This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).

<ol>
	<li>Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+the+26S+proteasome+by+cryoelectron+tomography.">Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography.</a> Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).</li><li>Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+3-D+structure+of+vimentin+intermediate+filaments+by+cryo-electron+tomography.">Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography.</a> Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).</li><li>Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+clathrin-coated+vesicles:+structural+implications+for+coat+assembly.">Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly.</a> Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+structure+of+the+complete+Treponema+primitia+flagellar+motor.">In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor.</a> Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).</li><li>Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li><li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft.">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).</li><li>Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+a+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -. V., F&#246;rster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Fern&#225;ndez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+electron+tomography.">Computational methods for electron tomography.</a> 43 (10), 1010-1030 (2012).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging).">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells.">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li><li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Gr&#252;newald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomographic+structure+of+an+immunodeficiency+virus+envelope+complex+in+situ.">Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ.</a> PLoS pathogens. 2 (8), (2006).</li><li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers.">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455 (7209), (2008).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).</li><li>Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+the+third+dimension+to+virus+life+cycles:+three-dimensional+reconstruction+of+icosahedral+viruses+from+cryo-electron+micrographs.">Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).</li><li>Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-containing+viruses+with+icosahedrally+symmetric+capsids.">Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).</li><li>Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+measles+virus+reveals+how+matrix+protein+coats+the+ribonucleocapsid+within+intact+virions.">Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).</li><li>Arranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+native+influenza+virion+ribonucleoproteins.">The structure of native influenza virion ribonucleoproteins.</a> Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).</li><li>Karotki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+proteins+assemble+into+a+membrane+scaffold.">Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold.</a> Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).</li><li>Pietil&#228;, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+architecture+unifies+globally+distributed+pleolipoviruses+infecting+halophilic+archaea.">Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea.</a> Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).</li><li>Huiskonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+Tula+hantavirus+suggests+a+unique+assembly+paradigm+for+enveloped+viruses.">Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses.</a> Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).</li><li>Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthobunyavirus+ultrastructure+and+the+curious+tripodal+glycoprotein+spike.">Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike.</a> PLoS pathogens. 9 (5), (2013).</li><li>Maurer, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+Herpesvirus+Fusion+Glycoprotein+B-Bilayer+Complex+Reveals+the+Protein-Membrane+and+Lateral+Protein-Protein+Interaction.">The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction.</a> Structure. 21 (8), 1396-1405 (1993).</li><li>Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+in+a+marine+picoeukaryote+is+a+disordered+assemblage+of+nucleosomes.">Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes.</a> Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).</li><li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination.">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature. 9 (9), 853-854 (2012).</li><li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Faini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structures+of+COPI-coated+vesicles+reveal+alternate+coatomer+conformations+and+interactions.">The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions.</a> Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabs+enable+single+particle+cryoEM+studies+of+small+proteins.">Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins.</a> Structure. 20 (4), 582-592 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> ידע של מבנה ספייק גליקופרוטאין הנגיפי על קרום virion הוא חיוני להבנת שכפול נגיף ופיתוח תרופות לטיפול ולמניעת זיהום. cryo-מיקרוסקופ אלקטרונים בשילוב עם מיצוע חלקיק יחיד התפתח כשיטת המנוצלת ביותר כדי לפתור את המבנים של חלקיקי נגיף עטפו, כוללים הקוצים גליקופרוטאין. עם זאת, שיטה זו מוגבלת לicosahedrally וירוסים סימטריים. כאן, באמצעות היישום של אלקטרון cryo-טומוגרפיה ומיצוע subtomogram בJsubtomo, שהצגנו פרוטוקול כללי לקביעת קוצים גליקופרוטאין על pleomorphic עטף וירוסים שאינם ניתנים לשיטות ביולוגיה אחרות הנוכחיות מבניות. תוצאות הנציג שלנו מראות כי הרזולוציה של שיטה זו היא מספיק כדי לחשוף תובנות ארכיטקטורת תחום, oligomerization, וארגון מסדר גבוה יותר של קוצים גליקופרוטאין על virions שלמה. jove_content &quot;&gt; השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא בניית שני מודלים התחלה אמינות שאינם תלויים מבחינה סטטיסטית זה מזה ביצוע. מוצלח של שלב זה מבוסס על ההנחה כי הקוצים גליקופרוטאין הם מספיק גדולים ולא עמוסים אחד נגד השני בחוזקה רבה מדי, כדי שקוצים בודדים יכול יוכר מבחינה ויזואלית וידני הרים בtomograms, ושני מודלים עצמאיים בממוצע. אם זה לא ריאלי, יכול להיות ניסו שני שינויים בפרוטוקול. ראשית, ניתן לבנות שני מודלים אקראיים עצמאיים על ידי ההגדרה ראשונה שתי תת קבוצות של subtomograms אקראיות ולאחר מכן ממוצע subtomograms בתוך תת אלה 30. שני, אם מבנה של ספייק המבודד כבר נגזר באמצעים אחרים, למשל על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן, ניתן להשתמש בו כמודל התחלה. עם זאת, יש להקפיד לנמוך תעבור סינון מודל זה באמצעות חתך ברזולוציה נמוכה (50-70 א), כשני מודלים וכתוצאה מכך בסיבוב הבא של עידון יהיהלהיות עצמאי מבחינה סטטיסטית רק מעבר להחלטה זו. בשל אזהרה זו, הגישה לשעבר מומלצת. הרזולוציה השגה מפרוטוקול זה תלוי בארבעה גורמים עיקריים: א. אסטרטגיה של איסוף נתונים והאיכות של נתוני הקלט, ii. מספר subtomograms, iii. דיוק יישור של subtomograms, וiv. ההטרוגניות של המבנים. בעוד המגבלה הראשונה ושנייה ניתן להתגבר במידה רבה על ידי שימוש בגלאים גבוהים אות לרעש ישירים אלקטרונים בשילוב עם CTF תיקן טומוגרפיה ואיסוף נתונים אוטומטי, דיוק היישור מושפע יותר על ידי הגודל וצורה של המבנה של העניין עצמו. בעת החלת פרוטוקול זה על קוצים קטנים חסרי מאפיינים בולטים, זה עשוי להיות יתרון לאגד שברי Fab לספייק כדי לשפר את דיוק היישור וכך החלטה ביום 31 ב. לבסוף, תצורות מרובות תערוכה אם המבנים להיות בממוצע, משנה tomogrשיטות סיווג בבוקר עשויות לשמש לממוצע תצורות שונות בנפרד. לשם כך, Jsubtomo משתלב עם חבילת דינמו, מציע subtomogram החזק סיווג 9. הפרוטוקול לעיל הוא משלים לקריסטלוגרפיה רנטגן של גליקופרוטאינים נגיפיים מבודדים. יכולים להיות מצוידים מבנים קריסטלוגרפיים לממוצעים תת tomogram להשיג את הכיוון המדויק של גליקופרוטאין ביחס לקרום virion. יישום של מתודולוגיה זו, ללא ספק, ימשיך לשפוך אור על מבנה נגיף עטוף וpathobiology.

cryo-טומוגרפיה של האלקטרון היא טכניקת הדמיה cryo-מיקרוסקופ אלקטרונים המאפשרת החישוב של שחזור תלת ממדים (3D) של דגימות ביולוגיות מורכבות. דגימות מתאימות נעות בין מתחמים מטוהרים macromolecular 1, חוטים 2, שלפוחית ​​מצופה 3, ווירוסים קרום pleomorphic 4 לתאים פרוקריוטים כל 5 ואפילו אזורים דקים של תאים האיקריוטים כל 6. בעקבות איסוף הנתונים של הטיה סדרה, כרכי טומוגרפיה 3D, או tomograms, ניתן לחשב באמצעות מספר חבילות תוכנה שהוקמו, כולל 7 Bsoft וIMOD 8. שני היבטים חלק מהלימוד של דגימות ביולוגיות על ידי גבול cryo-טומוגרפיה של אלקטרון הפרשנות הביולוגית של הכרכים טומוגרפית המקבילים. ראשית, בשל המינון המוגבל האלקטרון שיכול להיות מיושם על חומרים ביולוגיים לפני הצגת נזקי קרינה משמעותיות, signaיחסי ליטר לרעש בנתונים טומוגרפיה הם בדרך כלל נמוכים מאוד. שני, כתוצאה ממדגם מצומצם גיאומטריה הטיה במהלך איסוף הנתונים, כמה תצוגות של האובייקט להישאר נעדרו, שמוביל לחפץ שנקרא &#39;טריז חסר&#39; בטומוגרפיה הנפח. עם זאת, שניהם של מגבלות אלה ניתן להתגבר אם טומוגרפיה הנפח מכיל חוזר על מבנים זהים, כגון מתחמי macromolecular, שיכול להיות בהצלחה בממוצע 9-12. לפני ממוצע של מבנים משחזורי tomogram, אובייקטים של עניין יש למצוא ומיושרים לאותו הכיוון. איתור מבנים כאלה עשויים להיות מושגת על ידי מתאם צולב של מבנה תבנית בטומוגרפיה עוצמת הקול באמצעות גישה המכונה לעתים קרובות כתבנית תואמת 13. התבנית המשמשת בתהליך התאמה זה יכול לנבוע מהאלקטרון cryo-מיקרוסקופיה או cryo-טומוגרפיה של אלקטרון בשילוב עם שחזור 3D, או שזה יכול להיות מפת צפיפות מדומה ממבנה אטומי. כמה חבילות חישובית פותחו כדי לבצע משימות אלה 11. ממוצע של קוצים גליקופרוטאין של וירוסי קרום, כגון HIV-1, הייתה גישה מוצלחת במיוחד לחקר המבנה שלהם 14-16. הבנה של המבנה היא חלק בלתי נפרד לחשיפת שני הבסיס המולקולרי של אינטראקציות-מארח וירוס ומנחה פיתוח עיצוב אנטי וחיסון. בעוד קריסטלוגרפיה macromolecular היא הטכניקה שבה נקטה ברזולוציה גבוהה (בדרך כלל טובה יותר מאשר 4 א) ניתוח מבני של גליקופרוטאינים נגיפיים בודדים והמתחמים שלהם, מבני רנטגן וכתוצאה משיטה זו הם של חלבונים מבודדים מהסביבה הטבעית הקרומית על virion . לפיכך, פרטים חשובים כגון ארכיטקטורה גבוהה יותר בסדר גודל של גליקופרוטאינים נגיפיים, בהקשר של virion, יישארו חסרים. מצד השני, אלקטרון cryo-מיקרוסקופיה ושחזור חלקיק בודדשל וירוסים עטופים כולו מוגבל לvirions עם הסימטריה icosahedral 17,18. cryotomography אלקטרונים בשילוב עם יישור משנה נפח וכך יצא כטכניקה משלימה המאפשרת המחקר של קוצים גליקופרוטאין של, וירוסי pleomorphic בצורה סדירה באתר. פיתחנו תוכנה בשם Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) לצורך זיהוי, היישור, והמיצוע של כרכים תת טומוגרפית. Jsubtomo נוצל בקביעת המבנה של מספר המבנים התאיים ונגיפיים 19-26. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט, המאפשר למבני ספייק נגיפי-משטח הנחישות. כדי לעקוף את יתר העידון של מבנים בממוצע על ידי קישור בין רעש, ערכת העידון &quot;תקן זהב&quot; תאומץ 10,27. לבסוף, אסטרטגיות להדמיה ופרשנות של תוצאות אופייניות הם דנו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:184px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jsubtomo (ver 1.3.1)</td>
			<td style="width:184px;">University of Oxford</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bsoft (ver 1.8.7)</td>
			<td style="width:184px;">NIAMS, NIH</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>bsoft.ws</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:184px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

averaging of viral envelope glycoprotein spikes from electron cryotomography reconstructions using jsubtomo

וירוסים אפפו לנצל גליקופרוטאינים קרום על פני השטח שלהם לתווך כניסה לתאי מארח. ניתוח מבני תלת ממדי של &quot;הקוצים&quot; גליקופרוטאין אלה הוא לעתים קרובות מאתגר מבחינה טכנית אך חשוב להבנת הפתוגנזה נגיפית ובתכנון תרופות. הנה, פרוטוקול מוצג לקביעת מבנה ספייק נגיפית באמצעות מיצוע חישובית של נתונים cryo-טומוגרפיה של אלקטרון. cryo-טומוגרפיה של האלקטרון היא טכניקה במיקרוסקופ אלקטרונים המשמשת לחישוב שחזורים תלת ממדיים טומוגרפית נפח, או tomograms, של דגימות ביולוגיות pleomorphic כגון וירוסי קרום במצב כמעט טבעי, קפוא התייבשות. tomograms אלה לחשוף מבנים של עניין בשלושה ממדים, אם כי ברזולוציה נמוכה. מיצוע חישובית של כרכי משנה, או תת tomograms, יש צורך לקבל פירוט ברזולוציה גבוה יותר של חזרה על מוטיבים מבניים, כגון קוצים גליקופרוטאין ויראלי. גישה חישובית מפורטת לעלייgning וממוצע משנה tomograms באמצעות חבילת תוכנת Jsubtomo מתוארת. גישה זו מאפשרת הדמיה של המבנה של קוצים גליקופרוטאין נגיפיים לרזולוציה בטווח של 20-40 A ומחקר של חקר אינטראקציות מסדר גבוהות יותר ספייק לספייק על קרום virion. תוצאות אופייניות מוצגות לוירוס Bunyamwera, וירוס עטף מהמשפחה Bunyaviridae. משפחה זו היא קבוצה מבנית מגוונת של פתוגנים מהווים איום על בריאות אדם ובעלי חיים.

אנו מדגימים את היישום של זרימת העבודה מיצוע משנה tomogram שתוארה לעיל למורכב מעטפת גליקופרוטאין של וירוס Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) באמצעות נתונים שפורסמו בעבר להגדיר 24. פרמטרים איסוף נתונים ועידונם מופיעים בטבלה 1. tomogram נציג אחד שמוצג באיור 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פרמטר (יחידה) </td><td> ערך </td></tr><tr><td> איסוף נתונים </td><td></td></tr><tr><td> מתח (ק) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> הגדלה מכוילת (X) </td><td> 111,000 </td></tr><tr><td> גודל פיקסל (א) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> מינון משוער (ה - / 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus (מיקרומטר) </td><td> 4.0-4.5 </tד&gt; </tr><tr><td> אפס CTF הראשון (א) </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> טווח הטיה (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> דגימת הטיה (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> נתונים ועידון </td><td></td></tr><tr><td> Tomograms </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virions </td><td> 29 </td></tr><tr><td> זרעים לvirion </td><td> 106 </td></tr><tr><td> מספר כולל של זרעים </td><td> 3,074 </td></tr><tr><td> Spikes זוהה </td><td> 1,346 </td></tr><tr><td> קוצים לאחר הסרת חפיפות </td><td> 1,401 </td></tr><tr><td> קוצים לאחר בחירה מבוססת חוצה קשר </td><td> 1,022 </td></tr><tr><td> Spikes נכלל בממוצע הסופי </td><td> 1,022 </td></tr><tr><td> סימטריה </td><td> C3 </td></tr><tr><td> דגימה הזוויתי (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> רזולוציהטווח שימוש בעידון (א) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> אומדן החלטה סופי ב (א) </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: איסוף נתונים Bunyamwera וסטטיסטיקת עידון. CTF, פונקצית העברת ניגוד. ב מחושב באמצעות מתאם פגז פורייה בין שני מבנים באופן עצמאי מעודנים בסף של 0.143. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2:. Slice דרך tomogram של virions Bunyamwera כמה מבטי צד ספייק ניכרו בפריפריה של כל virion מצוינים עם ראשי חץ. Tomogram היה נמוך לעבור סינון ל60 א. סרגל קנה מידה 100 ננומטר. ראשית, אנו מעודנים מודל ראשוני באמצעות 205 קוצים ידני הרימו ( <strong&gt; איור 3). סימטריה משולשת של המרכז ביותר ספייק הייתה ברורה מבלי להחיל כל סימטריה (איור 3 ב) והוטלה בסיבובים הבאים של עידון (איור 3 ג). לאיתור כל הקוצים באופן אוטומטי על פני שטח virion, אנחנו שנוצרנו 106 זרעים עבור כל virion ברדיוס של 43 ננומטר וריווח של 20 מעלות (איור 4 א) וiteratively מעודנים עמדותיהם ביחס לקרום (איור 4). <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3: עידון של מבנה התבנית הראשוני. () Cylindrically ממוצע התבנית (C100) הבנויה מתפקידים שהוגדרו באופן ידני של קוצים. (B) צפיפות פי ממוצע לאחר חמישה סבבים של עידון ללא כל סימטריה (C1) שהוטלה מציגה עלייה חדה בפי שלושהתכונות סימטריות. הרזולוציה של המודל היא 48 א. (C) הממוצע של ספייק הוחלט ב41 Å לאחר חמישה סבבים של עידון עם סימטריה פי שלוש. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4:. עידון של הזרעים AB) קבוצת משנה של זרעים לפני () ועידון אחרי (B) מוצגים בצפיפות virion אחד מהאיור 2 זרעים ב( ב) היו מבוססים על צולב בהתאמה צבעים. מקדמי מתאם (כחול, מתאם נמוך; מתאם גבוה אדום,). התיקונים הטובים ביותר התאמתו גליקופרוטאין ספייק (75% העליונים לאחר הסרת חפיפה; ~ 1,000 הקוצים) ששימשו בחישוב ממוצע הסופי. הממוצע הוחלט 35 החלטה (איור 5). זה חשף מבנה ספייק trimeric באמצע, בבנוסף לכמה תרומה משישה קוצים הסמוכות. מודלים מורכבים של virions, מחושבת על ידי הצבת המבנה בעמדות הידועות, חשפו מיקום של הקוצים על פני השטח virion (איור 6 א). מדי פעם, טלאים הורו באופן מקומי של קוצים ניכרו (איור 6). <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> איור 5: מבנה מעודן של תיקון של שכבת ספייק גליקופרוטאין לאחר התאמת תבנית. (AB) שתי מפות &quot;אפילו &#39;ו&#39; מוזר &#39;, שחזרו משני חצאים של הנתונים מוצגים. שתי מפות להראות מידה יוצאת דופן של דמיון, המאמתות את validness של הגישה. האורינטציה סביב הציר הארוך ספייק היא שונה כשתי המפות שוחזרו באופן עצמאי באופן מלא מכל אחר. (C) הממוצע של שתי המפות מוצג בההחלטה הסופית של 35 א. <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> איור 6: מיקום של הקוצים על virion Bunyamwera. מודל משולב לvirion (). צפו בוקטורים (מקלות) מצביעים על האוריינטציות של הקוצים. צבעים מצביעים על המתאם הצולב בין כל ספייק ומבנה התבנית (כחול, מתאם נמוך; מתאם גבוה אדום,). (ב) תקריב של תיקון מסודר של קוצים.

Watch this Scientific Journal Video about Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo at JoVE.com

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

ממוצע של ויראלי מעטפת גליקופרוטאין Spikes מאלקטרוני Cryotomography שחזור באמצעות Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

averaging-viral-envelope-glycoprotein-spikes-from-electron

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K Views.  University of Oxford. An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Video: Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...