This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging).">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells.">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li><li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Gr&#252;newald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. 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The authors have nothing to disclose.

<html> Wissen von viralen Glykoprotein Spike-Struktur auf der Membran Virus ist von wesentlicher Bedeutung für das Verständnis der Virus-Replikation und die Entwicklung von Therapeutika zur Behandlung und Prävention der Infektion. Kryoelektronenmikroskopische kombiniert mit Einzelpartikellung wurde als die am häufigsten verwendete Methode, um die Strukturen der umhüllten Viruspartikel, einschließlich der Spitzen-Glykoprotein lösen entstanden. Jedoch ist dieses Verfahren beschränkt auf die symmetrische Viren ikosaedrisch. Hier durch die Anwendung der Elektronen Kryo-Tomographie und subtomogram Mittelung in Jsubtomo, haben wir ein allgemeines Protokoll zur Bestimmung Glykoprotein-Spikes auf pleomorphen umhüllte Viren, die nicht zugänglich für andere aktuelle Methoden der Strukturbiologie werden skizziert. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die Auflösung dieser Methode ist ausreichend, um Einblicke in die Domänenarchitektur, Oligomerisierung und höherer Ordnung Organisation des Glykoprotein-Spikes auf intakte Virionen offenbaren. jove_content &quot;&gt; Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll baut zwei zuverlässige Ausgangsmodelle, die statistisch unabhängig voneinander. erfolgreiche Ausführung dieser Schritt setzt voraus, dass Glykoprotein Spikes sind ausreichend groß und nicht gegeneinander zu fest gepackt, so dass einzelne Spikes visuell erkannt werden, und manuell in der Schichtbilder aufgenommen und zwei unabhängige Modelle gemittelt. Wenn dies nicht möglich ist, zwei Änderungen an dem Protokoll versucht werden kann. Zuerst werden zwei unabhängige Zufalls Modelle können durch erste, die zwei Untergruppen von Zufalls subtomograms und dann konstruiert werden Mittelung der subtomograms innerhalb dieser Untergruppen 30. Zweitens, wenn eine Struktur des isolierten Spitze durch andere Mittel, durch Röntgenkristallographie abgeleitet, beispielsweise können sie als Ausgangsmodell verwendet werden. Allerdings muss darauf geachtet werden, werden im niedrigen Pass-Filter dieses Modell mit einem Low-Cut-off-Auflösung (50-70 Å), wie die beiden resultierenden Modelle in der nächsten Runde der Verfeinerung wirdstatistisch unabhängigen erst jenseits dieser Auflösung. Aufgrund dieser Einschränkung ist der erste Ansatz empfohlen. Die erzielbare Auflösung von diesem Protokoll hängt von vier Hauptfaktoren: i. Datensammlungsstrategie und die Qualität der Eingabedaten, ii. Anzahl der subtomograms, iii. Ausrichtungsgenauigkeit der subtomograms und iv. Heterogenität der Strukturen. Während die ersten und zweiten Begrenzungs weitgehend durch hoch Signal-Rausch direkten Elektronendetektoren kombiniert mit CTF korrigiert Tomographie und automatisierte Datenerfassung zu überwinden, wird die Ausrichtungsgenauigkeit weiter durch die Größe und Form der Struktur von Interesse selbst beeinflusst. Bei der Anwendung dieses Protokolls auf kleine Spitzen ohne hervorstechende Merkmale, kann es vorteilhaft sein, um Fab-Fragmente zu binden, um den Dorn, um die Ausrichtungsgenauigkeit und damit Auflösung 31 zu verbessern. Schließlich, wenn die Strukturen, die gemittelt werden, weisen mehrere Konformationen Unter tomogrUhr Klassifikationsmethoden verwendet werden, um im Durchschnitt unterschiedlichen Konformationen getrennt werden. Zu diesem Zweck integriert Jsubtomo mit dem Dynamo-Paket und bietet leistungsstarke subtomogram Klassifizierung 9. Das obige Protokoll komplementär zu Röntgenkristallographie von isolierten viralen Glycoproteine. Kristallographischen Strukturen in Teilschnittbild Schnittswerte eingesetzt, um die genaue Ausrichtung des Glykoproteins bezüglich des Virions Membran zu erhalten. Anwendung dieser Methode wird zweifellos auch Licht auf umhüllte Virus Struktur und Pathobiologie vergießen.

Elektronen Kryo-Tomographie ist ein Kryoelektronenmikroskopische Bildgebungsverfahren ermöglicht die Berechnung einer dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion von komplexen biologischen Proben. Geeignete Proben reichen von gereinigtem makromolekularen Komplexen 1, Fäden 2, Vesikel 3 und 4 pleomorphe Membran Viren, ganze prokaryotischen Zellen 5 und auch dünne Bereiche der gesamten eukaryotischen Zellen 6. Nach der Datensammlung, einer Tilt-Serie, 3D-tomographischen Volumes oder Schichtaufnahmen kann mit mehreren etablierten Software-Pakete, einschließlich bsoft 7 und 8 IMOD berechnet werden. Zwei Aspekte inhärent auf die Untersuchung von biologischen Proben durch Elektronen Kryo-Tomographie begrenzen die biologische Interpretation der entsprechenden tomographischen Volumen. Erstens, aufgrund der begrenzten Elektronendosis, die biologischen Materialien vor der Einführung signifikanten Strahlenschäden angewendet werden kann, signal-zu-Rausch-Verhältnisse in tomographischen Daten sind typischerweise sehr gering. Zweitens, als Folge der begrenzten Stichprobenneigungsgeometrie während der Datensammlung, einige Ansichten des Objekts bleiben nicht vorhanden, was zu einer so genannten &quot;fehlt Keil&quot; Artefakt in der tomographischen Lautstärke. Allerdings können diese beiden Einschränkungen zu überwinden, wenn die tomographischen Volumen sich wiederholende identische Strukturen, wie beispielsweise makromolekularen Komplexen, die erfolgreich sein können gemittelt 9-12. Vor der Mittelung Strukturen Tomogramm Rekonstruktionen müssen Objekte von Interesse zu finden und mit der gleichen Orientierung ausgerichtet werden. Anordnen Solche Strukturen können durch Kreuzkorrelation eines Schablonenstruktur in dem tomographischen Volumens mit einem Ansatz oft als Template pass 13 genannten erzielt werden. Das in diesem Vergleichsprozeß verwendete Vorlage aus Kryoelektronenmikroskopische oder Elektronen Kryo-Tomographie in Kombination mit 3D-Rekonstruktion abgeleitet werden, oder es kann ein Dichtekarte von simulierendeneine atomare Struktur. Mehrere Rechenpakete wurden entwickelt, um diese Aufgaben zu erfüllen 11. Mittelung von Glycoprotein Spikes von Membran Viren, wie HIV-1, war ein besonders erfolgreicher Ansatz für die Untersuchung ihrer Struktur 14-16. Ein Verständnis der Struktur ist integraler für enthüllt sowohl die molekularen Grundlagen der Virus-Wirt-Interaktionen und Führungsantivirale und Impfstoff-Design-Entwicklung. Während makromolekulare Kristallographie ist die Technik der Wahl für hochauflösende (in der Regel besser als 4 Å) Strukturanalyse der einzelnen viralen Glykoproteinen und ihre Komplexe, die Röntgenkristallstrukturen von dieser Methode ergeben, sind von Proteinen aus der natürlichen Umgebung isoliert membranöse auf dem Virion . Somit wichtige Details wie die höherwertigen Architektur viraler Glykoproteine ​​im Kontext des Virions, bleiben fehlen. Auf der anderen Seite, Kryoelektronenmikroskopische und Einzelpartikelrekonstruktionder gesamte umhüllte Viren zu Virionen mit Ikosaedersymmetrie 17,18 beschränkt. Elektronen cryotomography kombiniert mit Teilvolumen Ausrichtung ist damit mehr als eine Ergänzung, die die Untersuchung von Glycoprotein Spikes von unregelmäßig geformten, pleomorphen Viren in situ entstanden. Wir haben eine Software namens Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) zum Nachweis, Ausrichtung und Mittelung der tomographischen Teilmengen entwickelt. Jsubtomo in der Bestimmung der Struktur einer Reihe von zellulären und viralen Strukturen 19-26 verwendet worden. Hier skizzieren wir ein ausführliches Protokoll, das die Bestimmung des viralen Oberflächenstrukturen Spike ermöglicht. Durch Korrelation Lärm zu über-Verfeinerung der gemittelten Strukturen zu umgehen, wird der &quot;Goldstandard&quot; Verfeinerung Regelung verabschiedet 10,27. Schließlich Strategien zur Visualisierung und Interpretation der typische Ergebnisse werden diskutiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:184px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jsubtomo (ver 1.3.1)</td>
			<td style="width:184px;">University of Oxford</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bsoft (ver 1.8.7)</td>
			<td style="width:184px;">NIAMS, NIH</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>bsoft.ws</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:184px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

averaging of viral envelope glycoprotein spikes from electron cryotomography reconstructions using jsubtomo

Umhüllte Viren nutzen Membranglykoproteine ​​auf ihrer Oberfläche, um den Eintritt in die Wirtszellen zu vermitteln. Dreidimensionale Strukturanalyse dieser Glykoprotein &#39;Spikes&#39; ist oft technisch anspruchsvoll, aber wichtig für das Verständnis der Pathogenese viraler und Wirkstoffdesign. Hier wird ein Protokoll für die virale Spike Strukturbestimmung durch rechnerische Mittelung der Kryo-Elektronentomographie-Daten dargestellt. Elektronen Kryo-Tomographie ist eine Technik, in der Elektronenmikroskopie verwendet, um dreidimensionale tomographische Rekonstruktionen Volumen oder Schichtaufnahmen, von pleomorphen biologischen Proben wie Viren-Membran in einer nahe der nativen, tiefgefrorenen Zustand abzuleiten. Diese Schnittbilder zeigen Strukturen von Interesse in drei Dimensionen, wenn auch in geringer Auflösung. Computational Mittelung der Teilvolumina, oder Unterschichtaufnahmen, ist notwendig, um eine höhere Auflösung Detail wiederholenden Strukturmotive, wie virale Glykoprotein Spikes erhalten. Eine detaillierte Berechnungsansatz für aligning und Mitteln Teilschnittbildern unter Verwendung des Softwarepakets Jsubtomo skizziert. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung der Struktur des viralen Glykoprotein Spikes mit einer Auflösung im Bereich von 20-40 Å und Studium der Studie höherer Ordnung Spitze-zu-Spitze-Interaktionen auf der Virion Membran. Typische Ergebnisse sind für Bunyamwera-Virus, ein umhülltes Virus aus der Familie Bunyaviridae vorgestellt. Diese Familie ist eine strukturell heterogene Gruppe von Krankheitserregern, die eine Bedrohung für die Gesundheit von Mensch und Tier.

Wir demonstrieren die Anwendung des Teillung Tomogramm Workflow oben für die Hüllglycoprotein Komplex von Bunyamwera Virus (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) mit einem zuvor veröffentlichten Daten skizzierten 24. Datensammlung und Verfeinerungsparameter sind in Tabelle 1 aufgeführt. Ein Vertreter Tomogramm wird in 2 gezeigt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parameter (Einheit) </td><td> Wert </td></tr><tr><td> Datensammlung </td><td></td></tr><tr><td> Spannung (kV) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Kalibriert Vergrößerung (X) </td><td> 111.000 </td></tr><tr><td> Pixelgröße (Å) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> Geschätzte Dosis (E - / A 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Unterfokus (um) </td><td> 4,0-4,5 </td&gt; </tr><tr><td> Erste CTF Null (A) ein </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> Neigebereich (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> Tilt Probenahme (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Daten und Raffinesse </td><td></td></tr><tr><td> Schnittbilder </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virionen </td><td> 29 </td></tr><tr><td> Samen pro Virion </td><td> 106 </td></tr><tr><td> Gesamtzahl Samen </td><td> 3.074 </td></tr><tr><td> Spikes erkannt </td><td> 1.346 </td></tr><tr><td> Spikes nach dem Entfernen Überschneidungen </td><td> 1.401 </td></tr><tr><td> Spikes nach Kreuzkorrelationsbasierte Auswahl </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Spikes in der letzten Durchschnitt ein, </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Symmetrie </td><td> C3 </td></tr><tr><td> Winkel Probenahme (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> AuflösungBereich in der Verfeinerung (a) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> Endgültige Auflösung Schätzung (a) b </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Bunyamwera Datensammlung und Verfeinerung Statistik. ein CTF, Kontrastübertragungsfunktion. b Berechnet mit Fourier-Shell Korrelation zwischen zwei unabhängig raffinierten Strukturen bei einer Schwelle von 0.143. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> Figur 2:. Scheibe durch ein Tomogramm Bunyamwera Virionen Mehrere Spike Seitenansichten zeigt sich in der Peripherie jedes Virion sind mit Pfeilspitzen markiert. Das Schnittbild ist Low-Pass bis 60 Å gefiltert. Maßstab 100 nm auf. Zunächst wird ein erstes Modell mit 205 manuell abgeholt Spikes (raffiniertes wir <strong&gt; 3). Dreifache Symmetrie der Mitte-Spitze am meisten war klar, ohne Anwendung von Symmetrie (3B) und wurde in den folgenden Runden der Verfeinerung (3C) auferlegt. Zur automatischen Erkennung alle Spitzen auf der Virion-Oberfläche erzeugten wir 106 Samen pro Virion am Radius von 43 nm und der Abstand von 20 Grad (4A) und iterativ verfeinert ihre Positionen relativ zu der Membran (4B). <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3: Verfeinerung der ursprünglichen Template-Struktur. (A) Zylindrisch gemittelt (C100) Vorlage aus manuell definierten Positionen von Spitzen gebaut. (B), gemittelt Dichte nach fünf Runden der Verfeinerung ohne Symmetrie (C1) auferlegt zeigt eine Spitze mit drei-fachsymmetrische Funktionen. Die Auflösung des Modells ist 48 Å. (C) Durchschnittliche der Spitze wurde bei 41 A nach fünf Runden der Verfeinerung mit Dreifach-Symmetrie gelöst. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> Abbildung 4:. Verfeinerung der Samen AB) Eine Teilmenge der Samen vor (A) und nach (B) sind auf einer Verfeinerung Virion Dichte von 2 gezeigt Seeds in (B) wurden farbcodiert auf der Grundlage der jeweiligen Quer. Korrelationskoeffizienten (blau, geringe Korrelation, rot, hohe Korrelation). Die besten korrelierende Glykoprotein Spike Patches (Top 75% nach dem Entfernen Überschneidungen; ~ 1.000 Spikes) wurden verwendet, um die endgültige Durchschnitt zu berechnen. Die durchschnittliche wurde auf 35-Å Auflösung (Abbildung 5) gelöst. Es zeigte eine trimere Struktur Dorn in der Mitte, inNeben einigen Beitrag aus sechs Nachbar Spikes. Verbund Modelle der Virionen, indem die Struktur in den bekannten Positionen berechnet wird, offenbart die Anordnung der Spikes auf der Oberfläche des Virions (6A). Gelegentlich waren vor Ort bestellt Patches von Spikes deutlich (Abbildung 6B). <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> Abbildung 5: raffinierte Struktur eines Patches von dem Glykoprotein Spike Schicht nach Template-Matching. (AB) Zwei Karten &quot;auch&quot; und &quot;ungerade&quot;, aus zwei Hälften der Daten rekonstruiert werden angezeigt. Die beiden Karten zeigen einen bemerkenswerten Grad der Ähnlichkeit, die Überprüfung der Ihrer Gültigkeit des Ansatzes. Die Ausrichtung um die Längsachse Spitze unterscheidet, als die beiden Karten sind vollständig unabhängig voneinander rekonstruiert. (C) Durchschnitt der beiden Karten an gezeigtdie endgültige Auflösung von 35 Å. <img alt="Figur 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> Abbildung 6: Platzierung der Spikes auf der Bunyamwera Virus. (A) Composite-Modell eines Virions. Ansicht Vektoren (Sticks) zeigen die Orientierung der Spikes. Farben zeigen die Kreuzkorrelation zwischen jedem Spike und der Template-Struktur (blau, geringe Korrelation, rot, hohe Korrelation). (B) A close-up von einer geordneten Patch von Spikes.

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Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Mittelung der Virushülle Glykoprotein-Spikes von Electron Cryotomography Rekonstruktionen mit Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

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Immunology and Infection

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