עבודה זו נתמכה על ידי NIH המענק R00 CA160574 (SFB) ועל ידי מענק של תכנית רטגרס ביוטכנולוגיה ההדרכה (לSMM).

נוהל זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת רטגרס, אוניברסיטת ניו ג&#39;רזי המדינה. טופלו עכברים בהתאם למדריך NIH לטיפול והשימוש בחי מעבדה. מדענים צריכים להתייעץ ארגוני בעלי החיים הלאומיים ומוסדיים שלהם להנחיות שנקבעו ואושרו. לפני תחילת, להכין את הפתרונות מפורטים בטבלה 1. בידוד תא 1 B והפעלה להרדים עכבר באמצעות CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. מקם את העכבר כל כך בצד השמאל של הגוף הוא למעלה ולרסס את העכבר עם אתנול 70% עד הפרווה לחה. לנתח את הטחול ומניחים בצלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ עם חיץ לשטוף 2 מ&quot;ל. בזרימה למינרית, בעדינות לשבור את הטחול בצלחת תרבית רקמה באמצעות הקצה השטוח של מזרק 5 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס רשת ניילון 70 מיקרומטר ל50צינור מ&quot;ל ולהעביר את דגימת הטחול ב2 מ&quot;ל חיץ לשטוף לרשת הניילון. בעדינות לשבש את הטחול ברשת באמצעות הקצה השטוח של המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הגב של המזרק וצלחת 35 מ&quot;מ עם 8 מ&quot;ל של חיץ לשטוף ולסנן דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק supernatant וresuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל של חיץ תמוגה ACK. פיפטה למעלה ולמטה לזמן קצר לשבש גושים ודגירה של 5 דקות. הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ לשטוף ו צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק supernatant ו resuspend את הכדור על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור ולאחר מכן על ידי pipetting ב 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף. הוסף 50 μl של מיקרו חרוזים אנטי CD43 MACS ולדגור על קרח למשך 30 דקות. הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ לשטוף, מערבב בעדינות, וצנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ לשטוף, מערבב בעדינות, וצנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר אתMini-MACS טור על ידי הצבת עמודה על מגנט MACS. מקם צינור חרוטי 15 מ&quot;ל שכותרת מתחת לעמודה. הוסף 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף לעמודה ולאפשר לרוץ דרך צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וגלול ב 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף. טען את המדגם בעמודה לאחר לשטוף החיץ יש להפעיל דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי המדגם לרוץ דרך העמודה, להוסיף למאגר לשטוף 1 מ&quot;ל לשטוף את העמודה. הוסף 7 מ&quot;ל של חיץ לשטוף ישירות למדגם שנאסף בצינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemocytometer. העבר את הנפח הנדרש של תאים דרושים ל5,000,000 תאים / היטב לתוך צינור 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. בינוני תא B מוסף עם 1 LPS: 500 וIL4 1: 1,000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולהוסיף הנפח המתאים של מדיום תא B בתוספת הדרושה לריכוז סופי של 1,000,000 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים ב6 צלחות גם עם 5 מ&quot;ל של תאים ב1,000,000 תא / מ&quot;ל ​​והמקום בhumidifiתרבית תאי חממת ed על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> קיבוע תא .2 B <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של colcemid לC גם מכיל 5 מ&quot;ל של תאי B (לריכוז סופי של 100 ng / ml) ו דגירה שעה 1 ב37 מעלות. 75 פתרון מ&quot;מ KCl Prewarm באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. העבר את תאי B לצינור 15 מ&quot;ל שכותרת. כסה את התווית עם קלטת ו צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant עוזב 1 מ&quot;ל בצינור וresuspend גלולה ידי pipetting. הוסף 5 מ&quot;ל של ירידת KCl prewarmed על ידי ירידה בזמן הקשה או פועם במערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של KCl ומערבבים על ידי היפוך. דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הוסף 5 טיפות של מקבע ותערובת טריות על ידי היפוך. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב supernatant עוזב 1 מ&quot;ל בצינור וresuspend גלולה ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של טיפה מקבע טרי על ידי ירידה בזמן הקשה או פועם בvorטקס. הוספה נוסף 10 מ&quot;ל של מקבע ודגירת 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב supernatant עוזב 1 מ&quot;ל בצינור וגלול על ידי pipetting. הוספת 14 מ&quot;ל של מקבע ו צנטריפוגות הטריים XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.7 עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 14 מ&quot;ל של מקבע טרי. חותם את הכובעים עם Parafilm ולאחסן לילה בשעה -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> .3 הכנת ממרחי כרומוזום Metaphase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר תא סביבתי מוסדר ל22.9 ° C ו52% לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה קבועה תאי B XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב מקבע עוזב 70 μl בצינור והגלול על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות שכותרתו בתא לחות בזווית 35 °. זרוק 35 μl של תאי B resuspended לשקופית ושחרר שתי שקופיות לדגימה. אפשר השקופיות לייבוש בתא לחות למשך 30 דקות לאחר מכן לאחסן את השקופיותבתיבת שקופיות על 37 C °. </li></ol> FISH .4 הטלומרים הרשות הפלסטינית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Probe <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוראמיד deionized טרום חם ל37 מעלות צלזיוס. לערבב 2 μl של בדיקה הרשות הפלסטינית הטלומרים עם פוראמיד מראש חימם 7 μl deionized ולדגור על 37 ° C עם רעד במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת אב FISH טרום חמה ל37 מעלות צלזיוס. להוסיף 7 μl תערובת אב FISH מראש חיממה לתערובת משלב 4.1.1 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל תערובת הבדיקה במשך 8 דקות על 80 מעלות צלזיוס. טרום לחשל את החללית לשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול מקדים של שקופיות כרומוזום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם צנצנת שקופית מכתימה זכוכית המכילה 50 מ&quot;ל של 0.01 M HCl ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מקום בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 2x SSC למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של מניית פפסין לצנצנת שקופית המכתימה הזכוכית מחוממת מראש ומערבבים על ידי היפוך. העברת שקופיות sl זכוכית זהצנצנת ide-מכתים ודגירה 90 שניות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות 2x בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת חדר, רועדת. לאחר מכן לשטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב1x PBS / MgCl 2 בטמפרטורת חדר, רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השקופיות לצנצנת שקופית מכתימה זכוכית המכילה פורמלדהיד 1% המוכנים טרי / 1x PBS / MgCl 2 ל10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עבור 5 דקות בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 1x PBS בטמפרטורת חדר, רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרת התייבשות אתנול על ידי בעל צנצנות שקופית מכתימה זכוכית נפרדת המכילות 70%, 90%, ו100% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השקופיות לכל צנצנת במשך 3 דקות, מתחילה עם 70% אתנול, ולאחר מכן 90% אתנול, ולאחר מכן 100% אתנול. מניחים צנצנות אתנול ב -20 מעלות צלזיוס, כאשר סיימו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות לייבוש באוויר על ידי הקשה אתנול עודף על מגבת נייר והשעין שקופיות בזווית 35 °. ברגע שיבש, maRK אזור 18 x 18 מ&quot;מ להכלאה על הגב של השקופיות באמצעות עט יהלומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Denaturation של שקופיות לדגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פוראמיד 120 μl 70% deionized / 2X SSC לcoverslip 24 x 60 מ&quot;מ. לגעת בשקופיות לcoverslip. לפגל שקופיות על 80 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית ל90 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ובזהירות להחליק את coverslip ולמקם את השקופית באתנול 70% קרים כקרח במשך 3 דקות, ואחריו 90% אתנול, ו100 אתנול% כל אחד במשך 3 דקות. אפשר שקופיות לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא לח על ידי המצפה קופסא פלסטיק עם מכסה הדוק ונייר טישו רטוב. הנייר צריך להיות לח, אבל לא רווי במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתא לח, להחיל את תערובת בדיקה-מרותק מראש מצעד 4.1.3 לאזור המסומן בשקופית, מכסה בכיסוי מ&quot;מ תלוש 18 x 18 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוחצת הודעה דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוראמיד 50% טרום חם / 2x SSC, 1x SSC, ו4x SSC / 0.1% Tween-20 ב45 °; C אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את coverslips ולשטוף את השקופיות ב50% פוראמיד דקות 3xfor 5 / 2x SSC מראש חימם כל אחד בחושך ורועד. שטוף את השקופיות בSSC 1x מראש חימם 3xfor 5 דקות כל אחד, רועדים. לבסוף, לשטוף את השקופיות במחוממים מראש 4x SSC / 0.1% דקות Tween-20 3xfor 5 כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם השקופיות עבור 3 דקות בDAPI בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית אור מוגנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב2x SSC, רועדים. החל 35 μl של הרכבה בינונית Mowiol, מכסה ב24 x 60 coverslips מ&quot;מ ולאחסן את השקופיות ב 4 ° C.. </li></ol></li></ol> .5 ניתוח מיקרוסקופי של כרומוזומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את שקופיות metaphase באמצעות מיקרוסקופ עלית הקרינה סטנדרטי. השתמש בפלטפורמת הדמיה עם שלב אוטומטי כגון פלטפורמת MetaSystems Metafer כדי להשיג תוצאות הטובות ביותר. לכל התפשטות metaphase, לאסוף תמונה אחת לקרינת DAPI לדמיין כרומוזומים, ותמונה אחת לאות הניאון מp הטלומריםגלימה. (לדוגמא, fluors האחר Cy3- זמין ולעבוד באותה מידה גם.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי התמונות עם תכנית ניתוח תמונה ולנתח. </li></ol>

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

אי לנו אינטרסים מנוגדים.

ואילו לימפוציטים מסוג B מופעלים מתאימים במיוחד להכנת ממרחי כרומוזום mitotic, יכולים לשמש גם סוגי תאים אחרים. לימפוציטים מסוג T חולקים הרבה מהיתרונות של תאי B, כפי שהם יכולים להיות מטוהרים מבלוטות הטחול או לימפה, ויש לי מדד גבוה המיטוטי כאשר מגורה על ידי צמיחה במדיום המכיל ...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

הסרטן נגרמים על ידי ההצטברות של מוטציות המשפיעות על גנים המווסתים את גדילת תאים נורמלית. מוטציה היא תוצאה של שינויים במבנה וברצף של הגנום שנגרם נזק לדנ&quot;א. נזק לדנ&quot;א יכול להתרחש באמצעות מגוון רחב של תהליך, כולל סוכנים אקסוגניים כגון קרינה מייננת, וכתוצר לוואי של חילוף חומרים בתאים נורמלים, כגון deamination הספונטני של בסיסי נוקלאוטיד או נזק המתרחשים על ידי מגע עם מיני חמצן תגובתי 1. למרות שתאי יונקים יש מגוון של פעילויות תיקון שיכול להפוך נזק לדנ&quot;א או לשחזר את הרצף באתרי הפסקה, מוטציות בכל זאת לצבור לכל אורך חייו של תא. נזק לדנ&quot;א יכול יתר על כן תורם להזדקנות ואובדן העוצמה של תאי גזע, שני תהליכים הקשורים למחלות הקשורות להזדקנות 2. הבנת התיקון של נזק לדנ&quot;א לכן חשיבות מרכזית בהתמודדות שני סימןנושאי ificant בבריאות הציבור. ראיות מצביעות על כך שהגדלת מסלולי תיקון דנ&quot;א של יונקים יכולים לתרום להתפתחות של הגנום של התאים הסרטניים 3,4, מה שהופך את זה אפילו יותר הכרחי כדי להבין את התהליכים מעורבים בדיכוי מוטציה ברמה המולקולרית. להדמיה ישירה של סטיות כרומוזום היא אמצעי רב עוצמה וכמותי של קביעת ההיקף של חוסר יציבות גנומית בסוג תא מסוים. כרומוזומים תמצית מהתאים בmetaphase יכולים להיות מבודדים ובדקו באמצעות אור או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישות ציטוגנטית כאלה כבר בפועל במשך כמה עשורים וניתן להשתמש בו כדי להדגים את המראה של טרנסלוקציות או סוגים מסוימים של סטיות כרומוזום קשורות לאובדן של פעילות תיקון DNA. הפרוטוקול משאיל את עצמו לכמה סיומות אפשריות: יכולים להיות מתויג כרומוזומים עם בדיקות לkaryotyping רפאים (SKY) או ניאון ססגוניות הכלאה באתר(MFISH) לזהות טרנסלוקציות 5,6. טכניקות אלו מאפשרות גם את התדירות של טרנסלוקציות כרומוזום והמבנה של טרנסלוקציות כרומוזום המורכבת שייקבע, אשר מספק מידע נוסף מעבר למה שאפשרי עם פרוטוקול זה. לחלופין, יכולות להיות שנוצרו בדיקות רצף ספציפי ומשמשות לבדיקת התדירות של שבירת הדנ&quot;א באתרים הגנומי נבחרו 7. בפרוטוקול זה, אנו מתארים הכנה של כרומוזום metaphase מתפשטת מלימפוציטים מסוג B. בדיקה פפטיד fluorescently שכותרתו חומצות גרעין (PNA) לחזרות telomeric משמשת, אשר יעילות מסמנת הטלומרים בכרומוזום metaphase מתפשט פרוטוקול זה יש מספר יתרונות. יכולים להיגרם תאי B לצמוח במדד המיטוטי גבוה, כך שאופן עקבי ניתן להפיק מרווחים גבוהה באיכות. תאי B מעכברים גנטי שונה הם הרבה פחות סביר שיכילו מוטציות גנטיות משניים שיכול לבלבל את הניתוח של התרומה גםשל גנים ספציפיים לשלמות הגנום. גישת PNA-FISH ניתן להשלים ביום אחד, ומאפשרת ניקוד מדויק יותר של הפסקות כרומוזום. על ידי שימוש בגישה זו, במיוחד בשילוב עם ציוד ספציפי שתואר בפרוטוקול זה, ניתן לייצר מרווחים מאוד עקביים, באיכות גבוהה ובמהירות לנתח את השיעור והסוג של חוסר יציבות גנומית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

תיקון DNA פגום מוביל לחוסר יציבות גנומית מוגבר, המהווה את סיבת השורש של מוטציות המובילות ליצירת גידולים. ניתוח של התדירות והסוג של סטיות כרומוזום בתאים מסוגים שונים מאפשר פגמים במסלולי תיקון DNA לא הובהרו. ביולוגיה תיקון דנ&quot;א של יונקים הבנה כבר סייעה רב בייצור של עכברים עם knockouts בגנים מסוימים. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית בB עכבר לימפוציטים. תיוג של הטלומרים באמצעות בדיקות PNA-FISH (חומצות גרעין פפטיד - ניאון הכלאה באתר) מאפשר ניתוח המהיר של חוסר יציבות גנומית במרווחי כרומוזום metaphase. יש לי תאי B יתרונות ספציפיים ביחס לפיברובלסטים, כי יש להם ploidy נורמלי ומדד המיטוטי גבוה יותר. תרבות לזמן הקצר של תאי B ולכן מאפשרת מדידה מדויקת של חוסר יציבות גנומית באוכלוסיית תא ראשונית שעשויה להיות מוטציה גנטית משנית פחותים יותר ממה שהוא נמצא בדרך כלל בfibroblasts הפך או שורות תאי חולה.

כרומוזומים Metaphase נגזרים מתא אחד צריכים ליצור אשכול דיסקרטי המכיל 40 הכרומוזומים (אם שימוש בתאי עכבר) (איור 1 א). לכל כרומוזום centromere בקצה אחד, שהוא נראה כמו כדור אור כחול. בכרומוזומים רגילים, שני אותות הטלומרים נראים בסוף chromatids ושני אותות על ידי כל אחד centromere. גרעי...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

מסלולי תיקון DNA חיוניים לתחזוקה של שלמות הגנום ומוטצית מניעה וסרטן. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית על ידי תצפית ישירה של סטיות כרומוזום בmetaphase מתפשט מתאי B עכבר באמצעות ניאון הכלאה באתר (FISH) לחזרות דנ&quot;א telomeric.

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

rapid-analysis-chromosome-aberrations-mouse-b-lymphocytes-pna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Views.  Rutgers, the State University of New Jersey.  מסלולי תיקון DNA חיוניים לתחזוקה של שלמות הגנום ומוטצית מניעה וסרטן. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית על ידי תצפית ישירה של סטיות כרומוזום בmetaphase מתפשט מתאי B עכבר באמצעות ניאון הכלאה באתר (FISH) לחזרות דנ"א telomeric. 

Video: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many proteins. Classic imaging techniques have been used to study these phenomena. However, they required the manual acquisition of many cells followed by time consuming quantification of the morphology and the co-localization of the staining of tens of cells. Here, a rapid and powerful method is described to study these phenomena on samples consisting of several thousands of cells using an imaging flow cytometry technology that combines the advantages of a microscope with those of a cytometer. Using T lymphocytes stimulated with CCL19 and staining for MHC Class I molecules and filamentous actin, a gating strategy is presented to measure simultaneously the degree of shape alterations and the extent of co-localization of markers that are affected by CCL19 signaling. Moreover, this gating strategy allowed us to observe the segregation of filamentous actin (at the front) and phosphorylated Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) proteins (at the rear) in polarized T cells after CXCL12 stimulation. This technique was also useful to observe the blocking effect on polarization of two different elements: inhibition of actin polymerization by a pharmacological inhibitor and expression of mutants of the Par6/atypical PKC signaling pathway. Thus, evidence is shown that this technique is useful to analyze both morphological alterations and protein redistributions.

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

ניתוח מהיר וחזק של תאי ומולקולרי קיטוב המושרה על ידי chemokine איתות

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...