ברצוננו להודות על התמיכה הכלכלית של מרכז הלגיון הבריטי המלכותי ללימודי פגיעה הפיצוץ HA, מימון של המועצה למחקר רפואי (M01858X/1) היפרפלזיה מולדת של האדרנל.

1. תרבית תאים, הכנת הדוגמא <ol><li>קבל קו תאים מתאים (למשל, תאים papilla עורי). 
	הערה: הפרוטוקול הנוכחי תוכנן עבור תאים חסיד, עם עכברוש papilla עורי fibroblasts מבודד vibrissae שימשה כמודל.</li>
	<li>התרבות התאים בקבוקון T-75 המכילים מינימום חיוניות בינונית (מאמ) α בתוספת סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין סטרפטומיצין. לשמור את התאים תנאים סטנדרטיים תרבות של 37 ° C ו- 5% CO 2 בסביבה humidified עד שיגיעו למפגש 80%.</li>
	<li>תשאף המדיום ולשטוף פעמיים בתאים Dulbecco &#39; s באגירה פוספט תמיסת (PBS). מביצועם תאים מן הבקבוק מאת המקננת בהם ב- 2 מ של טריפסין/EDTA על תקן התרבות תנאים 5 דק בקצרה בדוק כדי לוודא כי התאים יש לזהויות בהצלחה הבקבוקון באמצעות מיקרוסקופ אור/שלב ניגודיות (עם עדשה המטרה X 10 ).</li>
	<li>להוסיף 4 מ"ל של תרבות מדיום כדי לנטרל. את התגובה trypsinization. להעביר את המתלים תא שפופרת צנטרפוגה 15 mL-</li>
	<li>צנטריפוגה-200 x גרם במשך 4 דקות על גלולה התאים. לאט לאט וארוקן את תגובת שיקוע, מטפל לא לנתק את גלולה. מחדש להשעות את צניפה ב 5 מ ל בינונית.</li>
	<li>העברה של aliquot 20 µL של התליה תא hemocytometer נקי ולספור את התאים באמצעות מיקרוסקופ מצוידים עדשה המטרה X 10-</li>
	<li>להכין את התאים הפיצוץ על ידי הצבת שלוש מנות 35 מ מ בתוך תבשיל 90 מ מ. תווית אותם כראוי. להוסיף 2 מיליליטר בינוני כל מנה 35 מ מ, זרע סך של 5 x 10 תאים 4 לכל תבשיל, הפצת התאים באופן שווה סביב המנה. דגירה הדגימות ניסיוני ללון בתנאים תרבות רגיל כדי לאפשר תא נאותה מצורף לפני גל הלם החשיפה. 
	הערה: עבור הדמיה פלורסנט, תאים חייב להיות נזרע על coverslips זכוכית סטריליים דקה.</li>
</ol> 2. הלם צינור הרכבה <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg" /> איור 2 : EVOC מעטה והלם צינור הרכבה. (א) תמונה של המתקן EVOC. תיאור סכמטי של המנגנון צינור הלם (B). הלם צינור מידות כוללים של קוטר פנימי של 59 מ מ, אורך כולל, לרבות המתקן EVOC, של 4.13 מ'. אורך הצינור מונחה ועל הסכומים מעטה EVOC 2.71 מ' <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol><li>ללבוש נעלי עבודה הבוהן פלדה ומעיל מעבדה במהלך ההליכים הרכבה.</li>
	<li>הוספה פסי היישור שני דרך החורים בולט שני נמצא במישור האופקי של-והסתיר שקע. הנח גיליון אטם גומי nitrile מעל לקצה של פסי היישור כך שיישב בין מקורבות לשקע את המתקן התרבות (EVOC) איברים ex-vivo. 
	הערה: המתקן EVOC הוא אביזר אישית מעוצבת מיועד לשימוש עם צלחות פטרי 35 מ מ ( איור 2 א).</li>
	<li>לצרף המתקן EVOC והסתיר לשקע הצינור הלם על-ידי הזזת את הנורה על פסי היישור, ולהבטיח כי היא orientated כראוי כך המקטע המכיל הפטרי ממוקם בבסיסו.</li>
	<li>הוסף ארבע דסקיות ואומים רמינגטון M24 לתוך החורים הנותרים. מקם את האגוזים כך נוגעים והסתיר את.</li>
	<li>בצורה הדוקה הדקו הקונצפט ברצף בצורה סימטרית באלכסון בזמן בדיקת ויזואלית כי הצינור מעטה והלם EVOC בהצלחה התיישר.</li>
	<li>לצרף מתמר לחץ המתקן EVOC וחבר אותו למקור הנוכחי באמצעות כבל חיישן. לאחר מכן, באמצעות כבל BNC, להתחבר מקור הנוכחי אוסצילוסקופ.</li>
	ודא כי כל שחרור שסתומי וזרימה שולטת על המרקע הלם <li>סגורים. פתח קו מובנה חיצוני גז דחוס, לבטל באופן ידני את וסת הלחץ בכיוון השעון, כדי לחייב את ברז חשמלי כדי 2.5 אנחנו חיים</li>
	<li>פתח את שסתום בטיחות על הבקבוק גז דחוס על-ידי הפעלתו התרחקותו 180°.</li>
	<li>. תסתובב לאט את וסת הלחץ, ממוקם על הבקבוק גז, בכיוון השעון, כדי להגביר את הלחץ על 15 אנחנו חיים 
	הערה: מטרת הגדרה זו הרגולטור צריך מעט מעל הגבוה ביותר מתפוצץ הלחץ של הסרעפת העבה ביותר זה ייעשה הניסוי.</li>
	<li>להכין את דיאפרגמות על ידי חיתוך גיליון פלסטיק בעובי מ מ 0.125 לריבועים 10 ס"מ x 10 ס"מ. 
	הערה: העובי של הסרעפת לתאם עם הלחץ המתפרצת, שינוי הלחץ שיא של גל ההלם (קרי, בדיאפרגמה עבה יותר תגרום גל הלם עם לחץ שיא גדול יותר; טבלה 1).</li>
</ol> < שולחן fo:keep-together.within-דף = "1" > <tbody><tr><td>מיילר הסרעפת מידות (ס"מ)</td> <td>פרץ לחץ (בר)</td> <td>טווח הלחץ חיישן 3 (kPa)</td></tr> <tr><td>x 10 x 10 0.023</td> <td>2 ± 0.2</td> <td>47 ± 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.050</td> <td>4 ± 0.2</td> <td>72 ± 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.125</td> <td>9.5 ± 0.5</td> <td>127 ± 12.5</td></tr></tbody> < /t מסוגל > טבלה 1: פרץ הלחץ המתאים עובי הסרעפת, שיא הלחץ.
<ol start="11"> <li>צור ידיות מתוך הקלטת, לתקנם כדי העליון והתחתון של הסרעפת, ולהשתמש בהם למקם בזהירות הסרעפת ליד-והסתיר קטן קבלה על ידי תא עכוז. להבטיח כי הסרעפת היא ישר והוצבו כראוי לפני סגירת עכוז.</li>
	<li>לאבטח את באמצעות ארבעה רמינגטון M24 ואומים. בצורה הדוקה הדקו הקונצפט ברצף בצורה סימטרית באלכסון.</li>
</ol> 3. הכנה של תאים רגע לפני גל הלם החשיפה <ol><li>הכן תא רקמת למינארי על-ידי ביצוע עיקור אולטרה סגול. . לנקות את זה עם אתנול חיטוי פתרון ו- 70%. לאסוף את כל הפריטים הדרושים לצורך טיפול תאים מוקדמת כדי/פוסט-shock גל חשיפה ומניחים אותם בתוך המנוע סטרילי. 
	הערה: זה כולל בינוני טריים, קרום חדיר גז דבק, מספריים סטרילי, פיפטות, פיפטה טיפים.</li>
	<li>העברת 90 מ מ פטרי צלחת אחת המכילה שלוש ניסיוני דגימות החממה מכסה המנוע סטרילי.</li>
	<li>את החלק קרום חדיר גז דבק גיליון (ראה את הטבלה של חומרים) שישה ריבועים, כך כל אחד הוא גדול מספיק כדי לכסות את החלק העליון של 35 מ מ אחד פטרי.</li>
	<li>תשאף האמצעי 35 מ מ פטרי, למקם את המכסה לצד אחד, לכסות עם שני קטעים דבק ממברנות גז-חדיר, המבטיח כי יש חותם צר בין הקרום הקצה של המנה.</li>
	<li>להעביר את הדגימה המתקן EVOC ואבטח אותו לבסיס של הנורה, כך העליון של המנה מיושר עם הבסיס הפנימי של הצינור הלם.</li>
</ol> 4. הלם צינור מבצע <ol><li>לובש מגיני אוזניים, העין משקפי מגן, נעלי בטיחות, מעיל מעבדה מתאים לחץ מערכת הרכבת התחתית הלם.</li>
	<li>סובב את כפתור בקרת זרימה על הרגולטורים בכיוון השעון, ומאפשר גז לזרום לתוך הצינור גמיש חיבור את הצילינדר באוויר דחוס ברכבת התחתית הלם.</li>
	<li>בחלק התחתון של החלונית ' בקרה ', בחר &#34; עכוז כפול &#34; כניסת עבור wav משך קצר הלםe או &#34; Tube התקן &#34; כניסת עבור משך הגל מוגבר.</li>
	<li>מתג על מקור כוח DC, אוסצילוסקופ לרכוש את הנתונים waveform. הגדרת קצב הדגימה אוסצילוסקופ 50.0 MS/s, עם אורך הרשומה של 1 מ' נקודות. הגדר טווח 50 mV עבור ירי בבר 2 ו- 100 mV עבור מעל 4 אנחנו חיים</li>
	<li>להדליק את האורות בטיחות שימוש בבורר על הקיר שמול הבקרה. 
	הערה: זה אומר חוקרים אחרים לא להכנס לחדר בעת טעינת הצינור הלם.</li>
	<li>להפעיל את המתג על תיבת בקרת ברז חשמלי כדי לסגור את ברז חשמלי. 
	הערה: תכונה זו בטיחות נסגר שסתום ממוקם על החדר עכוז כפול, המאפשר למערכת להיות טעונה.</li>
	<li>על לוח הבקרה, לאט פתח את בקרת הזרימה על-ידי הפעלת הידית נגד כיוון השעון כדי להגדיל בהדרגה את הלחץ בתוך החדר דחיסה. לפקח על הלחץ שימוש בתצוגת לוח הבקרה.</li>
	<li>ברגע הסרעפת פרץ לחץ מתמלאת, הסרעפת יתבקע ו a &#34; באנג &#34; תשמע. לסגור במהירות את בקרת הזרימה על-ידי הפעלת הידית. 
	הערה: גל ההלם ייסעו דרך צינור על המדגם תא, החוצה את קצה הצינורית.</li>
	<li>לפתוח את ברז חשמלי על-ידי ביטול הבורר על הקופסא פקד סולנואיד, כבה את האור בטיחות (באמצעות הבורר על הקיר שמול לוח הבקרה).</li>
	<li>להעביר את הדגימה תא מכסה המנוע סטרילי, להסיר את הקרומים גז-חדיר דבק ולאחר למלא קערה עם 2 מ של מדיום הגידול טריים. התאים שניתן להשתמש מיד להערכה, כפי שמתואר בשלב 5 או חזר החממה ללימודי וקהילותיהם.</li>
</ol> 5. תא הכדאיות <ol><li>להעריך תא הכדאיות בעקבות חשיפה גל הלם באמצעות שילוב assay מחוון של חמצון-חיזור עם פלורסנט ההדמיה של תאים חיים וגם מתים. 
	הערה: עבור הדמיה פלורסנט, תאים חייב להיות נזרע על coverslips זכוכית סטריליים דקה במהלך פרק 1: תא הכנה תרבות, לדוגמה. ניתן להציב בתוך צלחות פטרי 35 מ מ.</li>
	<li>µL 200 העברה מהתרכובת indictor חמצון-חיזור (ראה את הטבלה של חומרים) לכל מאכל ניסיוני ישירות לאחר מילוי אותם עם 2 מ"ל של הלם שלאחר בינוני גל חשיפה. דגירה-תרבות רגיל תנאים 4 h.</li>
	<li>על כל מנה, להעביר (בשכונה סטרילי כהה) 2 x 100 µL aliquots או שחור או לנקות צלחת 96-ובכן, תלוי אם זריחה או ספיגת ישמש להערכת הכדאיות.</li>
	<li>להעביר את הצלחת 96-ובכן בקורא צלחות מתאימות מצויד המסננים הנכון ולקרוא באמצעות עירור להקות 530ex/590em עבור זריחה או 570 nm בשילוב עם הפניה 600 ננומטר על ספיגת. לייצא ולשמור את הנתונים.</li>
	<li>לנתח את הנתונים כדי לזהות הבדל כלשהו בין דגימות החשופים גל הלם ופקדי שאינו חשוף, כמו זה יכול להצביע על ירידה ב תא הכדאיות. 
	הערה: פקד שלילי גם להיכלל הנבחנים. יתר על כן, האינטרפולציה של עיקול רגיל יכול לשמש כדי לחשב את מספרי הטלפון הנייד.</li>
	<li>תשאף המדיום המכיל הכימית מחוון חמצון-חיזור. להחליף אותו עם 2 מיליליטר בינוני טריים, דגירה התאים-תנאים סטנדרטיים תרבות 24h.</li>
	<li>חזור על השלבים שלעיל לפי הצורך כדי לקבל נקודת הזמן הכדאיות השני.</li>
	<li>עבור ההדמיה פלורסנט של תאים מתים וחיים, תשאף המדיום ולשטוף פעמיים בתאים 1 מ"ל ל- PBS. העברת 100 µL מהתרכובת מלאה נמצאו ההדמיה קיט (ראה את הטבלה של חומרים) כדי שכל דוגמית, דגירה בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור במשך 15 דקות</li>
	<li>תשאף הכימית ולשטוף לאחר שימוש 1 מ"ל ל- PBS. בעזרת מלקחיים הצבע בסדר, בזהירות להסיר את coverslip של המנה 35 מ מ ומניחים אותו, פנים כלפי מטה על זכוכית מיקרוסקופ.</li>
	<li>ידרשו תמונות עבור כל דגימה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (המטרה 10x עדשה, 0.50 מפתח נומרי) מצוידים עם המסננים עירור, פליטה (ex / em 488 ננומטר/515 nm ו 570 nm nm/602). 
	הערה: תאים חיים פולט קרינה פלואורסצנטית אינטנסיבי, אחיד, ירוק. תאים מת או גוסס עם הממברנה התאית נפגעת תהיה ספיגת הרכיב ערכת מת, וכתוצאה מכך פליטת פלואורסצנטי אדום, נמצא בעיקר באזור גרעיני התא.</li>
	<li>השתמש וניתוח תמונות תוכנה גם באופן ידני או אוטומטי לספור את מספר תאים מתים וחיים של כל תמונה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+explosion+and+blast+injury+processes.">The physical basis of explosion and blast injury processes.</a> J R Army Med Corps. 159, 4-9 (2013).</li><li>Born, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Trauma:+The+Fourth+Weapon+of+Mass+Destruction.">Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction.</a> Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).</li><li>Kocsis, J. D., Tessler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+blast-related+brain+injury.">Pathology of blast-related brain injury.</a> J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).</li><li>Bass, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Injuries+from+Blast.">Brain Injuries from Blast.</a> Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).</li><li>Cernak, I., Kobeissy, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Neurotrauma:+Molecular,+Neuropsychological,+and+Rehabilitation+Aspects.">Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects.</a> Frontiers in Neuroengineering. , (2015).</li><li>Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+injuries+and+heterotopic+ossification.">Blast injuries and heterotopic ossification.</a> Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).</li><li>Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Ossification+Following+Traumatic+and+Combat-Related+Amputations.+Prevalence,+Risk+Factors,+and+Preliminary+Results+of+Excision.">Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision.</a> J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).</li><li>Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Lung+Injury.">Blast Lung Injury.</a> Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Hearing+Loss+after+Blast+Injury+to+the+Ear.">Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear.</a> PLoS ONE. 8 (7), 67618 (2013).</li><li>Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , (2016).</li><li>Arun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+blast+traumatic+brain+injury+using+in-vitro+model+with+shock+tube.">Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube.</a> Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).</li><li>Ahlers, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+effects+of+acute+and+repeated+exposure+to+blast+overpressure+in+rodents:+toward+a+greater+understanding+of+blast+and+the+potential+ramifications+for+injury+in+humans+exposed+to+blast.">Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast.</a> Front Neurol. 3, 32 (2012).</li><li>Polfer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+rat+model+to+investigate+the+formation+of+blast-related+post-traumatic+heterotopic+ossification.">The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification.</a> Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).</li><li>Miller, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Blast+Overpressure+on+Neurons+and+Glial+Cells+in+Rat+Organotypic+Hippocampal+Slice+Cultures.">Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures.</a> Front Neurol. 6, 20 (2015).</li><li>Chandra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+blast+wave+profiles+in+simulated+air+blasts:+experiment+and+computational+modeling.">Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling.</a> Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).</li><li>Kuriakose, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+the+Blast+Exposure+Conditions+in+the+Shock+Tube+for+Generating+Pure,+Primary+Shock+Waves:+The+End+Plate+Facilitates+Elimination+of+Secondary+Loading+of+the+Specimen.">Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen.</a> PLoS ONE. 11 (9), 0161597 (2016).</li><li>Reneer, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Mode+Shock+Tube+for+Investigation+of+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).</li><li>VandeVord, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).</li><li>Kane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+cultured+microglia+in+response+to+simulated+blast+overpressure:+Possible+role+of+pulse+duration.">Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration.</a> Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).</li><li>Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impulsive+pressurization+of+neuronal+cells+for+traumatic+brain+injury+study.">Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+in+Rat+Hair+Follicles+following+Simulated+Blast+Insult:+A+New+Diagnostic+Tool+for+Traumatic+Brain+Injury.">Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury.</a> PLoS ONE. 9 (8), 104518 (2014).</li><li>Bo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+characterization+of+compression-induceddamage+in+live+biological+samples.">Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples.</a> AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).</li><li>Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+ossification+after+extremity+blast+amputation+in+a+Sprague-Dawley+rat+animal+model.">Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model.</a> J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Approaches+for+Studying+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).</li><li>Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+blast+wave+generation+in+a+shock+tube+for+biological+applications.">Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications.</a> JPCS. 500 (14), 142025 (2014).</li></ol>

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

פציעות העיקרי שהושג מחשיפה לאירועי הפיצוץ אינם עדיין לגמרי מובנים. זיהוי של הבנת המנגנונים שגורמים להופעת פציעות הנוצרות על-ידי הפיצוץ, כמו פגיעה מוחית טראומטית3,4 והתקשות הטרוטופי6,7, הם הצעדים הראשונים חשוב להתפתחות שיטות יעילות של טיפול מונע. על מנת להשיג מטרה זו, פותחו מספר מערכות ניסויות כדי לשכפל את הפיצוץ אירוע חשיפה11,12,13,14,18,19 . בטכניקה המתוארת כאן משתמש הלם צינור ציוד (איור 2) מסוגל לירות גלי הלם במגוון של לחצים לכל הגוף (קרי, מכרסם), רקמות או דגימות תאים. היכולת לטעון סוגי תאים בודדים ולא כל רקמות נותן את היכולת לנתח את התגובות הסלולר ברורים, כמו נזק יכול להתרחש במקביל באמצעות מגוון של מנגנונים1,2. לדוגמה, ליצור מודל טראומטי פגיעה מוחית, את ההערכה של סוגי תא בודד, כמו נוירונים האסטרוציטים, באפשרותך לאפשר לצורך זיהוי תאים ספציפיים פציעה. בנוסף, התגובה כולה-איבר יכול להיות מוערך באמצעות רקמת המוח. את סוגי תאים בודדים והן דגימות רקמה יש ערך, יכול לתת מידע שונה. זה גם אפשרי לשנות את כמות אוויר בלחץ כדי להפיק ההלם על-ידי בחירת לים כפול-עכוז או מנהל התקן-שפופרת. קובע את משך הזמן של גל ההלם. אפשרות אחרת היא לשנות את החומר הסרעפת ואת עובי לשנות את הלחץ שיא25.
גורם נוסף שיש לקחת בחשבון תופעות הפרעות קצה זה יכול להיות נוכח בעת הדיור המדגם הינו ממוקם ליד היציאה של הרכבת התחתית הלם, כגון אלה שנמצאו על האסדה EVOC המתוארות המערכת הנוכחית. צ'אנדרה. et al. הביט פרופילים גל ההדף שנמצאו במקומות שונים על צינור הלם מונחה דחיסה ומצא waveform פרידלנדר היה מיוצג בצורה הטובה ביותר במיקום עמוק בתוך ה-tube הלם15. . Kuriakose et al. גם למד משני הטעינה של המדגם ומצא כי הצבת צלחת סוף בסוף הצינור הלם היה מסוגל לחסל גלים משתקף לא רצויים16. בהתחשב בנתונים נמצאו אלה15,פרסומים16, שינויים בעתיד על מנת לשפר את מערכת הרכבת התחתית הלם המתוארות במאמר זה יכול לכלול את המיקום של המתקן EVOC במיקום עמוק יותר בתוך הצינור מונע או, לחלופין, ההכללה של צלחת סוף ברכבת התחתית הלם. מגבלות של השיטה המתוארת עשוי לכלול את התפוקה נמוכה יחסית של דגימות. משתמש בודד יכול לפעול הצינור הלם בבטחה על פלט של סביב 6-8 דגימות לשעה. כיום, המערכת מיועדת סביב השימוש יחיד 35 מ מ פטרי. לכן, ניסויים גדול המכיל מספר קבוצות ומשוכפלת ביולוגי יכול להיות קשה להשיג.
מאמר זה שיטות מראה איך הכדאיות של תאים חסיד papilla עורי היה מושפע על ידי חשיפה גל הלם יחיד. גל הלם משך קצר (&#60; 10 ms) של ≤72 kPa לא השפיע על הכדאיות בהשוואה הפקד (איור 3 ו- 4 באיור). לעומת זאת, גל הלם ב kPa-127 גירוי ירידה משמעותית הכדאיות ב 24 שעות שלאחר הפיצוץ, כפי שמוצג על ידי חמצון-חיזור מחוון assay (איור 3) והן ניתוח תמונות פלורסנט (איור 4). . מילר ואח דיווחו ירידה דומה תא הכדאיות בתרבויות בהיפוקמפוס פרוסה של עכברוש organotypic כאשר תאים נחשפו גם 147 kPa או גל הלם 278 kPa באמצעות שפופרת של שוק פתוח, מונחה הליום14. לעומת זאת, VandeVord. ואח דיווחו כי שם אין השפעה על יכולת הקיום של עכברוש האסטרוציטים נחשפים הלחץ משך קצר של &#62; 200 kPa, למרות barochamber שימש במקום שפופרת הלם18. יצוין, כי הלחץ החיצוני הוא מסתמך על גל ההדף, למרות זו יוצרת גלי הלחץ מורכבות בתוך הגוף, ולכן עושה הטבע ההעמסה תלויות במידה רבה על התכונות המכאניות של רקמות או התא. מחקרים נוספים אפיון של התגובה התאית לאירועים הפיצוץ נדרש. יתר על כן, על-ידי הערכת חשיפה גל הלם ברמה התאית, כפי שמוצג בטכניקה זו, תגובות ביולוגיות מופעלות מהפציעה, כגון ההפרעות של איתות המסלולים או שינויים epigenetic, יכול להיות מזוהה, בטיולי.
לסיכום, עבודה זו מתארת את השימוש צינור נירוסטה הלם מעטה EVOC ששונה כדי לשלב התא הראשי תרבויות. גלי הלם במגוון של לחצים יכול להיות שנוצר, הם מופצים על תאים חיים כדי לשכפל את תופעות המתרחשות מחשיפה גל הדף. פרוטוקול זה מדגים כיצד להעריך את הכדאיות התא, אך גם ניתן יהיה ללמוד שינויים וקהילותיהם סוגי תאים בודדים. הולך קדימה, אנו מתכננים להעריך את האפקטים דיפרנציאל מורכבות גלי הלם יכול להפיק סוגי תאים שונים, במטרה לקדם את ההבנה שלנו של הפיצוץ-induced פציעות העיקרי.

עם המגמה האחרונה לקראת שימוש מטעני חבלה לוחמה מודרנית ובפעולות טרור על אזרחים, הבנת ההשפעות של אירועים נפץ על גוף האדם הוא בעל חשיבות רבה. פציעות שהושג באמצעות חשיפה לאירועים הפיצוץ יכול להיות קטלני קטלני, עם תהליכים פיזיים של פגיעה מחולק לארבע קטגוריות. ראשי פציעות כתוצאה מחשיפה ישירה גל ההדף, אשר אינטראקציה באופן מקומי עם הגוף באופן compressive, לאחר מכן ולקיבולת, גורם השיבוש של ממברנות, רקמות רכות1. פציעות משניות לכלול פגיעת או פצעי חדירה שנגרמו על ידי פגיעה בחפצים נמוך-המונית מונעות במהירות גבוהה על-ידי גל ההדף. פציעות שלישוני להתרחש כאשר גל ההדף יש אנרגיה מספקת כדי לזרוק חפצים של מסה גבוהה או יחידים מפני חפצים. לבסוף, פציעות הפיצוץ רבעוני מוגדרים על-ידי אחרים פציעות שונות אשר אינם מתאימים לקטגוריות האחרות, כגון כוויות פלאש2. בעקבות החשיפה לאירועים שכאלה הפיצוץ, פציעות ראשי כוללים4,3,פגיעה מוחית טראומטית5, התקשות הטרוטופי6,7, הפיצוץ ריאות פציעה8, אובדן שמיעה 9ועוד10.
Waveform בדרך כלל התצפיות מאירועים הפיצוץ הוא גל פרידלנדר, המייצג פיצוץ שדה חינם, להבדיל בחלל סגור. Waveform מורכב חזית הפיצוץ זה יכולה להיות מוגדרת כ עלייה חדה ומהירה בלחץ חיובי. זה ומיד אחריו על ידי רוח משב אוויר נע במהירות גבוהה, גל שחרור אשר מפחית את הלחץ מתחת רמות אטמוספרי. ואקום חלקי נשאר ליד אזור הפיצוץ הראשוני, דבר המתבטא זרם אחורי איטית של אוויר. שלבי חיוביים ושליליים של הגל (איור 1 א') לגרום לתנועת שכיבות למשוך גל ההדף1. כדי לסייע להבהיר את המנגנונים מאחורי פיצוץ ראשי פציעות, נוצרו גרסאות ניסיוניות לייצר ואת, כמו הגל פרידלנדר, אשר תאים ורקמות יעמדו בפני כאשר נחשף אירוע פיצוץ אמיתי. המערכות הקיימות המפורטים בספרות כוללים הלם צינורות11,12,13,14,15,16,17, 18,barochambers19בר קולסקי20, סימולטורים מתקדמים הפיצוץ21, פיצול Hopkinson לחץ בר22, הבילוי של אירועים אלטרנטיביים הפיצוץ בעזרת סביבה מבוקרת pentaerythritol tetranitrate23. למרות המגוון הרחב של הדגמים, משתנים רבים להשפיע על הפגיעה המתקבל גלי ההדף, כולל הלחץ טרום שהוחלה, ואת התכונות המכאניות של, סוגי תאים בודדים או רקמות תחת הערכה24. בעוד המחקר של הרקמות או האיברים יכולה לשפוך אור על רקמות דפורמציה ושינויים מורפולוגיים ברוטו נגרם בעקבות הפיצוץ אירועים, ניתוח ברמה התאית יכול לחשוף שינויים epigenetic תעתיק מושפע גל ההלם.
במאמר זה-שיטות טכניקה להפיץ גלי הלם במגוון של לחצים על תאים חיים טפט. דבר זה מאפשר אפיון הכדאיות תא, שחקרתי ספי נזק פוטנציאלי של גלי הלם מיידית. יתר על כן, התאים קיימא שאפשר יהיה להחזיר את התנאים תרבות רגיל, השפעות ביולוגיות לטווח ארוך מן האירוע הפיצוץ יכול להיות מוערך. להלן הפרוטוקול מתאר שתי טכניקות הכדאיות התא יכול לשמש בתאי בתרבות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig1.jpg"> 
איור 1: קירוב של גל פרידלנדר. (א) הערכה של גל פרידלנדר נצפו על חיישן 3 ברכבת התחתית הלם. (B) נציג נתונים מציג את הפרופילים לחץ שונות נצפו על חיישנים 1, 2 ו- 3 על המרקע הלם. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table><tbody><tr><td>MEM &amp;alpha;, nucleosides</td><td>ThermoFisher</td><td>22571020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Supplement to create complete growth media.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>15070-063</td><td>Supplement to create complete growth media.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Dilute 1 in 10 before use.</td></tr><tr><td>CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented</td><td>Starlab</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish (PS) 35 mm, 8.5 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Triple Red</td><td>TCD010035</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (PS) 90 x 14.2 mm no vent</td><td>VWR UK</td><td>391-0453&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gas Permeable Adhesive Plate Seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Alamarblue cell viability reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>13494309</td><td></td></tr><tr><td>Virkon tablets</td><td>VWR UK</td><td>115-0020</td><td>Use to create 2% solution as viability control reagent.</td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>SurgicalTools</td><td>11295-10</td><td>Use to remove coverslips from petri dish.</td></tr><tr><td>Cover glass, square</td><td>VWR UK</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR UK</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>96 Well plate, solid black</td><td>AppletonWoods</td><td>CC760</td><td>Plate to be used for fluorescence measurements.</td></tr><tr><td>96 Well plate, clear, (PS)</td><td>VWR UK</td><td>734-1799</td><td>Plate to be used for absorbance measurments.</td></tr><tr><td>Leica DMi1 Camera stand outfit</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Optical microscope used for cell culture.</td></tr><tr><td>Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.</td></tr><tr><td>EnVision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010A</td><td>Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0782</td><td>Use to create shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.05 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0786</td><td>Use to creatw shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.125 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0798</td><td>Use to create shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Current source power unit</td><td>Dytran Intruments Inc.</td><td>4103C</td><td>Power source for 2300V1 sensor.</td></tr><tr><td>IEPE Pressure Sensor</td><td>Dytran Intruments Inc.</td><td>2300V1</td><td>Pressure sensor located on shock tube.</td></tr><tr><td>Digital Phosphor Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>DPO 4104B</td><td>Use to gather and save sensor 2300V1 data.</td></tr></tbody></table>

evaluating primary blast effects in vitro

חשיפה לאירועים הפיצוץ יכול לגרום טראומה קשה לאיברים חיוניים כגון הריאות, האוזניים, ו המוח. הבנת המנגנונים מאחורי פגיעות כאלה הנוצרות על-ידי הפיצוץ הוא בעל חשיבות רבה שוקל את המגמה האחרונה לקראת שימוש בחומרי נפץ לוחמה מודרנית, אירועים הקשורים לטרוריסטים. כדי להבין באופן מלא את הפיצוץ-induced פציעה, עלינו תחילה להיות מסוגלים לשכפל אירועים כאלה הפיצוץ בסביבה מבוקרת באמצעות שיטה ישימה. טכניקה זו באמצעות ציוד צינור הלם, גלי הלם במגוון של לחצים אותם ניתן להפיץ על תאים חיים גדלו ב 2D, סמנים של הכדאיות תא ניתן מיד לנתח שימוש assay מחוון של חמצון-חיזור, ההדמיה פלורסנט של תאים מתים וחיים. שיטה זו הוכיחה כי הגדלת את הלחץ הפיצוץ שיא ל 127 kPa יכול לעורר ירידה משמעותית בתוך התא הכדאיות בהשוואה פקדים ללא טיפול. הבדיקה דוגמאות אינם מוגבלים תאים חסיד, אך יכול לכלול תא המתלים, לכל הגוף ודגימת רקמות, דרך שינויים מזעריים הגדרת צינור הלם. משכפל את התנאים המדויקים רקמות ותאים להיתקל כאשר נחשף אירוע פיצוץ אמיתי קשה. טכניקות כגון האחד שהוצגו במאמר זה יכול לעזור להגדיר מיכסות נזק ולזהות את השינויים גנים ברמת השעתוק והתרגום epigenetic בתוך תאי הנובעות מחשיפה גל הלם.

באמצעות השיטה המתוארת לעיל, תאים גדל של טפט נחשפו שהפקידים על גלי הלם שנוצר באמצעות צינור הלם (איור 2B). סמנים של הכדאיות תא היו העריכו. שימוש assay מחוון של חמצון-חיזור, התברר כי היישום של גל הלם 127 kPa היה מסוגל להקטין משמעותית את הכדאיות של תאים papilla עורי לעומת שולט לאחר 24 שעות בתרבות (איור 3). היישום של kPa ≤72 גל הלם לא להפחית הכדאיות. כדי לתמוך תצפיות אלה, התמונה פלורסנט assay מסוגל fluorescently labelling תא חי או מת עם fluorophores ירוק או אדום, בהתאמה, היה בשימוש. כימות של תאים מתים וחיים מתמונות פלורסנט 13 לכל שכפול ביולוגי הפגינו ירידה תא הכדאיות אלה נחשפים גל ההלם 127 kPa בהשוואה הפקד (איור 4). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן השוואה מרובים של Tukey, עם p &#60; 0.05 השפעה משמעותית מבחינה סטטיסטית. גודל המדגם לכל קבוצה הסתכם בכ 9 עבור וזמינותו מחוון חמצון-חיזור ועוד 39 לניתוח הדמיה פלורסצנטיות כמותית.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig3.jpg"> 
איור 3 : חמצון-חיזור מחוון Assay הנתונים מציג מסלול הזמן של תא הכדאיות לאחר חשיפה גל הלם. באופן משמעותי פחות תאים נצפו לאחר 24 שעות ביממה, 127-kPa החשופים גל הלם בקבוצה בהשוואה הפקד אינו מטופל. הפקד שלילי כללה טיפול 30-s עם 2% חומר חיטוי (ראה טבלה של החומרים) הראה באופן משמעותי פחות תאים-T0 והן 24 שעות בהשוואה לקבוצות אחרות. כל עמודה מייצגת את סטיית התקן זאת אומרת ± 1 (SD); משכפל ביולוגי, N = 3; טכני משכפל, n = 3. = p &#60; 0.0001. * = p &#60; 0.05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig4.jpg"> 
איור 4 : זריחה הדמיה- (א) נתונים כמותיים שנאספו פלורסנט תמונות של תאים מתים וחיים שנלכדה באמצעות מיקרוסקופ זריחה ב- 24 שעות גל הלם שלאחר חשיפה. באופן משמעותי פחות התאים קיימא נצפתה של kPa 127 (מתכוון = 93.42) מדגם גל הלם חשופים בהשוואה של kPa 47 (מתכוון = 98.18), 72 kPa (מתכוון = 98.87), ולשלוט קבוצות (מתכוון = 99.10). לא התאים קיימא נצפו על קבוצת הביקורת השלילית לאחר 24 שעות (כלומר = 0). תמונות נציג קרינה פלואורסצנטית (B). ירוק מראה תאים חיים, בעוד האדום מראה תאים מתים. כל חלקה תיבת מראה את רביעונים העליון והתחתון עם שפם Tukey; משכפל ביולוגי, N = 3; טכני משכפל, n = 13. = p &#60; 0.0001. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Primary Blast Effects In Vitro at JoVE.com

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

הבנה כיצד מאופנן של תאים על ידי חשיפה גלי הלם יכול לעזור לזהות את המנגנונים מאחורי פציעות מופעלות מאירועים הפיצוץ. פרוטוקול זה משתמש הלם לפי הזמנה צינור ציוד להחלת גלי הלם במגוון של לחצים תא monolayers, כדי לזהות את ההשפעות עוקבות על הכדאיות תא.

בהערכת פגיעה עיקריים אפקטים במבחנה

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

evaluating-primary-blast-effects-in-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

7.9K Views.  Imperial College London. הבנה כיצד מאופנן של תאים על ידי חשיפה גלי הלם יכול לעזור לזהות את המנגנונים מאחורי פציעות מופעלות מאירועים הפיצוץ. פרוטוקול זה משתמש הלם לפי הזמנה צינור ציוד להחלת גלי הלם במגוון של לחצים תא monolayers, כדי לזהות את ההשפעות עוקבות על הכדאיות תא.

Video: Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Blast Quantification Using Hopkinson Pressure Bars

Near-field blast load measurement presents an issue to many sensor types as they must endure very aggressive environments and be able to measure pressures up to many hundreds of megapascals. In this respect the simplicity of the Hopkinson pressure bar has a major advantage in that while the measurement end of the Hopkinson bar can endure and be exposed to harsh conditions, the strain gauge mounted to the bar can be affixed some distance away. This allows protective housings to be utilized which protect the strain gauge but do not interfere with the measurement acquisition. The use of an array of pressure bars allows the pressure-time histories at discrete known points to be measured. This article also describes the interpolation routine used to derive pressure-time histories at un-instrumented locations on the plane of interest. Currently the technique has been used to measure loading from high explosives in free air and buried shallowly in various soils.

This protocol details the use of Hopkinson pressure bars to measure reflected blast loading from near-field explosive events. It is capable of interpolating a pressure-time history at any point on a reflective boundary and as such can be used to fully characterize the spatial and temporal variations in loading produced.

פיצוץ כימות באמצעות מוטות לחץ הופקינסון

Near-field blast load measurement presents an issue to many sensor types as they must endure very aggressive environments and be able to measure pressures ...

Engineering

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) in vitro exposure systems are often large and bulky, making transport to the field and operation at the source of emission or within the breathing zone difficult. Through miniaturization of these systems, the lab can be brought to the field, expediting processing time and providing a more appropriate exposure method that does not alter the aerosol prior to contacting the cells. The Portable In vitro Exposure Cassette (PIVEC) adapts a 37 mm filter cassette to allow for in vitro toxicity testing outside of a traditional laboratory setting. The PIVEC was characterized using three sizes of copper nanoparticles to determine deposition efficiency based on gravimetric and particle number concentration analysis. Initial cytotoxicity experiments were performed with exposed lung cells to determine the ability of the system to deposit particles while maintaining cell viability. The PIVEC provides a similar or increased deposition efficiency when comparing to available perpendicular flow in vitro exposure devices. Despite the lower sample throughput, the small size gives some advantages to the current in vitro ALI exposure systems. These include the ability to be worn for personal monitoring, mobility from the laboratory to the source of emission, and the option to set-up multiple systems for spatial resolution while maintaining a lower user cost. The PIVEC is a system capable of collecting aerosols in the field and within the breathing zone onto an air-interfaced, in vitro model.

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Here, we present a protocol to perform portable cellular aerosol exposures and measure cellular response. The method uses cells, grown at the air-liquid interface, mimicking in vivo physiology. Cellular response to copper nanoparticle aerosols was observed as oxidative stress through reactive oxygen species generation and cytotoxicity as lactate dehydrogenase release.

חדש נייד במבחנה חשיפה קלטת לדיגום אירוסול

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Environment

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Medicine

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend on its ability to efficiently, timely, and faithfully recapitulate the sequences of blastocyst development (morphogenesis, specification, patterning), and to form cells reflecting the blastocyst stage. Here we show that na&#239;ve human pluripotent stem cells cultured in PXGL conditions and then triply inhibited for the Hippo, transforming growth factor- &#946;, and extracellular signal-regulated kinase pathways efficiently undergo morphogenesis to form blastoids (&gt;70%). Matching with developmental timing (~4 days), blastoids unroll the blastocyst sequence of specification by producing analogs of the trophoblast and epiblast, followed by the formation of analogs of the primitive endoderm and the polar trophoblasts. This results in the formation of cells transcriptionally similar to the blastocyst (&gt;96%) and a minority of post-implantation analogs. Blastoids efficiently pattern by forming the embryonic-abembryonic axis marked by the maturation of the polar region (NR2F2+), which acquires the specific potential to directionally attach to hormonally stimulated endometrial cells, as in utero. Such a human blastoid is a scalable, versatile, and ethical model to study human development and implantation in vitro.

A protocol outlining the formation of human blastoids that efficiently, timely, and sequentially generate blastocyst-like cells.

פרוטוקול עבור בלסטואידים אנושיים מידול בלסטוציסט פיתוח והשתלה של בלסטוציסטים

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

Developmental Biology

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Immunology and Infection

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the detonation of explosive devices, however, the mechanisms that underlie the brain damage resulting from blast overpressure exposure are not entirely understood and are believed to be unique to this type of brain injury. Preclinical models are crucial tools that contribute to better understand blast-induced brain injury. A novel in vitro blast TBI model was developed using an open-ended shock tube to simulate real-life open-field blast waves modelled by the Friedlander waveform. C57BL/6N mouse organotypic hippocampal slice cultures were exposed to single shock waves and the development of injury was characterized up to 72 h using propidium iodide, a well-established fluorescent marker of cell damage that only penetrates cells with compromised cellular membranes. Propidium iodide fluorescence was significantly higher in the slices exposed to a blast wave when compared with sham slices throughout the duration of the protocol. The brain tissue injury is very reproducible and proportional to the peak overpressure of the shock wave applied.

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

This paper describes a novel model of primary blast traumatic brain injury. A compressed-air driven shock tube is used to expose in vitro mouse hippocampal slice cultures to a single shock wave. This is a simple and rapid protocol generating a reproducible brain tissue injury with a high throughput.

מודל הרומן במבחנה של פגיעה מוחית טראומטית הפיצוץ

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Neuroscience

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

השפעות הפיצוץ-induced Neurotrauma על מכרסם מווסת המזרח התיכון העורקים המוחיים

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Low-intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-head Mild Traumatic Brain Injury in Rodents

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of medical visits in the United States. There are currently no FDA-approved treatments available for TBI. The increased incidence of military-related, blast-induced TBI further accentuates the urgent need for effective TBI treatments. Therefore, new preclinical TBI animal models that recapitulate aspects of human blast-related TBI will greatly advance the research efforts into the neurobiological and pathophysiological processes underlying mild to moderate TBI as well as the development of novel therapeutic strategies for TBI.
Here we present a reliable, reproducible model for the investigation of the molecular, cellular, and behavioral effects of mild to moderate blast-induced TBI. We describe a step-by-step protocol for closed-head, blast-induced mild TBI in rodents using a bench-top setup consisting of a gas-driven shock tube equipped with piezoelectric pressure sensors to ensure consistent test conditions. The benefits of the setup that we have established are its relative low-cost, ease of installation, ease of use and high-throughput capacity. Further advantages of this non-invasive TBI model include the scalability of the blast peak overpressure and the generation of controlled reproducible outcomes. The reproducibility and relevance of this TBI model has been evaluated in a number of downstream applications, including neurobiological, neuropathological, neurophysiological and behavioral analyses, supporting the use of this model for the characterization of processes underlying the etiology of mild to moderate TBI.

We present here a protocol of a blast wave model for rodents to investigate neurobiological and pathophysiological effects of mild to moderate traumatic brain injury. We established a gas-driven, bench-top setup equipped with pressure sensors allowing for reliable and reproducible generation of blast-induced mild to moderate traumatic brain injury.

מודל גל פיצוץ בעצימות נמוכה להערכה פרה-קלינית של פגיעה מוחית טראומטית קלה בראש סגור במכרסמים

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

הערכת הרעלת שאיפת חריפה של חלקיקי מוטס על ידי חשיפת תאי ריאה אנושיים בממשק האוויר-נוזלי

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

שיטת צינור הלם למדל פיצוץ חוזר מאוד ברמה נמוכה בעכברים

Modeling Highly Repetitive Low-level Blast Exposure in Mice

Exposure to explosive blasts is a significant risk factor for brain trauma among exposed persons. Although the effects of large blasts on the brain are well understood, the effects of smaller blasts such as those that occur during military training are less understood. This small, low-level blast exposure also varies highly according to military occupation and training tempo, with some units experiencing few exposures over the course of several years whereas others experience hundreds within a few weeks. Animal models are an important tool in identifying both the injury mechanisms and long-term clinical health risks following low-level blast exposure. Models capable of recapitulating this wide range of exposures are necessary to inform acute and chronic injury outcomes across these disparate risk profiles.
Although outcomes following a few low-level blast exposures are easily modeled for mechanistic study, chronic exposures that occur over a career may be better modeled by blast injury paradigms with repeated exposures that occur frequently over weeks and months. Shown here are methods for modeling highly repetitive low-level blast exposure in mice. The procedures are based on established and widely used pneumatic shocktube models of open-field blast exposure that can be scaled to adjust the overpressure parameters and the number or interval of the exposures. These methods can then be used to either enable mechanistic investigations or recapitulate the routine blast exposures of clinical groups under study.

מחבר זרקור: פענוח ההשפעות ארוכות הטווח של חשיפות לפיצוץ ברמה נמוכה בעכברים

Presented here are methods for producing repeated low-intensity blast exposures using mice.

מידול חשיפה חוזרת ונשנית מאוד לפיצוץ ברמה נמוכה בעכברים

Exposure to explosive blasts is a significant risk factor for brain trauma among exposed persons. Although the effects of large blasts on the brain are ...