This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).

참고 : 이전 타액 샘플을 제공하기 위해 모든 주제는 전국 어린이 병원에서 사람을 대상으로 치료를위한 가이드 라인을 준수 동의를 통보했다. 1 타액 수집 및 저장 <ol><li> 타액을 수집하기 전에 피사체의 입 피사체가 물로 입을 헹구어 갖는 식사를 피하거나 샘플을 수집하기 전에 30 분 동안 마시는 음식이나 이물질이 없는지 확인합니다. </li><li> 캡 또는 튜브의 내부에 손이 닿지 않도록 확인하는 DNA 안정화 버퍼 (2) 2.5 ㎖로 15 ㎖의 원심 분리기 튜브를 열고 피사체가 완충 용액에 침 2.5 ㎖의 침이있다. 참고 : 타액의 이상 2.5 ml의 수집은 DNA 안정화 버퍼에 샘플의 부족 비율에서 샘플이 저하 될 수 있습니다. 너무 작은 타액을 수집하는 프로토콜에서 예상 수확량을 감소시킬 것이다. 컬렉션 볼륨을 평가하려면, t 측에 번호 그라디언트를 사용그는 튜브. </li><li> 캡을 교체하고, 혼합물을 균질화 될 때까지 반전으로 섞는다. 격렬한 흔들림이 필요하지 않습니다. 단기 기억 또는 장기 저장을위한 4 ° C (&gt; 3 개월)에 대한 RT에서 샘플을 보관합니다. </li></ol> 2 초기 준비 및 세포 용해 <ol><li> 이전 추출을 시작으로, 37 ° C에 수조를 가열하고, 얼음 양동이를 준비합니다. 세 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브는 각 추출 된 샘플에 대해 필요합니다. 세 튜브 세포 단백질 펠렛, 최종 gDNA를 추출하고, 이소프로판올 및 에탄올 상청액을 보유하는 데 사용된다. </li><li> 15 초 후 중간 속도로 소용돌이를 저장에서 샘플 및 반전 샘플을 여러 번 검색합니다. </li><li> 깨끗한 15 ㎖의 원심 분리 관에 시료를 2.5 ㎖에 분배하고, 세포 용해 용액 5 ㎖를 추가합니다. 반전에 의해 시료 50 시간 혼합하고, 30 분 동안 RT에서 배양한다. </li></ol> 3 RNA 제거 <ol><li> 의 RNase 솔의 40 μl를 추가100 ㎎ / ㎖에서의 ution, 그리고 15 분 동안 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 3 분 동안 얼음에 37 ° C의 물을 욕조에서 샘플을 제거하고 멋진. <ol><li> 의 RNase 인큐베이션 후, 프로토콜의 DNA의 재수 단계에서 65 ° C로 수조의 온도를 증가시킨다. </li></ol></li></ol> (4) 단백질 및 지질 제거 <ol><li> , ㎖ / 20 밀리그램에 테 K 솔루션의 50 μl를 추가 반전에 의해 여러 번 혼합과 30 분의 최소 RT 부화. 참고 :이 프로토콜에 대한 가능한 일시 정지 포인트입니다. 추출이 완료 될 때까지 K 테 수용액을 첨가 한 후, 샘플을 4 ° C에서 저장 될 수있다. 최대 24 시간 동안 4 ℃에서 보관 추출 수율 또는 DNA의 품질에 상당한 영향을 미치는 것으로 도시되지 않았다. 이 단계에서 장기 저장이 평가되지 않았습니다. </li><li> 10 분 동안 얼음에 20 고속 초, 및 장소를 적극적 소용돌이 단백질 침전 솔루션의 1.7 ML을 추가합니다. </l난&gt; <li> 샘플은 3000 XG에 10 분, 4 ° C에 10 분, 원심 분리기에 얼음에 냉각 한 후에. 침전 된 단백질은 단단한 펠릿이 계속 형성해야합니다. 펠릿을 꽉 없거나 흐린 용액이 여전히 있다면, 샘플은 5 분 더 얼음 위에서 냉각 할 수 있고, 원심 분리를 반복. 샘플은 단단한 펠릿을 보장하기 위해 얼음에 보관해야합니다. </li></ol> (5) 분리 및 gDNA를 정제 <ol><li> 깨끗한 15 ㎖의 원심 분리 관에, 피펫 아이소 프로필 알코올 5 ㎖ 및 20 ㎎ / ㎖에서 순수 글리코겐 솔루션의 8 μL. </li><li> 침전 된 단백질 펠렛을 남겨두고, 아이소 프로필 알코올과 글리코겐 솔루션을 포함하는 튜브에 4.3 단계에서 gDNA를가 포함 된 상층 액을 붓는다. 상층 액을 추가 한 후, 부드럽게 3000 XG 및 4 ℃에서 30 분 동안 샘플을보기 반전 원심 분리에 의해 50 시간 혼합한다. </li><li> 깨끗한 15 ML 튜브에 천천히 뜨는을 붓고. 상청액을 제거한 후, 70 % 에탄올 1 ㎖를 추가 할수회 천천히 부드럽게 흔들 석출 펠렛 위에 에탄올을 이동하여 펠렛을 씻는다. 튜브에서 에탄올을 유지합니다. </li><li> 초기 세척 한 후, 2000 XG에 1 분, 20 ° C에 대한 샘플을 원심 분리기. 이 원심 분리 단계는 4 ° C에서 20 ° C 중 하나에서 수행 할 수 있습니다. 온도의 큰 영향이 단계에서는 도시되지 않았다. </li><li> 펠렛의 초기 세척 및 원심 분리 후, 천천히 튜브에서 에탄올 세척을 부어 버리고, 다음 단계 5.3 및 5.4를 반복하여 두 번째 세척을 수행합니다. </li><li> 두 번째 세척에서 상층 액의 제거 후, ​​15 분간 자연 건조 펠렛을 할 수 있습니다. <ol><li> 시료를 완전히 건조되지 않은 경우, 또 다른 15 분 동안 공기 건조. </li></ol></li></ol> gDNA를의 6 재수 <ol><li> 샘플이 건조되면, 건조 gDNA를 펠렛을 재수하는 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 300 μl를 추가합니다. </li><li> 중간 속도와 장소에서 5 초 동안 소용돌이 샘플1 시간 동안 65 ° C 온수 목욕입니다. </li><li> 수조에서 샘플을 제거하고 RT에서 O / N을 품어. 참고 : 모든 제품 및 시약 재료 표에 나와있는 사용뿐만 아니라, 표 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies.">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li><li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes.">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li><li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. 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The authors have nothing to disclose.

본 절차는 상당히 DNA의 품질을 손상시키지 않고, 표준 방법에 비해 고 분자량 DNA의 수율이 향상되었다 최적화 DNA 추출 프로토콜이다. 수율을 최대한에 가장 큰 효과 중요한 단계 널리 11을 배포하지 않은 일을 제외하고, 여기에서 검토 게시 된 프로토콜에 비해 에탄올 침전 동안 이상 원심 분리 단계를 포함하는 단계 5.2였다. 이 이상 원심 분리와 관련된 DNA 품질의 변경은 전체 타액 컬렉션...

인간 유전 연구 고품질 DNA를 얻는 것은 질병 유전자 발견 프로세스에 필수적이다. 혈액, 타액 수집보다 더 비싼 또한 침략적인 절차를 요구하고 있지만, 기능 연구에 대한 무한 DNA의 소스 또는 iPSCs로 불후의 세포 라인을 만드는 선호하고, 세포주를 사용할 수없는 경우 때때로 혈액 DNA가 사용됩니다. 그러나, 혈액을 획득하는 훈련 된 phlebotomist을 필요로 피가 침 하나보다 짧은 반감기를 가지고있다. 그것을 수집함으로써 잘 병원 실험실 (2)의 집수 영역을 넘어 전위 피사체 풀을 증가 phlebotomist 필요없이 이메일을 통해 전송 될 수 있기 때문에 타액으로부터 DNA는 얻을 저렴하고 용이하다. 과목 대신 혈액 3, 4의 타액 샘플을 채취 할 수있는 옵션이있을 때 연구 등록이 개선 될 수있다. 수량과 타액에서 DNA의 질에 대한 우려는 우리가 널리 제한되어 있습니다타액 2, 3, 4, 5의 상당한 양을 구하는 않았다 이전 협측 면봉 방법을 통해 DNA 테스트에 대한 밀리리터 당 4.3 × 105 세포의 평균으로, 전체 타액의 적합성을 나타내는 수많은 연구 최근의 연구에도 불구하고, 즉, 6. 겸손한 문학 마이크로 어레이 기반 방식 팔을 포함하여 유전자형 응용 프로그램에 대한 전체 타액 유래 DNA의 적합성을 보여주는 존재하지만 9, 10, 더 연구가 시도되지 않은 차세대 시퀀싱 (NGS). 이 모든 타액 DNA 추출 프로토콜을 최적화하는 목적은 쉽게 일반적인 시약 및 소모품으로 실험실에서 구현 비용 효과적인 방식으로 응용 프로그램에 대한 유전학 수량 및 품질을 최대화하는 것이다. 타액에서 DNA 추출은 여러 절차가 필요합니다 : 1) 수집 및 저장, 2) 세포 용해, 3)의 RNase 처리, 4) 단백질 침전, 5) 에탄올 침전, 6) DNA의 수분 보충을. 기재된 DNA 안정화 버퍼 용액이전에이 적절하게 변경없이 작동합니다. 의 RNase 처리 및 DNA의 수분 보충 단계를 최적화하기위한 어떠한 시도도하지 않았다. 나머지 각 단계의 수율에 영향을 미칠 수있는 여러 변수가 확인되었다. 각 변수를 개별적으로 조작하고, 수율 및 품질의 향상이 통계적으로 평가 하였다. 수율 및 / 또는 DNA의 품질을 향상시키기 위해 도시 된 변수의 최적 값은 최종 프로토콜에 포함되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="260">
	<tbody>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:88px;">15ml Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">12-565-268</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">Cell Lysis Solution</td>
			<td style="width:88px;">Qiagen</td>
			<td style="width:84px;">158908</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:88px;">Sigma</td>
			<td style="width:84px;">P6556</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:88px;">Protein Precipitation Solution</td>
			<td style="width:88px;">Qiagen</td>
			<td style="width:84px;">158912</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">A416-4</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">Glycogen</td>
			<td style="width:88px;">EZ-BioResearch</td>
			<td style="width:84px;">S1003</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">04-355-305</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">Tris-EDTA (TE)</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">BP2473-1</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">NaCl</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">AC194090010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Tris HCl</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">BP1757-100</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:88px;">EDTA(0.5M) Solution</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">03-500-506</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:88px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">BP166-100&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:88px;">Distributor</td>
			<td style="width:84px;">Catalog#</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:88px;">Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:88px;">Fisher</td>
			<td style="width:84px;">02-215-365</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:88px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:84px;">5811 000.010</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and extraction of saliva dna for next generation sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA는 한 쌍의 DNA를 추출하는 일련의이 수행 된 추출을위한 최적의 매개 변수를 결정합니다. 하나의 타액 샘플을 분할하고 각 부분은 주어진 변수에 대한 두 가지 값 중 하나를 사용하여 테스트되었습니다. 각 쌍 테스트 적어도 8 회 반복 (예를 들어, 하나의 타액 샘플과 초기 50 ° C에서 배양없이 모두 추출을 테스트하기 위해 분주했다)을 시행 하였다. 총 DNA 수율, 280 분의 260 값 230분의 260 값...

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Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

차세대 시퀀싱에 대한 수집 및 타액 DNA의 추출

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

38.3K 조회수.  The Research Institute at Nationwide Children's Hospital. DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.