Name: rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Diese Arbeit wird von NIH R00 CA160574 (SFB) und durch eine Gemeinschaft der Rutgers Biotechnologie Training Program (SMM) unterstützt.

Dieses Verfahren wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Rutgers, der State University of New Jersey genehmigt. Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt. Wissenschaftler sollten ihre nationalen und institutionellen Tierorganisationen für etablierte und genehmigten Richtlinien konsultieren. Bevor Sie beginnen, bereiten die in Tabelle 1 aufgeführten Lösungen. 1. B-Zell-Isolierung und Aktivierung Euthanize eine Maus mit CO 2, gefolgt durch zervikale Dislokation. Bewegen Sie die Maus, so dass die linke Seite des Körpers ist und sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, bis das Fell ist feucht. Sezieren die Milz und in einem 35-mm-Gewebekulturschale mit 2 ml Waschpuffer. In einer Steril, sanft brechen die Milz in der Gewebekulturschale mit dem flachen Ende einer 5-ml-Spritze. <ol><li> Legen Sie eine 70 um Nylon-Mesh in einen 50ml-Tube und die Milz Probentransfer in 2 ml Waschpuffer in die Nylon-Mesh. Stören Sie vorsichtig die Milz in die Maschen mit dem flachen Ende der Spritze. </li><li> Spülen Sie die Rückseite der Spritze und die 35 mm-Platte mit 8 ml Waschpuffer und filtern durch die 70 um Nylon-Mesh. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Absaugen und den Überstand verwerfen und das Pellet in 3 ml ACK-Lysepuffer. Pipette auf und ab kurz, um Klumpen zu stören und Inkubation für 5 min. 10 ml Waschpuffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Absaugen und den Überstand verwerfen und das Pellet durch Antippen der Boden der Röhre dann durch Pipettieren in 1 ml Waschpuffer. Fügen Sie 50 ul von anti-CD43 MACS-Mikroperlen und Inkubation auf Eis für 30 min. 10 ml Waschpuffer, vorsichtig mischen und zentrifugieren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C. 10 ml Waschpuffer, vorsichtig mischen und zentrifugieren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Richten Sie einMini-MACS-Säule, indem Sie eine Spalte auf der MACS-Magnet. Positionieren Sie eine markierte 15 ml konischen Röhrchen unter der Spalte. 1 ml Waschpuffer, um Spalte und zu ermöglichen, durch den 15-ml-Tube laufen. </li><li> Aspiration des Überstands und Resuspendieren in 1 ml Waschpuffer. Legen Sie die Probe in der Spalte nach der Waschpuffer durchgelaufen ist. </li><li> Nachdem die Probe durch die Säule laufen, 1 ml Waschpuffer, um die Säule zu waschen. 7 ml Waschpuffer direkt mit der gesammelten Probe in 15 ml Röhrchen. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Übertragen Sie das erforderliche Volumen der Zellen, die für 5.000.000 Zellen benötigt / Well in einer 50 ml Tube. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Supplement B-Zell-Medium mit LPS 1: 500 und IL4 1: 1.000. </li><li> Saugen Sie den Überstand und die erforderliche Menge von B-Zell-Medium ergänzt für die endgültige Konzentration von 1.000.000 Zellen / ml benötigt. </li><li> Plattenzellen in 6-well-Platten mit 5 ml Zellen bei 1.000.000 Zellen / ml und in einer humidifiED Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2. B-Zell-Fixierung <ol><li> Dann werden 50 ul Colcemid in die Vertiefung, die 5 ml von B-Zellen (bei einer Endkonzentration von 100 ng / ml) und Inkubation 1 h bei 37 ° C aufweist. Vorwärmen 75 mM KCl-Lösung in einem 37 ° C Wasserbad. Übertragen Sie die B-Zellen mit einer markierten 15-ml-Tube. Decken das Etikett mit Band und Zentrifuge bei 300 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie den Überstand, wobei 1 ml in die Röhre und das Pellet durch Pipettieren. 5 ml des vorgewärmten KCl Tropfen für Tropfen, während die Erschließung oder pulsierend auf einem Vortex. </li><li> 10 ml KCl und mischen durch Invertieren. Inkubieren in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. 5 Tropfen frischen Fixiermittel und Mischung durch Umdrehen. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Saugen Sie den Überstand, wobei 1 ml in der Tube und Pellet erneut durch Pipettieren von oben und unten. </li><li> 5 ml frischem Fixativ tropfen beim Tippen oder pulsierend auf einem VORtex. Fügen Sie eine zusätzliche 10 ml Fixiermittel und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Saugen Sie den Überstand, wobei 1 ml in Rohr und resuspendieren durch Pipettieren. Hinzufügen 14 ml frisches Fixiermittel und Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.7 noch zweimal. </li><li> Fügen Sie 14 ml frischem Fixativ. Verschließen Sie die Kappen mit Parafilm und über Nacht bei -20 ° C. </li></ol> 3. Vorbereitung der Metaphasechromosom Spreads <ol><li> Stellen Sie eine geregelte Klimakammer auf 22,9 ° C und 52% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Zentrifuge die Fest B-Zellen bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Absaugen lassen Fixativ 70 ul in der Röhre und resuspendieren durch Pipettieren. </li><li> Zeigen markierten Folien in der Feuchtkammer bei 35 ° Winkel. Fallen 35 ul der resuspendierten B-Zellen auf einem Objektträger und legen zwei Folien pro Probe. Die Objektträger in der feuchten Kammer für 30 Minuten trocknen dann speichern Sie die Folienin einer Dia-Box bei 37 ° C aufweist. </li></ol> 4. Telomere PNA FISH <ol><li> Vorbereitung der Probe <ol><li> Vorwärmen entionisiertem Formamid bis 37 ° C beträgt. Mix 2 ul Telomer PNA-Sonde mit 7 ul entionisiertem Formamid vorgewärmt und bei 37 ° C unter Schütteln für 1 Stunde. </li><li> Pre-Master-Mix warmen FISH auf 37 ° C. Hinzufügen 7 ul vorgewärmt FISH Master-Mix auf die Mischung aus Schritt 4.1.1 und bei 37 ° C für 1-3 Stunden. </li><li> Denaturierung der Sonde Gemisch 8 min bei 80 ° C aufweist. Pre-Annealing der Sonde für 1 Stunde bei 37 ° C aufweist. </li></ol></li><li> Vorbehandlung der Chromosomen Slides <ol><li> Pre-wärmen einen Objektträger aus Glas-Küvette mit 50 ml 0,01 M HCl auf 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Die Objektträger in einem anderen Glasträger-Färbung Gefäß mit 2x SSC für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Add 2 ul Pepsin Lager an die vorgewärmten Objektträger aus Glas-Küvette und mischen durch Invertieren. Die Objektträger in diesem Glas slide-Küvette und Inkubation 90 Sekunden bei 37 ° C. </li><li> Waschen Sie die Slides 2x in einer anderen Glasträger-Küvette aus 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur unter Schütteln. Dann waschen Sie die Folien für 5 min in 1x PBS / MgCl 2 bei Raumtemperatur, Zittern. </li><li> Die Objektträger in einem Glasobjektträger-Küvette mit frisch zubereiteten 1% Formaldehyd / 1x PBS / MgCl 2 für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Folien für 5 min in einem anderen Glasträger-Küvette aus 1x PBS bei Raumtemperatur unter Schütteln. </li><li> Bereiten Sie eine Ethanol-Dehydratisierung Serie von mit getrennten Glasobjektträger-Küvetten mit 70%, 90% und 100% Ethanol. </li><li> Die Objektträger in jedes Glas für 3 min, beginnend mit 70% Ethanol, 90% Ethanol, dann, und dann 100% Ethanol. Zeigen Ethanol Gläser bei -20 ° C, wenn Sie fertig. </li><li> Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen, indem überschüssige Ethanol auf ein Papiertuch und stützte Objektträger bei 35 ° Winkel. Einmal trocken, mark ein 18 x 18 mm-Bereich für eine Hybridisierung an der Rückseite der Führungen mit einem Diamantstift. </li></ol></li><li> Denaturierung der Objektträger für FISH <ol><li> Gelten 120 ul 70% deionisiertem Formamid / 2X SSC zu einem 24 x 60 mm Deckglas. Tippen Sie auf die Folie, um das Deckglas. Denaturieren die Folie bei 80 ° C auf einer Heizplatte für 90 Sekunden. </li><li> Schnell und vorsichtig aus dem Deckglas und legen Sie die Folie in eiskaltem 70% Ethanol für 3 min, gefolgt von 90% Ethanol und 100% Ethanol jeweils für 3 min. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen. </li><li> Bereiten Sie eine feuchte Kammer von Futter eine Kunststoff-Box mit einem dichten Deckel und nasse Seidenpapier. Das Papier sollte feucht sein, aber nicht mit Wasser gesättigt ist. </li><li> In einer feuchten Kammer, gelten die vorgeglüht Sonden-Mix aus Schritt 4.1.3 markierten Bereich auf der Folie, Deckel mit einem 18 x 18 mm Deckglas und bei 37 ° C für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Post-Inkubation Waschanlagen <ol><li> Pre-warmen 50% Formamid / 2x SSC, 1x SSC, und 4x SSC / 0,1% Tween-20 in einem 45 °; C Wasserbad. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser und waschen Sie die Folien in vorgewärmten 50% Formamid / 2x SSC 3xfor jeweils 5 min im Dunkeln und Schütteln. Jedem Wasch die Folien in vorgewärmten 1x SSC 3xfor 5 min Schütteln. Schließlich, waschen Sie die Folien in vorgewärmten 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor jeweils 5 min. </li><li> Färben die Folien für 3 min in DAPI in einem lichtgeschützten Glasobjektträger-Küvette. </li><li> Für 5 min in 2x SSC waschen Sie die Dias, schüttelnd. Bewerben 35 ul Mowiol Mounting Medium, Deckel mit 24 x 60 mm Deckgläser und Objektträger bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Die mikroskopische Analyse der Chromosomen <ol><li> Analysieren Sie die Metaphase Dias mit einem Standard-Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop. Verwenden Sie ein Imaging-Plattform mit einem automatisierten Stufe wie die MetaSystems Metafer Plattform, um die besten Ergebnisse zu erhalten. Für jeden Metaphasespreitung ein Bild für das Fluoreszenzsignal von der Telomer-p, sammeln ein Bild für DAPI-Fluoreszenz zu Chromosomen sichtbar zu machen, undRobe. (ZB sind Cy3 andere Fluorophore verfügbar und arbeiten gleich gut.) </li><li> Überlagern die Bilder mit einem Bildanalyse-Programm und zu analysieren. </li></ol>

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Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen.

Wohingegen aktivierte B-Lymphozyten sind besonders zur Herstellung von mitotischen Chromosomen-Spreads geeignet, können andere Zelltypen verwendet werden. T-Lymphozyten zu teilen viele der Vorteile von B-Zellen, wie sie aus der Milz oder den Lymphknoten gereinigt werden, und haben einen hohen mitotischen Index, wenn durch das Wachstum in Medium mit geeigneter Mitogene 8 stimuliert. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind auch für Metaphasechromosom Analyse 9 geeignet. Wenn diese nicht vorhanden s...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Krebs wird durch die Akkumulation von Mutationen, die Gene, die die normale Zellwachstum regulieren verursacht. Mutation ist eine Folge von Änderungen in der Struktur und Sequenz des Genoms von DNA-Schäden verursacht. DNA-Schädigungen können durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich exogener Agenzien wie ionisierende Strahlung auftritt, und als ein Nebenprodukt des normalen Zellstoffwechsels, wie zum Beispiel spontane Desaminierung von Nukleotidbasen oder Beschädigung durch Kontakt mit reaktiven Sauerstoffspezies 1 auftritt. Obwohl Säugetierzellen besitzen eine Reihe von Aktivitäten, die Reparatur von DNA-Schäden rückgängig zu machen oder wiederherzustellen die Reihenfolge Bruchstellen können Mutationen dennoch während der gesamten Lebensdauer einer Zelle akkumulieren. DNA-Schädigungen können ferner dazu beitragen, Seneszenz und Verlust der Potenz von Stammzellen, zwei Verfahren, die mit dem Altern verbundene Erkrankung 2 zugeordnet sind. Das Verständnis der Reparatur von DNA-Schäden ist daher von zentraler Bedeutung bei der Bewältigung zwei Zeichenificant in der öffentlichen Gesundheit. Zunehmende Hinweise darauf, dass Säugetier-DNA Reparaturwege können auf die Entwicklung der Krebszellgenom 3,4 beitragen, so dass es umso wichtiger, die Prozesse bei der Unterdrückung Mutation auf molekularer Ebene zu verstehen. Direkte Visualisierung von Chromosomenaberrationen ist ein leistungsfähiges und quantitative mittels Bestimmung des Ausmaßes der genomische Instabilität in einem bestimmten Zelltyp. Kondensierte Chromosomen von Zellen in der Metaphase kann isoliert und untersucht unter Verwendung von Licht oder Fluoreszenzmikroskopie. Solche zytogenetische Ansätze wurden in der Praxis seit Jahrzehnten und kann verwendet werden, um das Auftreten von Translokationen oder spezifische Typen von Chromosomenaberrationen unter Verlust von DNA-Reparatur-Aktivitäten assoziiert nachzuweisen. Das Protokoll eignet sich für mehrere potenzielle Erweiterungen: Chromosomen können mit Sonden zur spektralen Karyotypisierung (SKY) oder mehrfarbige Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung gekennzeichnet werden(MFISH) für die Umsiedlung 5,6 identifizieren. Diese Techniken ermöglichen auch die Häufigkeit der Chromosomentranslokationen und die Struktur komplexer Chromosomentranslokationen zu bestimmen, die über das mit diesem Protokoll ist es möglich zusätzliche Informationen bietet. Alternativ können sequenzspezifische Sonden erzeugt und verwendet, um die Häufigkeit von DNA-Bruch an ausgewählten Standorten genomischen 7 getestet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir Herstellung von Metaphasen-Chromosomen-Spreads von B-Lymphozyten. Ein fluoreszenzmarkierten Peptid-Nukleinsäure (PNA) Sonde für Telomerabschnitten verwendet wird, die wirksam markiert Telomere in Metaphase-Chromosomen verteilt Dieses Protokoll hat mehrere Vorteile. B-Zellen induziert werden kann, um bei hohen Mitoseindex wachsen, so dass hochwertige Spreads konsistent hergestellt werden. B-Zellen von genetisch veränderten Mäusen sind auch viel weniger wahrscheinlich, dass sekundäre genetische Mutationen, die die Analyse des Beitrags verwechseln können, enthaltenspezifischer Gene zu genomischen Integrität. Die PNA-FISH-Ansatz kann in einem Tag abgeschlossen werden, und ermöglicht eine genauere Wertung der Chromosomenbrüche. Durch die Nutzung dieser Ansatz, insbesondere in Kombination mit in diesem Protokoll beschriebenen spezifischen Geräten ist es möglich, sehr konsequent, hochwertige Brotaufstriche produzieren und schnell analysieren die Geschwindigkeit und Art der genomische Instabilität.

<table><tbody><tr><td>50% Dextran sulfate</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &amp;mu;g)</td><td>Sigma</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA Telomere Probe</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) micro-beads</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td><td>Thermotron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

Defekten DNA-Reparatur zu genomischer Instabilität, die die Ursache für Mutationen, die zu Tumorentstehung führen wird erhöht. Analyse der Häufigkeit und Art der Chromosomenaberrationen in verschiedenen Zelltypen ermöglicht Defekte in DNA-Reparaturwege aufgeklärt werden. Verständnis Säugetierbiologie DNA-Reparatur hat sich stark durch die Produktion von Mäusen mit Knockouts in bestimmten Genen geholfen. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität in Maus-B-Lymphozyten zu quantifizieren. Kennzeichnung der Telomere mit PNA-FISH-Sonden (Peptid-Nukleinsäure - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) ermöglicht die schnelle Analyse von genomischen Instabilität in Metaphasechromosom Spreads. B-Zellen haben spezifische Vorteile gegenüber Fibroblasten, weil sie normale Ploidie und eine höhere mitotische Index haben. Kurzzeitkultur von B-Zellen ermöglicht daher eine genaue Messung der genomischen Instabilität in einer primären Zellpopulation, die voraussichtlich weniger Neben genetische Mutation ists als das, was in der Regel in transformierten Fibroblasten oder Patientenzelllinien gefunden.

Metaphase-Chromosomen aus einer Zelle stamm eine diskrete Cluster, die 40 Chromosomen (bei ​​Verwendung von Mauszellen) (1A) zu bilden. Jedes Chromosom hat einen Zentromer an einem Ende, die als Licht blaue Kugel sichtbar ist. Im normalen Chromosomen sind zwei Telomer Signale am Ende der Chromatiden und zwei Signale, die von jedem Romer gesehen. Interphase-Kernen auf der Folie zugegen sein. Diese werden als blaue Kugeln, mit rotem Telomer-Signale, aber keine kondensierten Chromosomen (siehe zum Beis...

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Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

DNA-Reparaturwege sind wichtig für die Erhaltung der genomischen Integrität und Mutation verhindert und Krebs. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität durch direkte Beobachtung von Chromosomenaberrationen in Metaphase-Spreads Quantifizierung von Maus-B-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) für Telomer-DNA-Wiederholungen.

Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

rapid-analysis-chromosome-aberrations-mouse-b-lymphocytes-pna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.9K Aufrufe.  Rutgers, the State University of New Jersey.  DNA-Reparaturwege sind wichtig für die Erhaltung der genomischen Integrität und Mutation verhindert und Krebs. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität durch direkte Beobachtung von Chromosomenaberrationen in Metaphase-Spreads Quantifizierung von Maus-B-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) für Telomer-DNA-Wiederholungen. 

Serie: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. To assess the impact of PM on nuclear genetic integrity, structural chromosomal aberrations are scored in the metaphase spreads of mouse RAW264.7 macrophage cells. PM is collected from ambient air with a high volume total suspended particles sampler. The collected material is solubilized and filtered to retain the water-soluble, fine portion. The particles are characterized for chemical composition by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Different concentrations of particle suspension are added onto an in vitro culture of RAW264.7 mouse macrophages for a total exposure time of 72 hr, along with untreated control cells. At the end of exposure, the culture is treated with colcemid to arrest cells in metaphase. Cells are then harvested, treated with hypotonic solution, fixed in acetomethanol, dropped onto glass slides and finally stained with Giemsa solution. Slides are examined to assess the structural chromosomal aberrations (CAs) in metaphase spreads at 1,000X magnification using a bright-field microscope. 50 to 100 metaphase spread are scored for each treatment group. This technique is adapted for the detection of structural chromosomal aberrations (CAs), such as chromatid-type breaks, chromatid-type exchanges, acentric fragments, dicentric and ring chromosomes, double minutes, endoreduplication, and Robertsonian translocations in vitro after exposure to PM. It is a powerful method to associate a well-established cytogenetic endpoint to epigenetic alterations.

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

This protocol describes techniques for the quantification and characterization of chromosomal aberrations in vitro in RAW264.7 mouse macrophages after treatment with ambient air particulate matter.

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Forschung

Genetik

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

FISH für Präimplantations-Diagnostik

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

Medizin

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Krebsforschung

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Erkennung von numerischen und strukturellen Veränderungen in alle 24 menschlichen Chromosomen gleichzeitig unter Verwendung eines neuartigen OctoChrome FISH-Test

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Biologie

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the variable coding exons of the Ig heavy and light chain gene loci. This process of somatic hypermutation (SHM) requires the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID), which converts deoxycytidines (C), into deoxyuridines (U). Processing the AID-generated U:G mismatches into mutations by the base excision and mismatch repair pathways introduces new Ig coding sequences that may produce a higher affinity Ig. Mutations in AID or DNA repair genes can block or significantly alter the types of mutations observed in the Ig loci. We describe a protocol to quantify JH4 intron mutations that uses fluorescence activated cell sorting (FACS), PCR, and Sanger sequencing. Although this assay does not directly measure Ig affinity maturation, it is indicative of mutations in Ig variable coding sequences. Additionally, these methods utilize common molecular biology techniques which&#160;analyze&#160;mutations in Ig sequences of multiple B cell clones. Thus, this assay is an invaluable tool in the study of SHM and Ig diversification.

Presented here is an assay to quantify somatic hypermutation within the immunoglobulin heavy chain gene locus using germinal center B cells from mouse Peyer&#8217;s patches.

Analyse der somatischen Hypermutation im JH4-Intron von Keimzentrums-B-Zellen aus Maus Peyers Patches

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the ...

Immunologie und Infektion

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and T lymphocytes. Studies of zebrafish lymphopoiesis are difficult because antibodies recognizing D. rerio cell surface markers are generally not available, complicating isolation and characterization of different lymphocyte populations, including B-lineage cells. Transgenic lines with lineage-specific fluorophore expression are often used to circumvent this challenge. The transgenic lck:eGFP line has been used to study D. rerio T cell development, and has also been utilized to model T cell development and acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Although lck:eGFP fish have been widely used to analyze the T-lineage, they have not been used to study B cells. Recently, we discovered that many zebrafish B cells also express lck, albeit at lower levels. Consequently, lck:eGFP B cells likewise express low levels of GFP. Based on this finding, we developed a protocol to purify B-lineage cells from lck:eGFP zebrafish, which we report here. Our method describes how to utilize a fluorescent-activated cell sorter (FACS) to purify B cells from lck:eGFP fish or related lines, such as double-transgenic rag2:hMYC; lck:eGFP fish. In these lines, B cells, particularly immature B cells, express GFP at low but detectable levels, allowing them to be distinguished from T cells, which express GFP highly. B cells can be isolated from marrow, thymus, spleen, blood, or other tissues. This protocol provides a new method to purify D. rerio B cells, enabling studies focused on topics like B cell development and B lymphocyte malignancies.

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Transgenic lck:eGFP zebrafish express GFP highly in T lymphocytes, and have been used to study T cell development and acute lymphoblastic leukemia. This line can be used to study B cells, which express lck at lower levels. This protocol describes purification of malignant and non-malignant B cells from lck:eGFP zebrafish.

Bösartig und B-Zellen nicht bösartig aus Lck:eGFP Zebrafisch zu isolieren

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

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Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz