This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).

<ol>
	<li>Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+the+26S+proteasome+by+cryoelectron+tomography.">Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography.</a> Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).</li><li>Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+3-D+structure+of+vimentin+intermediate+filaments+by+cryo-electron+tomography.">Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography.</a> Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).</li><li>Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+clathrin-coated+vesicles:+structural+implications+for+coat+assembly.">Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly.</a> Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+structure+of+the+complete+Treponema+primitia+flagellar+motor.">In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor.</a> Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).</li><li>Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li><li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft.">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).</li><li>Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+a+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -. V., F&#246;rster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Fern&#225;ndez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+electron+tomography.">Computational methods for electron tomography.</a> 43 (10), 1010-1030 (2012).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging).">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells.">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li><li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Gr&#252;newald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomographic+structure+of+an+immunodeficiency+virus+envelope+complex+in+situ.">Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ.</a> PLoS pathogens. 2 (8), (2006).</li><li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers.">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455 (7209), (2008).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).</li><li>Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+the+third+dimension+to+virus+life+cycles:+three-dimensional+reconstruction+of+icosahedral+viruses+from+cryo-electron+micrographs.">Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).</li><li>Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-containing+viruses+with+icosahedrally+symmetric+capsids.">Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).</li><li>Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+measles+virus+reveals+how+matrix+protein+coats+the+ribonucleocapsid+within+intact+virions.">Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).</li><li>Arranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+native+influenza+virion+ribonucleoproteins.">The structure of native influenza virion ribonucleoproteins.</a> Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).</li><li>Karotki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+proteins+assemble+into+a+membrane+scaffold.">Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold.</a> Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).</li><li>Pietil&#228;, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+architecture+unifies+globally+distributed+pleolipoviruses+infecting+halophilic+archaea.">Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea.</a> Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).</li><li>Huiskonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+Tula+hantavirus+suggests+a+unique+assembly+paradigm+for+enveloped+viruses.">Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses.</a> Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).</li><li>Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthobunyavirus+ultrastructure+and+the+curious+tripodal+glycoprotein+spike.">Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike.</a> PLoS pathogens. 9 (5), (2013).</li><li>Maurer, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+Herpesvirus+Fusion+Glycoprotein+B-Bilayer+Complex+Reveals+the+Protein-Membrane+and+Lateral+Protein-Protein+Interaction.">The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction.</a> Structure. 21 (8), 1396-1405 (1993).</li><li>Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Faini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structures+of+COPI-coated+vesicles+reveal+alternate+coatomer+conformations+and+interactions.">The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions.</a> Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabs+enable+single+particle+cryoEM+studies+of+small+proteins.">Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins.</a> Structure. 20 (4), 582-592 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> O conhecimento da estrutura de glicoproteína pico viral no virião membrana é essencial para a replicação do vírus a compreensão e desenvolver agentes terapêuticos para tratar e prevenir a infecção. Electron crio-microscopia combinado com média única partícula surgiu como o método mais utilizado para resolver as estruturas de partículas de vírus envelopados, incluindo os picos de glicoproteínas. No entanto, este método está limitado a icosahedrally vírus simétricas. Aqui, através da aplicação da eletrônica de crio-tomografia e subtomogram médias na Jsubtomo, nós descrevemos um protocolo geral para determinar pontos de glicoproteínas em pleomorphic envolto vírus que não são passíveis de outros métodos de biologia estrutural atuais. Nossos resultados representativos demonstrar que a resolução deste método é suficiente para revelar insights sobre arquitetura de domínio, oligomerização e maior organização a fim de spikes glicoproteína em virions intactas. jove_content &quot;&gt; O passo mais importante dentro deste protocolo está construindo dois modelos de partida de confiança que são estatisticamente independentes uma da outra execução. bem-sucedida desta etapa pressupõe que os picos de glicoproteínas são suficientemente grandes e não embalados uns contra os outros com muita força, de modo que os picos individuais podem ser visualmente reconhecido e manualmente pegou no tomografias, e dois modelos independentes média. Se isso não for possível, duas modificações no protocolo pode ser tentada. Primeiro, dois modelos aleatórias independentes pode ser construído definindo primeiro dois subconjuntos aleatórios de subtomograms e depois média das subtomograms dentro destes subconjuntos 30. Em segundo lugar, se uma estrutura do pico isolado foi obtido por outros meios, por exemplo por cristalografia de raios-X, que pode ser utilizado como um modelo de partida. No entanto, deve ser tomado cuidado para baixo teor Filtro passa este modelo usando uma baixa resolução de corte (50-70 Å), como os dois modelos resultantes na próxima rodada de refinamento iráser estatisticamente independentes para além desse resolução. Devido a esta ressalva, é recomendável a abordagem anterior. A resolução obtida a partir deste protocolo depende de quatro fatores principais: i. estratégia de recolha de dados e a qualidade dos dados de entrada, ii. número das subtomograms, iii. a precisão do alinhamento das subtomograms, e iv. heterogeneidade das estruturas. Embora a primeira e segunda limitação pode ser largamente ultrapassado usando detectores de sinal de alta-ruído directa de electrões, combinados com CTF corrigido tomografia e recolha automática de dados, a precisão do alinhamento é mais afectada pelo tamanho e forma da estrutura do próprio interesse. Ao aplicar este protocolo em pequenas pontas que faltam características proeminentes, pode ser vantajoso para ligar fragmentos Fab para o pico para melhorar a precisão do alinhamento e, portanto, resolução 31. Finalmente, se as estruturas a serem médios exibem várias conformações, sub-Tomogrmétodos de classificação am pode ser utilizado para calcular a média conformações diferentes separadamente. Para o efeito, Jsubtomo integra com o pacote Dynamo, oferecendo classificação poderoso subtomogram 9. O protocolo anterior é complementar a cristalografia de raios-X de glicoproteínas virais isoladas. Estruturas cristalográficas pode ser montada em médias de sub-tomogram para obter a orientação precisa da glicoproteína com respeito à membrana viral. A aplicação desta metodologia, sem dúvida, continuar a lançar luz sobre a estrutura do vírus envelopado e pathobiology.

Crio-tomografia de electrões é uma técnica de imagiologia de electrões crio-microscopia permitindo o cálculo de uma (3D) a reconstrução tridimensional de amostras biológicas complexas. Amostras adequadas variam de complexos purificados macromoleculares 1, filamentos 2, vesículas revestidas 3 e vírus membrana pleomórficos 4 para células procariotas todo 5 e até áreas finas de células eucarióticas inteiros 6. Após a coleta de dados de uma série de inclinação, os volumes de tomografia 3D, ou tomografias, pode ser calculado utilizando vários pacotes de software estabelecidos, incluindo bsoft 7 e 8 Imod. Dois aspectos inerentes ao estudo de amostras biológicas por limite de electrões crio-tomografia a interpretação biológica dos volumes tomográficos correspondentes. Em primeiro lugar, devido à dose de electrões limitado que pode ser aplicado a materiais biológicos antes de introduzir os danos da radiação significativa, signal-ruído proporções em dados tomográficos são tipicamente muito baixos. Em segundo lugar, como resultado da geometria inclinação amostra limitada durante a coleta de dados, alguns pontos de vista do objeto permanecer ausente, levando a uma chamada artefato &#39;cunha perdido &quot;no volume tomográfica. No entanto, ambas as limitações podem ser superadas se o volume tomográfica contém repetição de estruturas idênticas, tais como complexos macromoleculares, que pode ser com sucesso em média 9-12. Antes da média de estruturas de reconstruções tomogram, objetos de interesse devem ser encontrados e alinhado com a mesma orientação. A localização das referidas estruturas pode ser obtida por correlação cruzada de uma estrutura de modelo no volume de tomografia por uma abordagem muitas vezes referida como modelo correspondente 13. O molde utilizado neste processo de harmonização pode ser derivada a partir de electrões ou microscopia crio-electrão crio-tomografia combinada com a reconstrução em 3D, ou pode ser um mapa de densidade de simuladouma estrutura atômica. Vários pacotes computacionais foram desenvolvidos para realizar estas tarefas 11. Calculando a média dos picos de glicoproteína do vírus de membrana, tal como o HIV-1, tem sido uma abordagem particularmente bem sucedido para o estudo da sua estrutura 14-16. Uma compreensão da estrutura é parte integrante para revelar tanto a base molecular das interações vírus-hospedeiro e orientar o desenvolvimento do projeto antiviral e vacina. Enquanto cristalografia de macromoléculas é a técnica preferida para a alta resolução (geralmente melhor do que 4 Â) a análise estrutural de glicoproteínas virais individuais e os seus complexos, as estruturas de raios-X resultantes deste método são de proteínas isoladas a partir do ambiente natural do membranoso virião . Deste modo, detalhes importantes, tais como a arquitectura de ordem superior de glicoproteínas virais, no contexto do virião, permanecem escassos. Por outro lado, de electrões e microscopia crio-reconstrução de partícula únicade vírus envelopados inteiras se restringe a partículas virais com simetria icosaédrica 17,18. Electron cryotomography combinado com alinhamento sub-volumes foi assim que surgiu como uma técnica complementar que permite o estudo de spikes glicoproteína de forma irregular, vírus pleomórficos in situ. Nós desenvolvemos software chamado Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) para a detecção, alinhamento e nivelamento de sub-volumes tomográficas. Jsubtomo tem sido utilizado na determinação da estrutura de um número de estruturas virais e celulares 19-26. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado, que permite a determinação de estruturas de pico viral de superfície. Para contornar o excesso de refinamento de estruturas em média, correlacionando ruído, o esquema de refinamento &#39;padrão-ouro&#39; é adotado 10,27. Por fim, são discutidas estratégias para a visualização e interpretação dos resultados típicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:184px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jsubtomo (ver 1.3.1)</td>
			<td style="width:184px;">University of Oxford</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bsoft (ver 1.8.7)</td>
			<td style="width:184px;">NIAMS, NIH</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>bsoft.ws</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:184px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

averaging of viral envelope glycoprotein spikes from electron cryotomography reconstructions using jsubtomo

Vírus envelopados utilizar glicoproteínas da membrana na sua superfície para mediar a entrada nas células hospedeiras. Análise estrutural tridimensional dessas glicoproteína &#39;picos&#39; é muitas vezes um desafio técnico, mas importante para a compreensão da patogênese viral e na concepção de medicamentos. Aqui, um protocolo é apresentado para a determinação da estrutura viral pico através da média computacional de dados crio-tomografia eletrônica. Crio-tomografia eletrônica é uma técnica em microscopia eletrônica utilizada para obter reconstruções tridimensionais de tomografia de volume, ou tomografias, de espécimes biológicos pleomórficos, como vírus de membrana em um estado quase original, congelados hidratado. Estas radiografias revelam estruturas de interesse em três dimensões, embora com baixa resolução. Média Computacional de sub-volumes, ou sub-tomografias, é necessário obter maior detalhe resolução de repetir motivos estruturais, tais como picos de glicoproteínas virais. A abordagem computacional detalhado para aligning média e sub-tomografias utilizando o pacote de software Jsubtomo está delineado. Esta abordagem permite a visualização da estrutura de picos de glicoproteínas virais para uma resolução da ordem de 20-40 Å e estudo de estudo de interacções de ordem superior pico-a-pico na membrana viral. Os resultados típicos são apresentados por vírus Bunyamwera, um vírus com invólucro a partir da família Bunyaviridae. Esta família é um grupo estruturalmente diverso de patógenos que representam uma ameaça para a saúde humana e animal.

Nós demonstrar a aplicação do fluxo de trabalho média sub-tomograma descrito acima para a glicoproteína do envelope do vírus complexo Bunyamwera (Orthobunyavirus Bunyaviridae) utilizando dados publicados anteriormente definido 24. Recolha de dados e refinamento parâmetros listados na Tabela 1. Uma tomografia representativo é mostrado na Figura 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parâmetro (unidade) </td><td> Valor </td></tr><tr><td> A coleta de dados </td><td></td></tr><tr><td> Tensão (kV) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Ampliação calibrado (X) </td><td> 111000 </td></tr><tr><td> O tamanho do pixel (Å) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> Dose estimada (e - / a 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus (im) </td><td> 4,0-4,5 </td&gt; </tr><tr><td> Primeiro de zero CTF (A) um </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> Faixa de inclinação (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> Amostragem Tilt (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Dados e requinte </td><td></td></tr><tr><td> Tomogramas </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virions </td><td> 29 </td></tr><tr><td> Sementes por virion </td><td> 106 </td></tr><tr><td> Número total de sementes </td><td> 3074 </td></tr><tr><td> Spikes detectado </td><td> 1346 </td></tr><tr><td> Spikes após eliminar sobreposições </td><td> 1401 </td></tr><tr><td> Spikes após seleção com base correlação cruzada </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> Spikes incluídos na média final </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> Simetria </td><td> C3 </td></tr><tr><td> A amostragem angular (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Resoluçãogama utilizada no refinamento (Å) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> Estimativa resolução final (a) b </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: coleta de dados e estatísticas Bunyamwera refinamento. FTC, a função de transferência de contraste. b Calculado utilizando a correlação de shell Fourier entre duas estruturas de forma independente refinados em um limite de 0.143. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2:. Fatia através de uma tomografia de viriões Bunyamwera Diversas vistas laterais pico evidente na periferia de cada vírus são indicadas por pontas de seta. A tomografia tem sido baixa-pass filtrada a 60 Å. A barra de escala de 100 nm. Primeiro, temos refinado um modelo inicial usando 205 pontos escolhidos manualmente ( <strong&gt; A Figura 3). Simetria Trina do centro-maior pico foi evidente, sem aplicar qualquer simetria (Figura 3B) e foi imposta nas rodadas posteriores de refinamento (Figura 3C). Para a detecção de todos os picos automaticamente sobre as superfícies de virião, geramos 106 sementes para cada virião no raio de 43 nm e um espaçamento de 20 graus (Figura 4A) e iterativamente refinado suas posições em relação à membrana (Figura 4B). <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: O refinamento da estrutura do modelo inicial. (A) cilíndrica média (C100) modelo construído a partir de posições definidas manualmente de spikes. (B) densidade médio depois de cinco rodadas de refinamento sem qualquer simetria (C1) imposta exibe um pico com três dobrascaracterísticas simétricas. A resolução do modelo é de 48 Å. (C) Média do pico foi resolvido em 41 Å após cinco rodadas de refinamento com simetria tripla. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4:. Refinamento das sementes AB) Um subconjunto de sementes antes (A) e após (B) requinte são mostrados em uma densidade virion na Figura 2 Sementes em (B) foram codificados por cores com base no respectivo cruzada. coeficientes de correlação (azuis, baixa correlação; vermelho, alta correlação). Os melhores correlacionando glicoproteína manchas Spike (75% superior após eliminar sobreposições; ~ 1.000 pontos) foram utilizados para calcular a média final. A média foi resolvido a 35 uma resolução (Figura 5). Ele revelou uma estrutura pico trimeric no meio, emAlém de alguma contribuição de seis picos vizinhos. Modelos compostos dos viriões, calculadas através da colocação da estrutura nas posições conhecidas, revelado colocação dos espigões na superfície do virião (Figura 6A). Ocasionalmente, patches de ordenados localmente de spikes eram evidentes (Figura 6B). <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5: estrutura refinada de um patch da camada de glicoproteína pico após casamento de modelos. (AB) Dois mapas &#39;even&#39; e &#39;estranho&#39;, de reconstrução de duas metades de os dados são mostrados. Os dois mapas mostram um notável grau de similaridade, verificando a válido até da abordagem. A orientação em torno do eixo longitudinal é diferente espiga como os dois mapas foram reconstruídos completamente independente um do outro. (C) Média dos dois mapas é mostrado naa resolução final de 35 Å. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6: Colocação dos picos sobre o virion Bunyamwera. (A) modelo composta de um viral. Exibir vetores (varas) indicam as orientações das espigas. As cores indicam a correlação cruzada entre cada ponto ea estrutura do modelo (azul, baixa correlação; vermelho, alta correlação). (B) Um close-up de um tapa-ordenada de spikes.

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Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Calculando a média de Viral glicoproteína do envelope Spikes de Electron Cryotomography reconstruções com Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K visualizações.  University of Oxford. An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.