 한천 비즈 준비와 마우스 감염의 개요. P. 녹농균이라는 박테리아 세포는 PBS 1 ㎖에 재현 탁 액체 TSA (50 ° C)의 9 ML에 추가됩니다. 이 혼합물을 플라스크에서 50 ° C에서 150 ㎖의 무거운 미네랄 오일에 첨가하고 실온에서 10 분 동안 고속으로 교반 하였다. 플라스크를 35 분 동안 천천히 교반하면서 4 ° C로 냉각 될 때, 한천 비즈를 만들어 고화하고, 혼합물에 존재하는 박테리아 한천 비드에 포함된다. 박테리아 세포를 포함하는 한천 비드의 세부 사항은 (A) 표시됩니다. 멸균 PBS를 사용하여 몇 개의 세척하여 광유를 제거한 후, 한천 비드 현탁액 F 준비또는 기관 내 주사 (B)로 쥐의 허파 접종은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭</a> . 3. 한천 구슬 마우스 도전 윤리 성명 :이 프로토콜과 실험은 산 라파엘 과학 연구소의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침을 따르십시오. <ol><li> 한천 비즈 서스펜션에 CFU / ㎖의 수를 결정하기 위해 TSA 플레이트에 콜로니 형성 단위의 수 (CFU)를 계산합니다. 50 ㎕의 1 ~ 2 × 10 6의 최적 접종 도달하는 2 ~ 4 × 10 7 CFU / ml로 멸균 PBS로 한천 구슬을 희석. </li><li> C57Bl/6NCr에게 (6-8 주령 20~22g) 0.002 ㎖ / g 체중의 볼륨 관리 0.9 % 염화나트륨의 케타민 (50 ㎎ / ㎖) 및 자일 라진 (5 ㎎ / ㎖)와 수컷 마우스를 마취 복강 내 주사. 참고 : 마취는 adeq 간주됩니다uate 동물이 조용히 계속 유지하면, 외부 자극에 응답하지 않는, 일정한 심장과 호흡 속도를 가지고 있습니다. </li><li> 앙와위에서 마우스를 놓습니다. 70 % 에탄올로 마우스의 코트를 소독. </li><li> 피부의 수직 절단하여 기관을 노출하고 기관에 아래로 이동하는 동안 stylette을 제거하기 위해 관심을 유지, 살균, 유연한 22 G 0.9 mm X 25mm의 IV 카테터와 기관을 삽관. 너무 깊은 기관에 카테터를 삽입합니다. 융기 (분기점)에 도달하기 전에 중지합니다. </li><li> 즉시 1 ML의 주사기에 의해 한천 구슬 현탁액 50 μL의 볼륨을 가지고 카테터에 연결합니다. 부드럽게 구슬이 폐에 이식 할 수 있도록, 주사기의 플런저를 밀어 넣습니다. 봉합 클립을 사용하여 절개를 닫습니다. </li><li> 잠에서 깨어 때까지 가열 패드에 동물을 배치합니다. </li></ol> 4. 쥐 평가 <ol><li> 코트 품질, 자세 등의 임상 증상 매일 쥐를 관찰,보행 및 수화 상태. 매일 체중을 모니터링합니다. ≥ 20 %의 체중을 잃게 마우스는 안락사해야합니다. </li><li> 기관지 세척액 (BAL)과 폐의 수집 및 총 CFU의 분석, 조직 학적 분석, BAL, 사이토 카인 분석의 전체 및 차등 세포 수의 측면에서 염증 반응 및 포인트 6 또는 7의 수집을 위해 포인트 5에 따라 폐장 내 myeloperoxidase (MPO) 활동. </li></ol> 5. BAL 유체 수집 및 분석 <ol><li> CO 2 흡입 쥐를 안락사. </li><li> 앙와위에서 마우스를 놓습니다. 70 % 에탄올로 마우스의 코트를 소독. </li><li> 피부의 수직 컷으로 기관과 흉곽을 노출합니다. 다이어프램을 절단하여 폐를 노출합니다. </li><li> 핀셋을 사용하여 기관에서 봉합 나사를 삽입하고 멸균, 유연한 22g 0.9 mm X 25mm의 IV 카테터와 기관을 삽관. CA를 바인딩 할 봉합 실의 두 끝을 당겨기관에 theter 및 기관의 주위에 실을 매듭. </li><li> 1 ML의 주사기를 사용하여 RPMI 1640 1 ㎖의 볼륨을 가지고 카테터에 연결합니다. 폐를 씻어 낸 후 액체를 복구, 15 ML 튜브에 저장하기 위해 주사기의 플런저를 밀어 넣습니다. 참고 : 사이토 카인 분석 할 경우, RPMI 1640 프로테아제 억제제를 추가합니다. </li><li> RPMI 3 ㎖의 총이 과정을 세 번 반복합니다. 지금부터, 얼음 BAL 액을 저장합니다. 폐의 수집 및 분석을위한 6 단계로 이동합니다. 참고 : 모든 액체가 (2.8 ㎖의 최대) 검색됩니다주의하시기 바랍니다. </li><li> BAL 액에 존재하는 박테리아의 부량, 작은 나누어지는 (300 μl를) 샘플, 직렬 TSA 판에, 멸균 PBS에서 판을 1:10로 희석 밤새 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> Burker 세포 수 실 Tuerk 솔루션 BAL 유체 1:2 나누어지는 희석 거꾸로 빛을 광학 현미경을 사용하여 전체 세포를 계산합니다. </li><li> R을 원심 분리기4 ℃에서 8 분 330 XG에서 BAL 액을 emaining -80 ° C.에 그것을 저장, ELISA 사이토 카인 분석을위한 상층 액을 cytospin에 의해 차등 세포 수에 대한 5.10-5.13 단계를 따릅니다. </li><li> 펠릿이 빨간색 인 경우, RBC의 용해 버퍼의 250-300 μL에 펠렛을 재현 탁 적혈구가 3 분 동안 초순수 증류수에 1:10으로 희석 용해. 4 ℃에서 8 분 330 XG에 2 ㎖ PBS와 원심 분리기으로 중화 </li><li> 상등액을 버리고 RPMI 10 % 소 태아 혈청 (FBS)에서 펠렛을 재현 탁. 총 세포 수에 따라 1 × 10 6 세포 / ml을 제공하는 볼륨을 사용합니다. </li><li> cytospin의 중심을 향하도록 종이 필터를 cytospin에 해당 슬롯에 현미경 슬라이드 및 필터를 놓습니다. 5 분 300 XG에 cytocentrifuge의 cytospin 원심 분리기의 적절한 우물에 각 시료 150 μl를 피펫. </li><li> 엄마에 따르면, Romanowsky 상용 키트를 사용하여 염색하여 슬라이드를 얼룩nufacturer의 지시 이전 12 설명 된대로. 단계 MPO 활동 분석을위한 5.14-5.17을 따르십시오. </li><li> 4 ℃에서 5 분 380 XG에서 BAL의 남은 양을 원심 분리기 뜨는을 취소하고 세포를 용해하는 초 고순도 증류수 헥사 클로라이드 0.5 %의 250 μL에 펠렛을 재현 탁. 서스펜션은 분석을 수행하기 전에 몇 일 동안 -20 ° C에서 얼 수있다. </li><li> 30 4 ° C에서 최소 및 샘플도 적절한 희석, 잘 경우 필요에 각각 중복에서 샘플을 추가, 96 - 웰 플레이트에 MPO 분석을 수행하는 상층 액을 사용하여 16,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 우물의 각 샘플에 추가 3,3 동량 &#39;, 5,5&#39;퍼 옥시다아제에 대한 기질로서 - 테트라 메틸 벤지딘 (TMB). 컬러에 대한 발전이 없을 때까지 반응이 적어도 5 분 동안 어두운 데에서 일어날 수 있도록 허용하고. </li><li> 이 MH 2 SO 4를 첨가하여 반응을 정지ND 450 nm에서 OD를 측정합니다. OD 값은 퍼 옥시 다제 활성에 직접적으로 비례한다. </li></ol> 6. 폐 및 사이토 카인 분석에 세균 부하 측정 <ol><li> 즉시 BAL 유체 수집 한 후, 마우스에서 소비세 폐,,, 멸균 PBS에 별도의 엽 (叶)을 헹구어 멸균 PBS의 2 ㎖의 둥근 바닥 튜브에 넣어 얼음에 저장합니다. 주 : 사이토킨 분석 할 경우에, 튜브를 PBS로 프로테아제 억제제를 추가한다. </li><li> 무균 폐를 균질화, 균질에서 작은 나누어지는 (300 μL)를 가지고, 직렬 TSA 판에, PBS 접시 1:10 희석 밤새 37 ° C에서 알을 품다. 총기도 세균 부하가 BAL 액과 폐에서 발견 된 CFUs의 합이되므로주의하시기 바랍니다. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 16,000 XG에서 나머지 균질를 원심 분리기 -80 ° C에서 ELISA 사이토 카인 분석을위한 뜨는 및 저장을 </li></ol> 7. 조직 학적 검사 &lt;올&gt; <li> 폐의 양상과 특성을 유지하기 위해, 단지 BAL 유체가 수집되고 있지 않은 폐의 조직 학적 분석을 수행합니다. </li><li> CO 2 흡입하여 마우스를 안락사. </li><li> 피부의 수직 절단하여 흉곽을 노출, 조리개를 절단하여 폐를 노출합니다. </li><li> 소비세 폐, PBS에 헹구어 엽 (叶)을 분리, 빛으로부터 보호 4 ° C에서 5 ~ 10 ㎖의 10 % 중성 포르말린 (4 % 포름 알데히드) 및 저장을 포함하는 튜브에 넣어. </li><li> 표준 절차를 사용하여 파라핀에 포함 된 폐. </li><li> 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 부분을 잘라. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색하고 슬라이드 표준 절차에 따라, 커버 슬립으로 슬라이드 커버. </li><li> 거꾸로 명 시야 현미경을 사용하여 슬라이드를 검사하고 카메라에 현미경을 연결하여 이미지를 획득. </li></ol>

<ol>
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Immunol. 186, 5425-5534 .</li><li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment.">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, .</li><li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells,+their+cytokines+and+mediators.">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. 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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

P.에있는 중요한 단계 녹농균 비즈 준비 및 마우스 문제는 아래에보고됩니다. 마우스 도전에 사용되는 녹농균 변형이 중요합니다. 사망, 만성 감염 또는 통관 도전에 사용되는 균주에 따라 크게 다를 수 있습니다. P. 그것은 비교적 낮은 사망률, 더 심한 병변, 높은 만성 감염의 결과 때문에 녹농균 RP73 임상 균주 PAO1 참조 실험실 변형 선호했?...

낭포 성 섬유증 (CF)는 낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR) 유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 유전 질환이다. 이 유전자는 대부분의 상피 세포의 세포막에 발현 클로라이드 채널 인코딩한다. 기관지 확장증, 점액 플러그 및 실질 파괴는 점진적으로 심각한 폐병과 CF 환자 1의 대부분의 사망으로 이어질 녹농균 감염에 의해 주로 일으키는 원인이되었다. 이해 CF의 발병 기전과 새로운 치료법의 발전은 CF의 특징적인 기능을 동물 모델에 의존하고 있습니다. 유전자 CFTR 유전자에 대해 수정 몇몇 마우스는 생성되었지만, CF와 같은 폐 질환과 CF의 환자에서 본 여러 가지 다른 장기의 이상을 요점을 되풀이하는이 종의 능력에 한계가 널리 2 문서화되었습니다. 감염의 개발은 CF의 동물 모델에서 가장 중요한 문제 중 하나입니다. 문학 CL이른 쥐가 이러한 한천, 아가로 오스, 또는 해조류 알긴산 3-5로 고정 화제에 매립 균을 접종 한 경우에만 한 달 이상 지속되는 만성 감염이 달성 될 수 있다는 것을 시사한다. These 고정화 제제 박테리아 마찬가지로 CF 환자 6의 점액 성장에, microcolonies 형태 성장에 허용 호기성 / 혐기성 상태 제공. 만성 감염이 모델은기도 염증 손상 7을 일으키는 원인이되는 폐의 박테리아의 지속성에 이르게한다. 그러나, 사용 된 방법, 균주 및 폐 식균 복용량에 따라 서로 다른 시점에서 폐에서 회수 만성 감염된 마우스의 백분율 및 세균 부하는 상당히 다를 수있다. 특히, 장기 만성 감염의 주요 과제는 P.에 의해 낮은 세균 부담이 남아있다 녹농균 및 공격 후 감염된 쥐 주 동안의 낮은 비율을 나타내는 그쪽으로T 박테리아 세포는 점차적으로 호스트에 의해 삭제됩니다. P.를 선택함에 CF의 수집에서 녹농균 RP73 임상 균주는 우리가 성공적으로 C57Bl/6NCrl 쥐 한 달 안정적인 세균 부하쪽으로 낮은 사망률, 더 심한 병변, 만성 감염의 높은 비율을 얻은 8 분리합니다. 본 논문에서는 P.를 포함에 대한 방법을 자세히 설명 한천 구슬 녹농균, 우리는, 기관 내 점적으로 쥐를 감염 폐에 세균 하중과 사이토 카인을 측정, BAL 유체를 수집하고 조직 학적 검사를 수행했습니다. 전반적으로,이 프로토콜은 병인의 8,9에 근본적으로 중요한 문제를 해결하고 P.에 대한 새로운 치료법을 테스트하는 연구자 도움이됩니다 녹농균 만성 감염 10, 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Bacto Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">211823</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Difco Agar, granulated</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">214510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Heavy mineral oil</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">330760-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">S-(+)-Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">K1884</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">X1251</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">1 ml syringe 25 G 5/8&#39;&#39;&#160;0.5 x 16 mm</td>
			<td style="width:191px;">PIC</td>
			<td style="width:143px;">3071250300350</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Catheter 22GA 0.9 x 25 mm</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">381223</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">11152-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Scissors, Iris, 11 cm, straight</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:143px;">501758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture clips</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">12040-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture thread</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">18020-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:143px;">11836145001</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">Fast-Read 102 Burker disposable chamber</td>
			<td style="width:191px;">Biosigma</td>
			<td style="width:143px;">390497</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Tuerk solution</td>
			<td style="width:191px;">Fluka</td>
			<td style="width:143px;">93770</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RBC lysis buffer</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:143px;">420301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">DE14-801F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">EZ cytofunnel</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78710021</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost ultra plus microscope slides</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">J3800AMNZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Diff-Quik Romanowsky staining set</td>
			<td style="width:191px;">Medion Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">130832</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Hexadecyltrimethylammonium chloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">52366-10G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">96-well EIA/RIA plate</td>
			<td style="width:191px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">3590</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;- tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">T8665-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">320501-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">10% neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-01005Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Harris haematoxylin non Papanicolau</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M06004</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Eosin plus alcoholic solution</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M11007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Shaking incubator</td>
			<td style="width:191px;">Amerex Instruments</td>
			<td style="width:143px;">Steady Shake 757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Water bath</td>
			<td style="width:191px;">Grant</td>
			<td style="width:143px;">SUB14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Precision balance</td>
			<td style="width:191px;">KERN</td>
			<td style="width:143px;">440-47N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Low Cost Heating Pad</td>
			<td style="width:191px;">2biol</td>
			<td style="width:143px;">LCHP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:272px;">Homogenization probe</td>
			<td rowspan="2" style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;">2366931(great)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:143px;">2366925(small)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Inverted optical microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axioplan2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Camera (microscope)</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axiocam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Rotary microtome</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">RM2255</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice

모델 자체에 관한 관심의 개수가 있지만 만성기도 감염의 마우스 모델은 낭포 성 섬유증 (CF)의 연구에서 중요한 자산이다. 단지 소수의보고가 생체 내에서 장기간의 만성 감염에 집중 반면 염증과 감염의 초기 단계는 광범위하게, 녹농균 한천 비즈 마우스 모델을 이용하여 연구 하였다. 장기 만성 감염의 주요 과제는 P.에 의해 낮은 세균 부담이 남아있다 녹농균이라는 박테리아 세포가 점진적으로 호스트에 의해 취소 된 것을 나타내는 공격 후 감염된 쥐 주의 낮은 비율. 이 논문은 생쥐에서 효율적으로 장기 만성 감염을 얻기위한 방법을 제시한다. 이 방법은 P.의 매립에 기초 C57Bl/6NCrl 마우스에서 기관 내 점적 한 다음 체외 한천 구슬 녹농균 임상 균주. 양측 폐 감염 SEV와 관련된체중 감소, 사망률, 만성 감염 및 염증 반응 등의 ERAL 측정 판독을. P. 그것은 비교적 낮은 사망률, 더 심한 병변, 높은 만성 감염의 결과 때문에 녹농균 RP73 임상 균주 PAO1 참조 실험실 변형 선호했다. P. 녹농균의 식민지 세 개월 이상 폐에 지속될 수 있습니다. 쥐의 폐 병리 고급 만성 폐 질환을 가진 CF 환자의 그것과 유사합니다. 이 뮤린 모델은 가장 밀접 인간 질병의 과정을 모방 및 병인에 대한 연구 및 신규 한 치료의 평가를 모두 사용할 수있다.

프로토콜은 P. 제대로 완료되면 녹농균 한천 - 구슬은 100 ~ 200 사이의 μm의를 측정하고 슬라이드에 한천 비즈 현탁액의 작은 볼륨을 피펫 팅에 의해 거꾸로 광학 현미경으로 관찰 할 수있다. 도 1에 상세히 도시 된 바와 같이 하나의 균체는, 한천 구슬에 표시됩니다. P.의 선택 한천 비즈 제조에 사용 루기 노자 균주가 중요하다.도 2...

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Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

우리는 마우스 모델에서 지속적인 장기 만성 녹농균기도 감염을 확립하는 한천 비즈 방법을 서술.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

22.2K 조회수.  San Raffaele Scientific Institute.  우리는 마우스 모델에서 지속적인 장기 만성 녹농균기도 감염을 확립하는 한천 비즈 방법을 서술. 

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

연구

면역학 및 감염병학

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

슈도모나스 녹농균의 작은 식민지 변형의 문화와 알긴산의 정량화

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...