This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).

NOTA: Prima di fornire campioni di saliva tutti i soggetti hanno dato il consenso informato conforme alle linee guida per il trattamento di soggetti umani all&#39;ospedale dei bambini a livello nazionale. 1 Saliva Raccolta e conservazione <ol><li> Prima della raccolta della saliva, assicurarsi che la bocca del soggetto è libero di cibo o altre sostanze estranee avendo il soggetto sciacquare la bocca con acqua ed evitando di mangiare o bere per 30 minuti prima di raccogliere il campione. </li><li> Aprire una provetta da centrifuga da 15 ml con 2,5 ml di tampone di DNA stabilizzazione 2 avendo cura di evitare di toccare l&#39;interno del tappo o il tubo, e hanno il soggetto sputare 2,5 ml di saliva nella soluzione tampone. Nota: Raccolta di oltre 2,5 ml di saliva può portare al degrado del campione da un rapporto di insufficiente di campione di tampone di stabilizzazione del DNA. Raccolta troppo poco di saliva riduce i rendimenti attesi dal protocollo. Per valutare i volumi di raccolta, utilizzare i gradienti numerati sul lato di tegli tubo. </li><li> Rimettere il tappo e miscelare per inversione fino a quando la miscela è omogeneizzato. Agitazione vigorosa non è necessario. Conservare i campioni a temperatura ambiente per la conservazione a breve termine o 4 ° C per la conservazione a lungo termine (&gt; 3 mesi). </li></ol> 2. Preparazioni iniziali e lisi cellulare <ol><li> Prima di iniziare l&#39;estrazione, riscaldare a bagnomaria a 37 ° C, e preparare un secchio di ghiaccio. Saranno necessari tre provette da 15 ml per centrifuga coniche per ogni campione estratto. I tre tubi saranno utilizzati per contenere il cellulare e proteine ​​pellet, la finale estratto gDNA, e le isopropanolo ed etanolo surnatanti. </li><li> Recupera campioni di stoccaggio, e campioni di invertire tempi diversi poi vortice a media velocità per 15 secondi. </li><li> Dispensare 2.5 ml di campione in un ambiente pulito 15 ml tubo da centrifuga, e aggiungere 5 ml di Cell Lysis Solution. Mescolare il campione 50 volte per inversione, e incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li></ol> 3. RNA rimozione <ol><li> Aggiungere 40 ml di RNasi A Solution a 100 mg / ml, e incubare a 37 ° C per 15 min. </li><li> Togliere il campione dal bagno di 37 ° C e acqua fredda su ghiaccio per 3 min. <ol><li> Dopo l&#39;incubazione RNasi A, aumentare la temperatura del bagno d&#39;acqua a 65 ° C per la fase di reidratazione DNA del protocollo. </li></ol></li></ol> 4. Proteine ​​e lipidi di rimozione <ol><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di proteinasi K a 20 mg / ml, mescolare più volte per inversione, e incubare a temperatura ambiente per un minimo di 30 min. Nota: Questo è un possibile punto di pausa per il protocollo. Dopo l&#39;aggiunta della soluzione di proteinasi K, il campione può essere conservato a 4 ° C fino al momento dell&#39;estrazione può essere completata. Conservare a 4 ° C per un massimo di 24 ore non è stato dimostrato di avere un effetto significativo sui rendimenti di estrazione o la qualità del DNA. Stoccaggio a lungo termine in questa fase non è stata valutata. </li><li> Aggiungere 1,7 ml di proteina Precipitazione Solution, mescolare vigorosamente nel vortex per 20 secondi ad alta velocità, e posto in ghiaccio per 10 min. </li&gt; <li> Una volta che i campioni sono raffreddati in ghiaccio per 10 minuti, centrifugare per 10 minuti a 3000 xg e 4 ° C. Le proteine ​​precipitate devono formare un pellet stretto per continuare. Se il pellet non è stretto o la soluzione è ancora torbida, i campioni possono essere raffreddati in ghiaccio per 5 minuti di più e centrifugazione ripetuti. I campioni devono essere tenuti in ghiaccio per garantire un pellet stretto. </li></ol> 5. isolamento e la purificazione di gDNA <ol><li> In un ambiente pulito 15 ml tubo da centrifuga, pipetta 5 ml di isopropanolo e 8 ml di puro Soluzione glicogeno a 20 mg / ml. </li><li> Versare il surnatante contenente il gDNA dal punto 4.3 nella provetta contenente la soluzione di isopropanolo e glicogeno, lasciando dietro di sé la proteina pellet precipitato. Una volta aggiunto il surnatante, mescolare delicatamente il campione di 50 volte per inversione e centrifugare per 30 minuti a 3000 xg e 4 ° C. </li><li> Versare lentamente il surnatante in una provetta pulita 15 ml. Dopo la rimozione del surnatante, aggiungere 1 ml di etanolo al 70% perlavare il pellet lentamente a dondolo e spostando delicatamente la etanolo sopra il pellet precipitato più volte. Conservare l&#39;etanolo nel tubo. </li><li> Dopo il lavaggio iniziale, centrifugare il campione per 1 min a 2.000 xg e 20 ° C. Questa fase di centrifugazione può essere fatta sia a 4 ° C o 20 ° C. Nessun effetto significativo della temperatura è stato dimostrato per questo passo. </li><li> Dopo il lavaggio iniziale e la centrifugazione del pellet, versare lentamente il lavaggio etanolo dal tubo ed eliminare, quindi eseguire un secondo lavaggio ripetendo i punti 5.3 e 5.4. </li><li> Dopo la rimozione del supernatante dal secondo lavaggio, permettere il pellet asciugare all&#39;aria per 15 min. <ol><li> Se il campione non si è completamente asciugato, aria secca per altri 15 min. </li></ol></li></ol> 6. reidratazione di gDNA <ol><li> Una volta che il campione si è asciugato, aggiungere 300 ml di Tris-EDTA per reidratare il pellet gDNA secca. </li><li> Vortex il campione per 5 secondi a velocità media e posto in un65 ° C in bagno di acqua calda per 1 ora. </li><li> Rimuovere i campioni dal bagnomaria e incubare O / N a RT. NOTA: Tutti i prodotti ei reagenti utilizzati sono elencati nella tabella dei materiali, così come Tabella 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies.">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li><li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes.">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li><li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+rates+and+fear+of+phlebotomy+in+pediatric+patients+in+a+genetic+study+of+epilepsy.">Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy.</a> Epilepsy &amp; Behavior. 6, 444-446 (2005).</li><li>Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting+saliva+by+mail+for+genetic+and+cotinine+analyses+in+participants+recruited+through+the+internet.">Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet.</a> European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).</li><li>Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+blood,+saliva,+and+buccal+cell+samples+in+a+pilot+study+on+the+danish+nurse+cohort:+Comparison+of+the+response+rate+and+quality+of+genomic+DNA.">Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).</li><li>Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva:+A+convenient+source+of+DNA+for+analysis+of+bi-allelic+polymorphisms+of+fc&#947;+receptor+iia+(cd32)+and+fc&#947;+receptor+iiib+(cd16).">Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fc&#947; receptor iia (cd32) and fc&#947; receptor iiib (cd16).</a> Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).</li><li>Dawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates,+from+salivary+analyses,+of+the+turnover+time+of+oral+mucosal+epithelium+in+humans+and+the+number+of+bacteria+in+an+edentulous+mouth.">Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth.</a> Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).</li><li>Bahlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva-derived+DNA+performs+well+in+large-scale,+high-density+single-nucleotide+polymorphism+microarray+studies.">Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+performance+between+saliva+and+blood-derived+genomic+dnas+on+the+dmet+array:+A+comparison.">Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).</li><li>Simmons, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+genotype-phenotype+model+determinism:+Application+to+bivariate+reading/language+traits+and+epistatic+interactions+in+language-impaired+families.">Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families.</a> Human Heredity. 70, 232-244 (2010).</li><li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+precipitation+of+DNA.">Ethanol precipitation of DNA.</a> Focus. 7, 1-2 (1985).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+Transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li><li>DePristo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data.">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La presente procedura è un protocollo di estrazione del DNA ottimizzato che ha notevolmente migliorato la resa del DNA ad alto peso molecolare rispetto ai metodi standard, senza compromettere la qualità del DNA. La fase critica con l&#39;effetto più grande sulla resa più era punto 5.2, che comprende una fase di centrifugazione più a lungo durante precipitazione in etanolo di qualsiasi protocollo pubblicato recensito qui, tranne uno che non è stato ampiamente distribuito 11. Non sono stati rilevati cambi...

Ottenere DNA di alta qualità per gli studi genetici umani è essenziale nel processo di scoperta del gene della malattia. Sangue, anche se richiede una procedura invasiva e anche di essere più costoso di raccolta della saliva, è favorito per la creazione di linee cellulari immortalizzate come una fonte infinita di DNA, o iPSCs per studi funzionali, e, talvolta, il DNA del sangue viene utilizzato quando le linee cellulari non sono disponibili. Tuttavia, il prelievo di sangue richiede un flebotomo addestrato e il sangue ha una emivita più breve di saliva 1. DNA dalla saliva è meno costoso e più facile da ottenere, dal momento che può essere raccolto e inviato attraverso la posta elettronica, senza la necessità di un flebotomo, aumentando così i potenziali soggetti piscine ben oltre il bacino di utenza di ospedali e laboratori 2. Studio iscrizione può essere migliorata quando i soggetti hanno la possibilità di dare un campione di saliva al posto del sangue 3, 4. Preoccupazioni circa la quantità e la qualità del DNA dalla saliva possono aver limitato la sua diffusione di noie nonostante i numerosi studi recenti studi che mostrano l&#39;idoneità di tutta la saliva, con una media di 4,3 x 10 5 cellule per millilitro, per il test del DNA rispetto ai più tamponi buccali metodi che non abbiano conseguito notevoli quantità di saliva 2, 3, 4, 5, 6. Mentre una modesta letteratura esistente che mostra l&#39;idoneità di tutta la saliva DNA derivato per le applicazioni di genotipizzazione compresi i metodi basati su microarray 8, 9, 10, nessuno studio ha esaminato sequenziamento di nuova generazione (NGS). L&#39;obiettivo di ottimizzare l&#39;intero protocollo di estrazione del DNA della saliva è stato quello di massimizzare la quantità e la qualità per le applicazioni della genetica in un modo economicamente efficace che può essere facilmente implementato in laboratorio con reagenti e materiali di consumo comuni. Estrazione del DNA dalla saliva richiede diverse procedure: 1) raccolta e conservazione, 2) la lisi cellulare, 3) trattamento RNasi, 4) la precipitazione delle proteine, 5) precipitazione in etanolo, 6) reidratazione del DNA. La soluzione di DNA Stabilizzazione tampone, descrittoin precedenza 2, funzioni adeguatamente senza alterazione. Nessun tentativo di ottimizzare il trattamento RNasi e DNA fasi di reidratazione è stata fatta. Per ogni passo rimanente, diverse variabili che potrebbero influenzare il rendimento sono stati identificati. Ogni variabile è stato manipolato individualmente e miglioramento della resa e la qualità è stata valutata statisticamente. Per le variabili che sono stati mostrati per migliorare il rendimento e / o la qualità del DNA, i valori ottimali sono stati inclusi nel protocollo finale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="260">
	<tbody>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:88px;">15ml Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">12-565-268</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">Cell Lysis Solution</td>
			<td style="width:88px;">Qiagen</td>
			<td style="width:84px;">158908</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:88px;">Sigma</td>
			<td style="width:84px;">P6556</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:88px;">Protein Precipitation Solution</td>
			<td style="width:88px;">Qiagen</td>
			<td style="width:84px;">158912</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">A416-4</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">Glycogen</td>
			<td style="width:88px;">EZ-BioResearch</td>
			<td style="width:84px;">S1003</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">04-355-305</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">Tris-EDTA (TE)</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">BP2473-1</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">NaCl</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">AC194090010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Tris HCl</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">BP1757-100</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">EDTA(0.5M) Solution</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">03-500-506</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:88px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">BP166-100&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:88px;">Distributor</td>
			<td style="width:84px;">Catalog#</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:88px;">Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">02-215-365</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:88px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:84px;">5811 000.010</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and extraction of saliva dna for next generation sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

Per determinare i parametri ottimali per il DNA estrazione è stata effettuata una serie di estrazioni di DNA appaiati. Un singolo campione di saliva è stato diviso e ogni porzione sottoposta a uno dei due valori possibili per un dato variabile. Almeno otto repliche di ciascun test accoppiato state eseguite (ad esempio, un singolo campione di saliva è stato aliquotato per testare l&#39;estrazione con e senza iniziale 50 ° C incubazione). L&#39;ottimizzazione è basata su quattro metriche standard: rendimento...

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Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Raccolta ed estrazione di Saliva DNA per il sequenziamento di nuova generazione

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

38.2K Views.  The Research Institute at Nationwide Children's Hospital. DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.