ברצוננו להודות על התמיכה הכלכלית של מרכז הלגיון הבריטי המלכותי ללימודי פגיעה הפיצוץ HA, מימון של המועצה למחקר רפואי (M01858X/1) היפרפלזיה מולדת של האדרנל.

1. תרבית תאים, הכנת הדוגמא <ol><li>קבל קו תאים מתאים (למשל, תאים papilla עורי). 
	הערה: הפרוטוקול הנוכחי תוכנן עבור תאים חסיד, עם עכברוש papilla עורי fibroblasts מבודד vibrissae שימשה כמודל.</li>
	<li>התרבות התאים בקבוקון T-75 המכילים מינימום חיוניות בינונית (מאמ) α בתוספת סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין סטרפטומיצין. לשמור את התאים תנאים סטנדרטיים תרבות של 37 ° C ו- 5% CO 2 בסביבה humidified עד שיגיעו למפגש 80%.</li>
	<li>תשאף המדיום ולשטוף פעמיים בתאים Dulbecco &#39; s באגירה פוספט תמיסת (PBS). מביצועם תאים מן הבקבוק מאת המקננת בהם ב- 2 מ של טריפסין/EDTA על תקן התרבות תנאים 5 דק בקצרה בדוק כדי לוודא כי התאים יש לזהויות בהצלחה הבקבוקון באמצעות מיקרוסקופ אור/שלב ניגודיות (עם עדשה המטרה X 10 ).</li>
	<li>להוסיף 4 מ"ל של תרבות מדיום כדי לנטרל. את התגובה trypsinization. להעביר את המתלים תא שפופרת צנטרפוגה 15 mL-</li>
	<li>צנטריפוגה-200 x גרם במשך 4 דקות על גלולה התאים. לאט לאט וארוקן את תגובת שיקוע, מטפל לא לנתק את גלולה. מחדש להשעות את צניפה ב 5 מ ל בינונית.</li>
	<li>העברה של aliquot 20 µL של התליה תא hemocytometer נקי ולספור את התאים באמצעות מיקרוסקופ מצוידים עדשה המטרה X 10-</li>
	<li>להכין את התאים הפיצוץ על ידי הצבת שלוש מנות 35 מ מ בתוך תבשיל 90 מ מ. תווית אותם כראוי. להוסיף 2 מיליליטר בינוני כל מנה 35 מ מ, זרע סך של 5 x 10 תאים 4 לכל תבשיל, הפצת התאים באופן שווה סביב המנה. דגירה הדגימות ניסיוני ללון בתנאים תרבות רגיל כדי לאפשר תא נאותה מצורף לפני גל הלם החשיפה. 
	הערה: עבור הדמיה פלורסנט, תאים חייב להיות נזרע על coverslips זכוכית סטריליים דקה.</li>
</ol> 2. הלם צינור הרכבה <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg" /> איור 2 : EVOC מעטה והלם צינור הרכבה. (א) תמונה של המתקן EVOC. תיאור סכמטי של המנגנון צינור הלם (B). הלם צינור מידות כוללים של קוטר פנימי של 59 מ מ, אורך כולל, לרבות המתקן EVOC, של 4.13 מ'. אורך הצינור מונחה ועל הסכומים מעטה EVOC 2.71 מ' <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol><li>ללבוש נעלי עבודה הבוהן פלדה ומעיל מעבדה במהלך ההליכים הרכבה.</li>
	<li>הוספה פסי היישור שני דרך החורים בולט שני נמצא במישור האופקי של-והסתיר שקע. הנח גיליון אטם גומי nitrile מעל לקצה של פסי היישור כך שיישב בין מקורבות לשקע את המתקן התרבות (EVOC) איברים ex-vivo. 
	הערה: המתקן EVOC הוא אביזר אישית מעוצבת מיועד לשימוש עם צלחות פטרי 35 מ מ ( איור 2 א).</li>
	<li>לצרף המתקן EVOC והסתיר לשקע הצינור הלם על-ידי הזזת את הנורה על פסי היישור, ולהבטיח כי היא orientated כראוי כך המקטע המכיל הפטרי ממוקם בבסיסו.</li>
	<li>הוסף ארבע דסקיות ואומים רמינגטון M24 לתוך החורים הנותרים. מקם את האגוזים כך נוגעים והסתיר את.</li>
	<li>בצורה הדוקה הדקו הקונצפט ברצף בצורה סימטרית באלכסון בזמן בדיקת ויזואלית כי הצינור מעטה והלם EVOC בהצלחה התיישר.</li>
	<li>לצרף מתמר לחץ המתקן EVOC וחבר אותו למקור הנוכחי באמצעות כבל חיישן. לאחר מכן, באמצעות כבל BNC, להתחבר מקור הנוכחי אוסצילוסקופ.</li>
	ודא כי כל שחרור שסתומי וזרימה שולטת על המרקע הלם <li>סגורים. פתח קו מובנה חיצוני גז דחוס, לבטל באופן ידני את וסת הלחץ בכיוון השעון, כדי לחייב את ברז חשמלי כדי 2.5 אנחנו חיים</li>
	<li>פתח את שסתום בטיחות על הבקבוק גז דחוס על-ידי הפעלתו התרחקותו 180°.</li>
	<li>. תסתובב לאט את וסת הלחץ, ממוקם על הבקבוק גז, בכיוון השעון, כדי להגביר את הלחץ על 15 אנחנו חיים 
	הערה: מטרת הגדרה זו הרגולטור צריך מעט מעל הגבוה ביותר מתפוצץ הלחץ של הסרעפת העבה ביותר זה ייעשה הניסוי.</li>
	<li>להכין את דיאפרגמות על ידי חיתוך גיליון פלסטיק בעובי מ מ 0.125 לריבועים 10 ס"מ x 10 ס"מ. 
	הערה: העובי של הסרעפת לתאם עם הלחץ המתפרצת, שינוי הלחץ שיא של גל ההלם (קרי, בדיאפרגמה עבה יותר תגרום גל הלם עם לחץ שיא גדול יותר; טבלה 1).</li>
</ol> < שולחן fo:keep-together.within-דף = "1" > <tbody><tr><td>מיילר הסרעפת מידות (ס"מ)</td> <td>פרץ לחץ (בר)</td> <td>טווח הלחץ חיישן 3 (kPa)</td></tr> <tr><td>x 10 x 10 0.023</td> <td>2 ± 0.2</td> <td>47 ± 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.050</td> <td>4 ± 0.2</td> <td>72 ± 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.125</td> <td>9.5 ± 0.5</td> <td>127 ± 12.5</td></tr></tbody> < /t מסוגל > טבלה 1: פרץ הלחץ המתאים עובי הסרעפת, שיא הלחץ.
<ol start="11"> <li>צור ידיות מתוך הקלטת, לתקנם כדי העליון והתחתון של הסרעפת, ולהשתמש בהם למקם בזהירות הסרעפת ליד-והסתיר קטן קבלה על ידי תא עכוז. להבטיח כי הסרעפת היא ישר והוצבו כראוי לפני סגירת עכוז.</li>
	<li>לאבטח את באמצעות ארבעה רמינגטון M24 ואומים. בצורה הדוקה הדקו הקונצפט ברצף בצורה סימטרית באלכסון.</li>
</ol> 3. הכנה של תאים רגע לפני גל הלם החשיפה <ol><li>הכן תא רקמת למינארי על-ידי ביצוע עיקור אולטרה סגול. . לנקות את זה עם אתנול חיטוי פתרון ו- 70%. לאסוף את כל הפריטים הדרושים לצורך טיפול תאים מוקדמת כדי/פוסט-shock גל חשיפה ומניחים אותם בתוך המנוע סטרילי. 
	הערה: זה כולל בינוני טריים, קרום חדיר גז דבק, מספריים סטרילי, פיפטות, פיפטה טיפים.</li>
	<li>העברת 90 מ מ פטרי צלחת אחת המכילה שלוש ניסיוני דגימות החממה מכסה המנוע סטרילי.</li>
	<li>את החלק קרום חדיר גז דבק גיליון (ראה את הטבלה של חומרים) שישה ריבועים, כך כל אחד הוא גדול מספיק כדי לכסות את החלק העליון של 35 מ מ אחד פטרי.</li>
	<li>תשאף האמצעי 35 מ מ פטרי, למקם את המכסה לצד אחד, לכסות עם שני קטעים דבק ממברנות גז-חדיר, המבטיח כי יש חותם צר בין הקרום הקצה של המנה.</li>
	<li>להעביר את הדגימה המתקן EVOC ואבטח אותו לבסיס של הנורה, כך העליון של המנה מיושר עם הבסיס הפנימי של הצינור הלם.</li>
</ol> 4. הלם צינור מבצע <ol><li>לובש מגיני אוזניים, העין משקפי מגן, נעלי בטיחות, מעיל מעבדה מתאים לחץ מערכת הרכבת התחתית הלם.</li>
	<li>סובב את כפתור בקרת זרימה על הרגולטורים בכיוון השעון, ומאפשר גז לזרום לתוך הצינור גמיש חיבור את הצילינדר באוויר דחוס ברכבת התחתית הלם.</li>
	<li>בחלק התחתון של החלונית ' בקרה ', בחר &#34; עכוז כפול &#34; כניסת עבור wav משך קצר הלםe או &#34; Tube התקן &#34; כניסת עבור משך הגל מוגבר.</li>
	<li>מתג על מקור כוח DC, אוסצילוסקופ לרכוש את הנתונים waveform. הגדרת קצב הדגימה אוסצילוסקופ 50.0 MS/s, עם אורך הרשומה של 1 מ' נקודות. הגדר טווח 50 mV עבור ירי בבר 2 ו- 100 mV עבור מעל 4 אנחנו חיים</li>
	<li>להדליק את האורות בטיחות שימוש בבורר על הקיר שמול הבקרה. 
	הערה: זה אומר חוקרים אחרים לא להכנס לחדר בעת טעינת הצינור הלם.</li>
	<li>להפעיל את המתג על תיבת בקרת ברז חשמלי כדי לסגור את ברז חשמלי. 
	הערה: תכונה זו בטיחות נסגר שסתום ממוקם על החדר עכוז כפול, המאפשר למערכת להיות טעונה.</li>
	<li>על לוח הבקרה, לאט פתח את בקרת הזרימה על-ידי הפעלת הידית נגד כיוון השעון כדי להגדיל בהדרגה את הלחץ בתוך החדר דחיסה. לפקח על הלחץ שימוש בתצוגת לוח הבקרה.</li>
	<li>ברגע הסרעפת פרץ לחץ מתמלאת, הסרעפת יתבקע ו a &#34; באנג &#34; תשמע. לסגור במהירות את בקרת הזרימה על-ידי הפעלת הידית. 
	הערה: גל ההלם ייסעו דרך צינור על המדגם תא, החוצה את קצה הצינורית.</li>
	<li>לפתוח את ברז חשמלי על-ידי ביטול הבורר על הקופסא פקד סולנואיד, כבה את האור בטיחות (באמצעות הבורר על הקיר שמול לוח הבקרה).</li>
	<li>להעביר את הדגימה תא מכסה המנוע סטרילי, להסיר את הקרומים גז-חדיר דבק ולאחר למלא קערה עם 2 מ של מדיום הגידול טריים. התאים שניתן להשתמש מיד להערכה, כפי שמתואר בשלב 5 או חזר החממה ללימודי וקהילותיהם.</li>
</ol> 5. תא הכדאיות <ol><li>להעריך תא הכדאיות בעקבות חשיפה גל הלם באמצעות שילוב assay מחוון של חמצון-חיזור עם פלורסנט ההדמיה של תאים חיים וגם מתים. 
	הערה: עבור הדמיה פלורסנט, תאים חייב להיות נזרע על coverslips זכוכית סטריליים דקה במהלך פרק 1: תא הכנה תרבות, לדוגמה. ניתן להציב בתוך צלחות פטרי 35 מ מ.</li>
	<li>µL 200 העברה מהתרכובת indictor חמצון-חיזור (ראה את הטבלה של חומרים) לכל מאכל ניסיוני ישירות לאחר מילוי אותם עם 2 מ"ל של הלם שלאחר בינוני גל חשיפה. דגירה-תרבות רגיל תנאים 4 h.</li>
	<li>על כל מנה, להעביר (בשכונה סטרילי כהה) 2 x 100 µL aliquots או שחור או לנקות צלחת 96-ובכן, תלוי אם זריחה או ספיגת ישמש להערכת הכדאיות.</li>
	<li>להעביר את הצלחת 96-ובכן בקורא צלחות מתאימות מצויד המסננים הנכון ולקרוא באמצעות עירור להקות 530ex/590em עבור זריחה או 570 nm בשילוב עם הפניה 600 ננומטר על ספיגת. לייצא ולשמור את הנתונים.</li>
	<li>לנתח את הנתונים כדי לזהות הבדל כלשהו בין דגימות החשופים גל הלם ופקדי שאינו חשוף, כמו זה יכול להצביע על ירידה ב תא הכדאיות. 
	הערה: פקד שלילי גם להיכלל הנבחנים. יתר על כן, האינטרפולציה של עיקול רגיל יכול לשמש כדי לחשב את מספרי הטלפון הנייד.</li>
	<li>תשאף המדיום המכיל הכימית מחוון חמצון-חיזור. להחליף אותו עם 2 מיליליטר בינוני טריים, דגירה התאים-תנאים סטנדרטיים תרבות 24h.</li>
	<li>חזור על השלבים שלעיל לפי הצורך כדי לקבל נקודת הזמן הכדאיות השני.</li>
	<li>עבור ההדמיה פלורסנט של תאים מתים וחיים, תשאף המדיום ולשטוף פעמיים בתאים 1 מ"ל ל- PBS. העברת 100 µL מהתרכובת מלאה נמצאו ההדמיה קיט (ראה את הטבלה של חומרים) כדי שכל דוגמית, דגירה בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור במשך 15 דקות</li>
	<li>תשאף הכימית ולשטוף לאחר שימוש 1 מ"ל ל- PBS. בעזרת מלקחיים הצבע בסדר, בזהירות להסיר את coverslip של המנה 35 מ מ ומניחים אותו, פנים כלפי מטה על זכוכית מיקרוסקופ.</li>
	<li>ידרשו תמונות עבור כל דגימה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (המטרה 10x עדשה, 0.50 מפתח נומרי) מצוידים עם המסננים עירור, פליטה (ex / em 488 ננומטר/515 nm ו 570 nm nm/602). 
	הערה: תאים חיים פולט קרינה פלואורסצנטית אינטנסיבי, אחיד, ירוק. תאים מת או גוסס עם הממברנה התאית נפגעת תהיה ספיגת הרכיב ערכת מת, וכתוצאה מכך פליטת פלואורסצנטי אדום, נמצא בעיקר באזור גרעיני התא.</li>
	<li>השתמש וניתוח תמונות תוכנה גם באופן ידני או אוטומטי לספור את מספר תאים מתים וחיים של כל תמונה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+explosion+and+blast+injury+processes.">The physical basis of explosion and blast injury processes.</a> J R Army Med Corps. 159, 4-9 (2013).</li><li>Born, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Trauma:+The+Fourth+Weapon+of+Mass+Destruction.">Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction.</a> Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).</li><li>Kocsis, J. D., Tessler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+blast-related+brain+injury.">Pathology of blast-related brain injury.</a> J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).</li><li>Bass, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Injuries+from+Blast.">Brain Injuries from Blast.</a> Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).</li><li>Cernak, I., Kobeissy, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Neurotrauma:+Molecular,+Neuropsychological,+and+Rehabilitation+Aspects.">Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects.</a> Frontiers in Neuroengineering. , (2015).</li><li>Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+injuries+and+heterotopic+ossification.">Blast injuries and heterotopic ossification.</a> Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).</li><li>Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Ossification+Following+Traumatic+and+Combat-Related+Amputations.+Prevalence,+Risk+Factors,+and+Preliminary+Results+of+Excision.">Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision.</a> J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).</li><li>Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Lung+Injury.">Blast Lung Injury.</a> Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Hearing+Loss+after+Blast+Injury+to+the+Ear.">Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear.</a> PLoS ONE. 8 (7), 67618 (2013).</li><li>Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , (2016).</li><li>Arun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+blast+traumatic+brain+injury+using+in-vitro+model+with+shock+tube.">Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube.</a> Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).</li><li>Ahlers, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+effects+of+acute+and+repeated+exposure+to+blast+overpressure+in+rodents:+toward+a+greater+understanding+of+blast+and+the+potential+ramifications+for+injury+in+humans+exposed+to+blast.">Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast.</a> Front Neurol. 3, 32 (2012).</li><li>Polfer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+rat+model+to+investigate+the+formation+of+blast-related+post-traumatic+heterotopic+ossification.">The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification.</a> Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).</li><li>Miller, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Blast+Overpressure+on+Neurons+and+Glial+Cells+in+Rat+Organotypic+Hippocampal+Slice+Cultures.">Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures.</a> Front Neurol. 6, 20 (2015).</li><li>Chandra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+blast+wave+profiles+in+simulated+air+blasts:+experiment+and+computational+modeling.">Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling.</a> Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).</li><li>Kuriakose, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+the+Blast+Exposure+Conditions+in+the+Shock+Tube+for+Generating+Pure,+Primary+Shock+Waves:+The+End+Plate+Facilitates+Elimination+of+Secondary+Loading+of+the+Specimen.">Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen.</a> PLoS ONE. 11 (9), 0161597 (2016).</li><li>Reneer, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Mode+Shock+Tube+for+Investigation+of+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).</li><li>VandeVord, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).</li><li>Kane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+cultured+microglia+in+response+to+simulated+blast+overpressure:+Possible+role+of+pulse+duration.">Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration.</a> Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).</li><li>Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impulsive+pressurization+of+neuronal+cells+for+traumatic+brain+injury+study.">Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+in+Rat+Hair+Follicles+following+Simulated+Blast+Insult:+A+New+Diagnostic+Tool+for+Traumatic+Brain+Injury.">Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury.</a> PLoS ONE. 9 (8), 104518 (2014).</li><li>Bo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+characterization+of+compression-induceddamage+in+live+biological+samples.">Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples.</a> AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).</li><li>Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+ossification+after+extremity+blast+amputation+in+a+Sprague-Dawley+rat+animal+model.">Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model.</a> J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Approaches+for+Studying+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).</li><li>Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+blast+wave+generation+in+a+shock+tube+for+biological+applications.">Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications.</a> JPCS. 500 (14), 142025 (2014).</li></ol>

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

פציעות העיקרי שהושג מחשיפה לאירועי הפיצוץ אינם עדיין לגמרי מובנים. זיהוי של הבנת המנגנונים שגורמים להופעת פציעות הנוצרות על-ידי הפיצוץ, כמו פגיעה מוחית טראומטית3,4 והתקשות הטרוטופי6,7, הם הצעדים הראשונים חשוב להתפתחות שיטות יעילות של טיפול מונע. על מנת להשיג מטרה זו, פותחו מספר מערכות ניסויות כדי לשכפל את הפיצוץ אירוע חשיפה11,12,13,14,18,19 . בטכניקה המתוארת כאן משתמש הלם צינור ציוד (איור 2) מסוגל לירות גלי הלם במגוון של לחצים לכל הגוף (קרי, מכרסם), רקמות או דגימות תאים. היכולת לטעון סוגי תאים בודדים ולא כל רקמות נותן את היכולת לנתח את התגובות הסלולר ברורים, כמו נזק יכול להתרחש במקביל באמצעות מגוון של מנגנונים1,2. לדוגמה, ליצור מודל טראומטי פגיעה מוחית, את ההערכה של סוגי תא בודד, כמו נוירונים האסטרוציטים, באפשרותך לאפשר לצורך זיהוי תאים ספציפיים פציעה. בנוסף, התגובה כולה-איבר יכול להיות מוערך באמצעות רקמת המוח. את סוגי תאים בודדים והן דגימות רקמה יש ערך, יכול לתת מידע שונה. זה גם אפשרי לשנות את כמות אוויר בלחץ כדי להפיק ההלם על-ידי בחירת לים כפול-עכוז או מנהל התקן-שפופרת. קובע את משך הזמן של גל ההלם. אפשרות אחרת היא לשנות את החומר הסרעפת ואת עובי לשנות את הלחץ שיא25.
גורם נוסף שיש לקחת בחשבון תופעות הפרעות קצה זה יכול להיות נוכח בעת הדיור המדגם הינו ממוקם ליד היציאה של הרכבת התחתית הלם, כגון אלה שנמצאו על האסדה EVOC המתוארות המערכת הנוכחית. צ'אנדרה. et al. הביט פרופילים גל ההדף שנמצאו במקומות שונים על צינור הלם מונחה דחיסה ומצא waveform פרידלנדר היה מיוצג בצורה הטובה ביותר במיקום עמוק בתוך ה-tube הלם15. . Kuriakose et al. גם למד משני הטעינה של המדגם ומצא כי הצבת צלחת סוף בסוף הצינור הלם היה מסוגל לחסל גלים משתקף לא רצויים16. בהתחשב בנתונים נמצאו אלה15,פרסומים16, שינויים בעתיד על מנת לשפר את מערכת הרכבת התחתית הלם המתוארות במאמר זה יכול לכלול את המיקום של המתקן EVOC במיקום עמוק יותר בתוך הצינור מונע או, לחלופין, ההכללה של צלחת סוף ברכבת התחתית הלם. מגבלות של השיטה המתוארת עשוי לכלול את התפוקה נמוכה יחסית של דגימות. משתמש בודד יכול לפעול הצינור הלם בבטחה על פלט של סביב 6-8 דגימות לשעה. כיום, המערכת מיועדת סביב השימוש יחיד 35 מ מ פטרי. לכן, ניסויים גדול המכיל מספר קבוצות ומשוכפלת ביולוגי יכול להיות קשה להשיג.
מאמר זה שיטות מראה איך הכדאיות של תאים חסיד papilla עורי היה מושפע על ידי חשיפה גל הלם יחיד. גל הלם משך קצר (&#60; 10 ms) של ≤72 kPa לא השפיע על הכדאיות בהשוואה הפקד (איור 3 ו- 4 באיור). לעומת זאת, גל הלם ב kPa-127 גירוי ירידה משמעותית הכדאיות ב 24 שעות שלאחר הפיצוץ, כפי שמוצג על ידי חמצון-חיזור מחוון assay (איור 3) והן ניתוח תמונות פלורסנט (איור 4). . מילר ואח דיווחו ירידה דומה תא הכדאיות בתרבויות בהיפוקמפוס פרוסה של עכברוש organotypic כאשר תאים נחשפו גם 147 kPa או גל הלם 278 kPa באמצעות שפופרת של שוק פתוח, מונחה הליום14. לעומת זאת, VandeVord. ואח דיווחו כי שם אין השפעה על יכולת הקיום של עכברוש האסטרוציטים נחשפים הלחץ משך קצר של &#62; 200 kPa, למרות barochamber שימש במקום שפופרת הלם18. יצוין, כי הלחץ החיצוני הוא מסתמך על גל ההדף, למרות זו יוצרת גלי הלחץ מורכבות בתוך הגוף, ולכן עושה הטבע ההעמסה תלויות במידה רבה על התכונות המכאניות של רקמות או התא. מחקרים נוספים אפיון של התגובה התאית לאירועים הפיצוץ נדרש. יתר על כן, על-ידי הערכת חשיפה גל הלם ברמה התאית, כפי שמוצג בטכניקה זו, תגובות ביולוגיות מופעלות מהפציעה, כגון ההפרעות של איתות המסלולים או שינויים epigenetic, יכול להיות מזוהה, בטיולי.
לסיכום, עבודה זו מתארת את השימוש צינור נירוסטה הלם מעטה EVOC ששונה כדי לשלב התא הראשי תרבויות. גלי הלם במגוון של לחצים יכול להיות שנוצר, הם מופצים על תאים חיים כדי לשכפל את תופעות המתרחשות מחשיפה גל הדף. פרוטוקול זה מדגים כיצד להעריך את הכדאיות התא, אך גם ניתן יהיה ללמוד שינויים וקהילותיהם סוגי תאים בודדים. הולך קדימה, אנו מתכננים להעריך את האפקטים דיפרנציאל מורכבות גלי הלם יכול להפיק סוגי תאים שונים, במטרה לקדם את ההבנה שלנו של הפיצוץ-induced פציעות העיקרי.

עם המגמה האחרונה לקראת שימוש מטעני חבלה לוחמה מודרנית ובפעולות טרור על אזרחים, הבנת ההשפעות של אירועים נפץ על גוף האדם הוא בעל חשיבות רבה. פציעות שהושג באמצעות חשיפה לאירועים הפיצוץ יכול להיות קטלני קטלני, עם תהליכים פיזיים של פגיעה מחולק לארבע קטגוריות. ראשי פציעות כתוצאה מחשיפה ישירה גל ההדף, אשר אינטראקציה באופן מקומי עם הגוף באופן compressive, לאחר מכן ולקיבולת, גורם השיבוש של ממברנות, רקמות רכות1. פציעות משניות לכלול פגיעת או פצעי חדירה שנגרמו על ידי פגיעה בחפצים נמוך-המונית מונעות במהירות גבוהה על-ידי גל ההדף. פציעות שלישוני להתרחש כאשר גל ההדף יש אנרגיה מספקת כדי לזרוק חפצים של מסה גבוהה או יחידים מפני חפצים. לבסוף, פציעות הפיצוץ רבעוני מוגדרים על-ידי אחרים פציעות שונות אשר אינם מתאימים לקטגוריות האחרות, כגון כוויות פלאש2. בעקבות החשיפה לאירועים שכאלה הפיצוץ, פציעות ראשי כוללים4,3,פגיעה מוחית טראומטית5, התקשות הטרוטופי6,7, הפיצוץ ריאות פציעה8, אובדן שמיעה 9ועוד10.
Waveform בדרך כלל התצפיות מאירועים הפיצוץ הוא גל פרידלנדר, המייצג פיצוץ שדה חינם, להבדיל בחלל סגור. Waveform מורכב חזית הפיצוץ זה יכולה להיות מוגדרת כ עלייה חדה ומהירה בלחץ חיובי. זה ומיד אחריו על ידי רוח משב אוויר נע במהירות גבוהה, גל שחרור אשר מפחית את הלחץ מתחת רמות אטמוספרי. ואקום חלקי נשאר ליד אזור הפיצוץ הראשוני, דבר המתבטא זרם אחורי איטית של אוויר. שלבי חיוביים ושליליים של הגל (איור 1 א') לגרום לתנועת שכיבות למשוך גל ההדף1. כדי לסייע להבהיר את המנגנונים מאחורי פיצוץ ראשי פציעות, נוצרו גרסאות ניסיוניות לייצר ואת, כמו הגל פרידלנדר, אשר תאים ורקמות יעמדו בפני כאשר נחשף אירוע פיצוץ אמיתי. המערכות הקיימות המפורטים בספרות כוללים הלם צינורות11,12,13,14,15,16,17, 18,barochambers19בר קולסקי20, סימולטורים מתקדמים הפיצוץ21, פיצול Hopkinson לחץ בר22, הבילוי של אירועים אלטרנטיביים הפיצוץ בעזרת סביבה מבוקרת pentaerythritol tetranitrate23. למרות המגוון הרחב של הדגמים, משתנים רבים להשפיע על הפגיעה המתקבל גלי ההדף, כולל הלחץ טרום שהוחלה, ואת התכונות המכאניות של, סוגי תאים בודדים או רקמות תחת הערכה24. בעוד המחקר של הרקמות או האיברים יכולה לשפוך אור על רקמות דפורמציה ושינויים מורפולוגיים ברוטו נגרם בעקבות הפיצוץ אירועים, ניתוח ברמה התאית יכול לחשוף שינויים epigenetic תעתיק מושפע גל ההלם.
במאמר זה-שיטות טכניקה להפיץ גלי הלם במגוון של לחצים על תאים חיים טפט. דבר זה מאפשר אפיון הכדאיות תא, שחקרתי ספי נזק פוטנציאלי של גלי הלם מיידית. יתר על כן, התאים קיימא שאפשר יהיה להחזיר את התנאים תרבות רגיל, השפעות ביולוגיות לטווח ארוך מן האירוע הפיצוץ יכול להיות מוערך. להלן הפרוטוקול מתאר שתי טכניקות הכדאיות התא יכול לשמש בתאי בתרבות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig1.jpg"> 
איור 1: קירוב של גל פרידלנדר. (א) הערכה של גל פרידלנדר נצפו על חיישן 3 ברכבת התחתית הלם. (B) נציג נתונים מציג את הפרופילים לחץ שונות נצפו על חיישנים 1, 2 ו- 3 על המרקע הלם. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1124">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>MEM &#945;, nucleosides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22571020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dilute 1 in 10 before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2</td>
			<td>Triple Red</td>
			<td>TCD010035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Petri dish (PS) 90x14.2mm no vent</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>391-0453&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Gas Permeable Adhesive Plate Seals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Alamarblue cell viability reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13494309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Virkon tablets</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>115-0020</td>
			<td>Use to create 2% solution as viability control reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>SurgicalTools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Use to remove coverslips from petri dish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Cover glass, square</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-1553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, solid black</td>
			<td>AppletonWoods</td>
			<td>CC760</td>
			<td>Plate to be used for fluorescence measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, clear, (PS)</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>734-1799</td>
			<td>Plate to be used for absorbance measurments.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Leica DMi1 Camera stand outfit</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Optical microscope used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>EnVision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010A</td>
			<td>Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0782</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0786</td>
			<td>Use to creatw shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0798</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Current source power unit</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>4103C</td>
			<td>Power source for 2300V1 sensor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>IEPE Pressure Sensor</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>2300V1</td>
			<td>Pressure sensor located on shock tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>DPO 4104B</td>
			<td>Use to gather and save sensor 2300V1 data.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating primary blast effects in vitro

חשיפה לאירועים הפיצוץ יכול לגרום טראומה קשה לאיברים חיוניים כגון הריאות, האוזניים, ו המוח. הבנת המנגנונים מאחורי פגיעות כאלה הנוצרות על-ידי הפיצוץ הוא בעל חשיבות רבה שוקל את המגמה האחרונה לקראת שימוש בחומרי נפץ לוחמה מודרנית, אירועים הקשורים לטרוריסטים. כדי להבין באופן מלא את הפיצוץ-induced פציעה, עלינו תחילה להיות מסוגלים לשכפל אירועים כאלה הפיצוץ בסביבה מבוקרת באמצעות שיטה ישימה. טכניקה זו באמצעות ציוד צינור הלם, גלי הלם במגוון של לחצים אותם ניתן להפיץ על תאים חיים גדלו ב 2D, סמנים של הכדאיות תא ניתן מיד לנתח שימוש assay מחוון של חמצון-חיזור, ההדמיה פלורסנט של תאים מתים וחיים. שיטה זו הוכיחה כי הגדלת את הלחץ הפיצוץ שיא ל 127 kPa יכול לעורר ירידה משמעותית בתוך התא הכדאיות בהשוואה פקדים ללא טיפול. הבדיקה דוגמאות אינם מוגבלים תאים חסיד, אך יכול לכלול תא המתלים, לכל הגוף ודגימת רקמות, דרך שינויים מזעריים הגדרת צינור הלם. משכפל את התנאים המדויקים רקמות ותאים להיתקל כאשר נחשף אירוע פיצוץ אמיתי קשה. טכניקות כגון האחד שהוצגו במאמר זה יכול לעזור להגדיר מיכסות נזק ולזהות את השינויים גנים ברמת השעתוק והתרגום epigenetic בתוך תאי הנובעות מחשיפה גל הלם.

באמצעות השיטה המתוארת לעיל, תאים גדל של טפט נחשפו שהפקידים על גלי הלם שנוצר באמצעות צינור הלם (איור 2B). סמנים של הכדאיות תא היו העריכו. שימוש assay מחוון של חמצון-חיזור, התברר כי היישום של גל הלם 127 kPa היה מסוגל להקטין משמעותית את הכדאיות של תאים papilla עורי לעומת שולט לאחר 24 שעות בתרבות (איור 3). היישום של kPa ≤72 גל הלם לא להפחית הכדאיות. כדי לתמוך תצפיות אלה, התמונה פלורסנט assay מסוגל fluorescently labelling תא חי או מת עם fluorophores ירוק או אדום, בהתאמה, היה בשימוש. כימות של תאים מתים וחיים מתמונות פלורסנט 13 לכל שכפול ביולוגי הפגינו ירידה תא הכדאיות אלה נחשפים גל ההלם 127 kPa בהשוואה הפקד (איור 4). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן השוואה מרובים של Tukey, עם p &#60; 0.05 השפעה משמעותית מבחינה סטטיסטית. גודל המדגם לכל קבוצה הסתכם בכ 9 עבור וזמינותו מחוון חמצון-חיזור ועוד 39 לניתוח הדמיה פלורסצנטיות כמותית.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig3.jpg"> 
איור 3 : חמצון-חיזור מחוון Assay הנתונים מציג מסלול הזמן של תא הכדאיות לאחר חשיפה גל הלם. באופן משמעותי פחות תאים נצפו לאחר 24 שעות ביממה, 127-kPa החשופים גל הלם בקבוצה בהשוואה הפקד אינו מטופל. הפקד שלילי כללה טיפול 30-s עם 2% חומר חיטוי (ראה טבלה של החומרים) הראה באופן משמעותי פחות תאים-T0 והן 24 שעות בהשוואה לקבוצות אחרות. כל עמודה מייצגת את סטיית התקן זאת אומרת ± 1 (SD); משכפל ביולוגי, N = 3; טכני משכפל, n = 3. = p &#60; 0.0001. * = p &#60; 0.05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig4.jpg"> 
איור 4 : זריחה הדמיה- (א) נתונים כמותיים שנאספו פלורסנט תמונות של תאים מתים וחיים שנלכדה באמצעות מיקרוסקופ זריחה ב- 24 שעות גל הלם שלאחר חשיפה. באופן משמעותי פחות התאים קיימא נצפתה של kPa 127 (מתכוון = 93.42) מדגם גל הלם חשופים בהשוואה של kPa 47 (מתכוון = 98.18), 72 kPa (מתכוון = 98.87), ולשלוט קבוצות (מתכוון = 99.10). לא התאים קיימא נצפו על קבוצת הביקורת השלילית לאחר 24 שעות (כלומר = 0). תמונות נציג קרינה פלואורסצנטית (B). ירוק מראה תאים חיים, בעוד האדום מראה תאים מתים. כל חלקה תיבת מראה את רביעונים העליון והתחתון עם שפם Tukey; משכפל ביולוגי, N = 3; טכני משכפל, n = 13. = p &#60; 0.0001. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Primary Blast Effects In Vitro at JoVE.com

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

הבנה כיצד מאופנן של תאים על ידי חשיפה גלי הלם יכול לעזור לזהות את המנגנונים מאחורי פציעות מופעלות מאירועים הפיצוץ. פרוטוקול זה משתמש הלם לפי הזמנה צינור ציוד להחלת גלי הלם במגוון של לחצים תא monolayers, כדי לזהות את ההשפעות עוקבות על הכדאיות תא.

בהערכת פגיעה עיקריים אפקטים במבחנה

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

evaluating-primary-blast-effects-in-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

7.9K Views.  Imperial College London. הבנה כיצד מאופנן של תאים על ידי חשיפה גלי הלם יכול לעזור לזהות את המנגנונים מאחורי פציעות מופעלות מאירועים הפיצוץ. פרוטוקול זה משתמש הלם לפי הזמנה צינור ציוד להחלת גלי הלם במגוון של לחצים תא monolayers, כדי לזהות את ההשפעות עוקבות על הכדאיות תא.

Video: Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

מכשיר microfluidic ליצירה מחדש של גידול microenvironment<em&gt; במבחנה</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

יישומים של<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקות פונקציונליות של עכברוש השוקה הקדמי להערכת רקמות מהונדסות תיקון שרירי שלד

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...