This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).

<ol>
	<li>Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+the+26S+proteasome+by+cryoelectron+tomography.">Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography.</a> Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).</li><li>Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+3-D+structure+of+vimentin+intermediate+filaments+by+cryo-electron+tomography.">Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography.</a> Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).</li><li>Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+clathrin-coated+vesicles:+structural+implications+for+coat+assembly.">Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly.</a> Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+structure+of+the+complete+Treponema+primitia+flagellar+motor.">In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor.</a> Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).</li><li>Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li><li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft.">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).</li><li>Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+a+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -. V., F&#246;rster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Fern&#225;ndez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+electron+tomography.">Computational methods for electron tomography.</a> 43 (10), 1010-1030 (2012).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging).">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells.">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li><li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Gr&#252;newald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomographic+structure+of+an+immunodeficiency+virus+envelope+complex+in+situ.">Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ.</a> PLoS pathogens. 2 (8), (2006).</li><li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers.">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455 (7209), (2008).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).</li><li>Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+the+third+dimension+to+virus+life+cycles:+three-dimensional+reconstruction+of+icosahedral+viruses+from+cryo-electron+micrographs.">Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).</li><li>Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-containing+viruses+with+icosahedrally+symmetric+capsids.">Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).</li><li>Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+measles+virus+reveals+how+matrix+protein+coats+the+ribonucleocapsid+within+intact+virions.">Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).</li><li>Arranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+native+influenza+virion+ribonucleoproteins.">The structure of native influenza virion ribonucleoproteins.</a> Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).</li><li>Karotki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+proteins+assemble+into+a+membrane+scaffold.">Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold.</a> Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).</li><li>Pietil&#228;, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+architecture+unifies+globally+distributed+pleolipoviruses+infecting+halophilic+archaea.">Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea.</a> Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).</li><li>Huiskonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+Tula+hantavirus+suggests+a+unique+assembly+paradigm+for+enveloped+viruses.">Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses.</a> Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).</li><li>Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthobunyavirus+ultrastructure+and+the+curious+tripodal+glycoprotein+spike.">Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike.</a> PLoS pathogens. 9 (5), (2013).</li><li>Maurer, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+Herpesvirus+Fusion+Glycoprotein+B-Bilayer+Complex+Reveals+the+Protein-Membrane+and+Lateral+Protein-Protein+Interaction.">The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction.</a> Structure. 21 (8), 1396-1405 (1993).</li><li>Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+in+a+marine+picoeukaryote+is+a+disordered+assemblage+of+nucleosomes.">Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes.</a> Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).</li><li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination.">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature. 9 (9), 853-854 (2012).</li><li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Faini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structures+of+COPI-coated+vesicles+reveal+alternate+coatomer+conformations+and+interactions.">The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions.</a> Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabs+enable+single+particle+cryoEM+studies+of+small+proteins.">Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins.</a> Structure. 20 (4), 582-592 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Connaissance de la structure virale de pointes de glycoprotéines de la membrane du virion est essentielle pour comprendre la réplication du virus et le développement de thérapies pour traiter et prévenir l&#39;infection. Cryo-microscopie électronique combinée avec une moyenne de particule est apparue comme la méthode la plus utilisée pour résoudre les structures de particules virales enveloppées, y compris les pointes de glycoprotéines. Cependant, cette méthode est limitée aux virus icosahedrally symétriques. Ici, grâce à l&#39;application de cryo-tomographie et subtomogram moyenne dans Jsubtomo, nous avons défini un protocole général pour la détermination de pointes de glycoprotéines sur pléomorphique virus enveloppés qui ne se prêtent pas à d&#39;autres méthodes structurelles en cours de biologie. Nos résultats représentatifs montrent que la résolution de cette méthode est suffisante pour révéler un aperçu de l&#39;architecture de domaine, oligomérisation, et plus l&#39;organisation de l&#39;ordre de pointes de glycoprotéines sur des virions intacts. jove_content &quot;&gt; L&#39;étape la plus critique dans le protocole construit deux modèles de départ fiables qui sont statistiquement indépendantes l&#39;une de l&#39;autre. exécution réussie de cette étape suppose que les pointes de glycoprotéine sont suffisamment importants et non emballés contre l&#39;autre trop serré, de sorte que les pics individuels peuvent visuellement reconnus et repris manuellement dans le tomographies, et deux modèles indépendants moyenne. Si cela n&#39;est pas possible, deux modifications du protocole peuvent être tentées. Tout d&#39;abord, deux modèles aléatoires indépendantes peuvent être construits en définissant d&#39;abord deux sous-ensembles aléatoires de subtomograms puis la moyenne des subtomograms 30 à l&#39;intérieur de ces sous-ensembles. D&#39;autre part, si la structure de la pointe isolée a été extraite par d&#39;autres moyens, par exemple par cristallographie aux rayons X, il peut être utilisé en tant que modèle de départ. Cependant, il faut veiller à faible ou filtre passe-bas ce modèle en utilisant un seuil de faible résolution (50-70 Å), que les deux modèles qui en résultent dans la prochaine ronde de raffinement serastatistiquement indépendantes qu&#39;au-delà de cette résolution. En raison de cette mise en garde, la première approche est recommandée. La résolution obtenue à partir de ce protocole dépend de quatre facteurs principaux: i. stratégie de collecte de données et de la qualité des données d&#39;entrée, ii. nombre des subtomograms, iii. la précision de l&#39;alignement des subtomograms, et iv. hétérogénéité des structures. Alors que la première et deuxième limitation peut être en grande partie résolu par l&#39;aide de détecteurs de haute signal-bruit directs électroniques combinés avec la FCE corrigé la tomographie et la collecte de données automatisée, la précision de l&#39;alignement est en outre affectée par la taille et la forme de la structure d&#39;intérêt lui-même. Lors de l&#39;application de ce protocole sur les petites pointes qui n&#39;ont pas traits saillants, il peut être avantageux de lier des fragments Fab à la pointe pour améliorer la précision d&#39;alignement et donc la résolution 31. Enfin, si les structures de calcul de la moyenne présentent des conformations multiples, sous-tomogrh méthodes de classification peuvent être utilisés pour différentes conformations moyenne séparément. À cette fin, Jsubtomo s&#39;intègre avec le paquet Dynamo, offrant classification de subtomogram puissant 9. Le protocole ci-dessus est complémentaire de la cristallographie aux rayons X des glycoprotéines virales isolées. Structures cristallographiques peuvent être montés dans des moyennes de sous-tomogramme d&#39;obtenir l&#39;orientation précise de la glycoprotéine par rapport à la membrane du virion. L&#39;application de cette méthode sera sans aucun doute continuer à faire la lumière sur la structure du virus enveloppés et physiopathologie.

Electron cryo-tomographie est une technique d&#39;imagerie cryo-microscopie électronique permettant le calcul d&#39;un à trois dimensions (3D) de reconstruction des échantillons biologiques complexes. Spécimens appropriés vont de complexes macromoléculaires purifiés 1, 2 filaments, vésicules enrobées 3, et les virus polymorphes de la membrane 4 à 5 cellules procaryotes entiers et même des zones minces de cellules eucaryotes entiers 6. Après la collecte de données d&#39;une inclinaison de la série, les volumes tomographiques 3D, ou des tomographies, peut être calculée en utilisant plusieurs logiciels, y compris celles bSoft 7 et 8 MID. Deux aspects inhérents à l&#39;étude d&#39;échantillons biologiques par la limite d&#39;électrons cryo-tomographie l&#39;interprétation biologique des volumes tomographiques correspondant. Tout d&#39;abord, en raison de la limitation de la dose d&#39;électrons qui peut être appliquée à des matières biologiques avant d&#39;introduire dégâts d&#39;irradiation importante, signaratios l-bruit dans les données tomographiques sont généralement très faibles. Deuxièmement, à la suite d&#39;un échantillonnage limité géométrie d&#39;inclinaison lors de la collecte de données, des vues de l&#39;objet restent absents, conduisant à une soi-disant «manque de coin &#39;artefact dans le volume tomographique. Cependant, ces deux limitations peuvent être surmontées si le volume tomographique contient répéter des structures identiques, tels que des complexes macromoléculaires, qui peuvent être avec succès moyennes 9-12. Avant moyenne des structures de reconstructions de tomographie, les objets d&#39;intérêt doivent être trouvés et alignés à la même orientation. La localisation de ces structures peut être réalisée par corrélation croisée d&#39;une structure de matrice dans le volume tomographique utilisant une approche souvent dénommé modèle correspondant 13. Le modèle utilisé dans ce processus d&#39;adaptation peut être dérivé de cryo-microscopie électronique ou électronique de cryo-tomographie par reconstruction 3D combiné, ou il peut être une carte de densité de simulationune structure atomique. Plusieurs forfaits de calcul ont été développés pour mener à bien ces tâches 11. Calcul de la moyenne des pics de la glycoprotéine du virus de la membrane, comme le VIH-1, a été une approche particulièrement efficace pour l&#39;étude de la structure 14 à 16. Une bonne compréhension de la structure fait partie intégrante de révéler à la fois les bases moléculaires des interactions virus-hôte et l&#39;orientation du développement de la conception antiviral et un vaccin. Bien que la cristallographie macromoléculaire est la technique de choix pour la haute résolution (généralement mieux que 4 Å) Analyse structurale des glycoprotéines virales et de leurs complexes, les structures de rayons X résultant de cette méthode sont des protéines isolées de l&#39;environnement membranaire naturel sur le virion . Ainsi, les détails importants tels que l&#39;architecture d&#39;ordre supérieur de glycoprotéines virales, dans le contexte du virion, demeurent insuffisantes. D&#39;autre part, cryo-microscopie électronique et reconstruction de particule uniquedes virus enveloppés ensemble est limité à virions à symétrie icosaédrique 17,18. Cryotomography électronique associée à l&#39;alignement de sous-volume est donc apparue comme une technique complémentaire qui permet l&#39;étude des pics de la glycoprotéine de forme irrégulière, les virus polymorphes in situ. Nous avons développé un logiciel nommé Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) pour la détection, l&#39;alignement et la moyenne des sous-volumes tomographiques. Jsubtomo a été utilisée dans la détermination de la structure d&#39;un certain nombre de structures cellulaires et virales 19-26. Ici, nous présentons un protocole détaillé, qui permet de déterminer les structures de pic viral de la surface. Pour contourner excès de raffinement structures moyennes en corrélant le bruit, le schéma de raffinement «étalon-or» est adoptée 10,27. Enfin, les stratégies pour la visualisation et l&#39;interprétation des résultats typiques sont discutés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:184px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jsubtomo (ver 1.3.1)</td>
			<td style="width:184px;">University of Oxford</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bsoft (ver 1.8.7)</td>
			<td style="width:184px;">NIAMS, NIH</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>bsoft.ws</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:184px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

averaging of viral envelope glycoprotein spikes from electron cryotomography reconstructions using jsubtomo

Les virus enveloppés utilisent des glycoprotéines membranaires sur leur surface d&#39;entrée de médiation dans des cellules hôtes. Analyse la structure tridimensionnelle de ces glycoprotéine &#39;pointes&#39; est souvent techniquement difficile, mais important pour la compréhension de la pathogenèse virale et dans la conception de médicaments. Ici, un protocole est présenté pour virale détermination de la structure de pointe par le biais de la moyenne de calcul de données cryo-tomographie électronique. Cryo-tomographie est une technique en microscopie électronique utilisée pour obtenir des reconstructions tridimensionnelles tomographiques de volume, ou des tomographies, des échantillons biologiques tels que les virus polymorphes de la membrane dans un état quasi-native, congelé-hydraté. Ces tomographies révèlent des structures d&#39;intérêt en trois dimensions, mais à faible résolution. Moyenne de calcul de sous-volumes, ou sous-tomographies, est nécessaire pour obtenir plus de détails de la résolution de la répétition des motifs structuraux, tels que pointes de glycoprotéines virales. Une approche de calcul détaillé pour aligning et moyenne sous-tomographies à l&#39;aide du logiciel Jsubtomo est décrite. Cette approche permet la visualisation de la structure de pointes de glycoprotéines virales à une résolution de l&#39;ordre de 20-40 Å et l&#39;étude de l&#39;étude de la hausse des commandes pic-à-pic interactions sur la membrane du virion. Les résultats typiques sont présentés pour le virus Bunyamwera, un virus enveloppé de la famille des Bunyaviridae. Cette famille est un groupe structurellement divers agents pathogènes constituent une menace pour la santé humaine et animale.

Nous démontrons l&#39;application de la moyenne flux de travail sous-tomographie décrit ci-dessus pour le complexe de la glycoprotéine d&#39;enveloppe du virus Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) en utilisant un ensemble de données publiées antérieurement mis 24. paramètres de collecte de données et le raffinement sont listés dans le Tableau 1. Une tomographie représentatif est montré à la figure 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Paramètre (unité) </td><td> Valeur </td></tr><tr><td> La collecte des données </td><td></td></tr><tr><td> Tension (kV) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Grossissement calibré (X) </td><td> 111000 </td></tr><tr><td> La taille du pixel (A) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> Dose estimée (e - / Å 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus (pm) </td><td> 4,0-4,5 </td&gt; </tr><tr><td> Zéro FCE (A) une </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> Plage d&#39;inclinaison (°) </td><td> -60 À 60 </td></tr><tr><td> Tilt échantillonnage (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Données et raffinement </td><td></td></tr><tr><td> Tomographies </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virions </td><td> 29 </td></tr><tr><td> Graines par virion </td><td> 106 </td></tr><tr><td> Nombre total de graines </td><td> 3074 </td></tr><tr><td> Spikes détectés </td><td> 1346 </td></tr><tr><td> Spikes après de supprimer les chevauchements </td><td> 1401 </td></tr><tr><td> Spikes après sélection sur la base de corrélation croisée </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> Spikes inclus dans la moyenne finale </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> Symétrie </td><td> C3 </td></tr><tr><td> Échantillonnage angulaire (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Résolutiongamme utilisée dans le raffinement (Å) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> Résolution estimation finale (A) b </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: la collecte des données et statistiques Bunyamwera de raffinement. un FCT, la fonction de transfert de contraste. b Calculé à l&#39;aide de Fourier coque corrélation entre deux structures indépendamment raffinés au seuil de 0,143. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> Figure 2:. Slice par une tomographie de virions Bunyamwera Plusieurs vues de côté pic évident dans la périphérie de chaque virion sont indiqués par des flèches. La tomographie a été filtré passe-bas à 60 Å. Barre d&#39;échelle de 100 nm. Tout d&#39;abord, nous avons affiné un modèle initial en utilisant 205 pointes, récolté manuellement ( <strong&gt; Figure 3). Trois symétrie du centre-pic le plus évident était sans appliquer de symétrie (figure 3B) et a été imposée dans les rondes subséquentes de raffinement (figure 3C). Pour détecter automatiquement tous les pics sur la surface du virion, nous avons généré 106 graines de chaque virion au rayon de 43 nm et un espacement de 20 degrés (figure 4A) et de façon itérative affiné leurs positions par rapport à la membrane (figure 4B). <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> Figure 3: Le raffinement de la structure de la matrice initiale. (A) cylindrique en moyenne (C100) modèle construit à partir des positions définies manuellement de pointes. (B) En moyenne densité après cinq tours de raffinement sans symétrie (C1) a imposé affiche une hausse de trois foiscaractéristiques symétriques. La résolution du modèle est de 48 Å. (C) moyenne de la pointe a été résolu à 41 Å après cinq tours de raffinement avec triple symétrie. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> Figure 4:. Raffinement des graines AB) Un sous-ensemble de graines avant (A) et après (B) raffinement sont présentés sur une densite de virion de la figure 2 Graines à (B) ont été codés par couleur en fonction de la transversale respective. coefficients de corrélation (bleu, faible corrélation, le rouge, haute corrélation). Les meilleurs corrélation glycoprotéine correctifs de pointes (top 75% après la suppression des chevauchements; ~ 1000 pointes) ont été utilisés pour calculer la moyenne finale. La moyenne a été résolu à 35 Å de résolution (Figure 5). Il a révélé une structure de pointe trimérique dans le milieu, enOutre une contribution de six crampons voisins. Modèles composites des virions, calculés en plaçant la structure en des positions connues, ont révélé placement des pointes sur la surface du virion (Figure 6A). De temps en temps, des taches commandés localement des pointes étaient évidents (figure 6B). <img alt="Figure 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> Figure 5: Structure raffinée d&#39;un patch de la couche de pointes de glycoprotéines après template matching. (AB) Deux cartes «même» et «bizarre», reconstruites à partir de deux moitiés des données sont présentées. Les deux cartes montrent un degré remarquable de similitude, la vérification de l&#39;valable jusqu&#39;au de l&#39;approche. L&#39;orientation autour de l&#39;axe de temps est différente de la pointe que les deux cartes ont été reconstruits entièrement indépendamment l&#39;un de l&#39;autre. (C) moyenne des deux cartes est indiqué enla résolution finale de 35 Å. <img alt="Figure 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> Figure 6: Placement des pointes sur le virion Bunyamwera. (A) du modèle composite d&#39;un virion. Voir vecteurs (bâtons) indiquent les orientations des pointes. Les couleurs indiquent la corrélation entre chaque pic et la structure du modèle (bleu, une faible corrélation, le rouge, forte corrélation). (B) Un gros plan d&#39;une pièce ordonnée de pointes.

Watch this Scientific Journal Video about Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo at JoVE.com

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Moyenne de la glycoprotéine d&#39;enveloppe virale Pointes de Electron Cryotomography reconstructions utilisant Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

averaging-viral-envelope-glycoprotein-spikes-from-electron

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K vues.  University of Oxford. An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.