Ce travail est soutenu par le NIH subvention R00 CA160574 (SFB) et par une bourse du Programme de formation en biotechnologie Rutgers (à SMM).

Cette procédure a été approuvée par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle à l&#39;université Rutgers, l&#39;Université d&#39;État du New Jersey. Les souris ont été traitées en conformité avec le Guide NIH pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Les scientifiques devraient consulter leurs organisations nationales et institutionnelles animaux de lignes directrices établis et approuvés. Avant de commencer, préparer les solutions énumérées dans le tableau 1. 1. cellules B Isolement et activation Euthanasier une souris à l&#39;aide de CO 2 suivie d&#39;une dislocation cervicale. Placez la souris de sorte que le côté gauche du corps est en pulvériser la souris avec 70% d&#39;éthanol jusqu&#39;à ce que la fourrure est humide. On dissèque la rate et le placer dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm avec un tampon de lavage 2 ml. Dans une hotte à flux laminaire, casser doucement la rate dans la boîte de culture tissulaire en utilisant l&#39;extrémité plate d&#39;une seringue de 5 ml. <ol><li> Insérer un filet de nylon 70 um dans un 50ml tube et transférer l&#39;échantillon de la rate dans 2 ml de tampon de lavage dans la maille de nylon. Perturber doucement la rate dans le maillage en utilisant la partie plate de la seringue. </li><li> Rincer à l&#39;arrière de la seringue et la plaque de 35 mm avec 8 ml de tampon de lavage et filtrer à travers la maille 70 um de nylon. Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer et jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 3 ml de tampon de lyse ACK. Introduire à la pipette de haut en bas brièvement perturber bouquets et incuber pendant 5 min. Ajouter 10 ml de tampon de lavage et centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer et jeter le surnageant et remettre en suspension le culot en appuyant sur le fond du tube, puis par pipetage dans 1 ml de tampon de lavage. Ajouter 50 ul d&#39;anticorps anti-CD43 microbilles MACS et laisser incuber sur de la glace pendant 30 min. Ajouter 10 ml de tampon de lavage, mélanger délicatement et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Ajouter 10 ml de tampon de lavage, mélanger délicatement et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Mettre en place unMini-MACS colonne en plaçant une colonne sur l&#39;aimant MACS. Placer un tube de 15 ml conique située sous la colonne. Ajouter 1 ml de tampon de lavage à colonne et le laisser courir à travers le tube de 15 ml. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de tampon de lavage. Chargez l&#39;échantillon dans la colonne après le tampon de lavage a parcouru. </li><li> Après que l&#39;échantillon a parcourir la colonne, ajouter 1 ml de tampon de lavage pour laver la colonne. Ajouter 7 ml de tampon de lavage directement à l&#39;échantillon prélevé dans le tube de 15 ml. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Transférer le volume requis de cellules nécessaires pour 5.000.000 cellules / puits dans un tube de 50 ml. Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Supplément milieu des cellules B avec des LPS à 1: 500 et IL4 1: 1000. </li><li> Aspirer le surnageant et ajouter le volume approprié de milieu de lymphocytes B supplémenté nécessaire à la concentration finale de 1.000.000 cellules / ml. </li><li> cellules de la plaque dans des plaques de 6 puits avec 5 ml de cellules à 1.000.000 cellules / ml et placer dans un humidified incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2 cellules B Fixation <ol><li> Ajouter 50 ul de la colcémide pour le puits contenant 5 ml de cellules B (pour une concentration finale de 100 ng / ml) et incuber 1 h à 37 ° C. Préchauffer solution à 75 mM de KCl dans un bain-marie à 37 °. Transférer les cellules B à un 15 ml étiqueté tube. Couvrir l&#39;étiquette avec un ruban et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant en laissant 1 ml dans le tube et remettre en suspension le culot par pipetage. Ajouter 5 ml de la baisse de KCl préchauffé à goutte tout en tapant ou pulsation sur un vortex. </li><li> Ajouter 10 ml de KCl et mélanger en inversant. Incuber dans un bain d&#39;eau à 37 ° pendant 15 min. Ajouter 5 gouttes de fixateur frais et mélange par inversion. Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant en laissant 1 ml dans le tube et remettre le culot par aspiration et refoulement. </li><li> Ajouter 5 ml de baisse du fixateur frais à goutte tout en tapant ou pulsation sur une vortex. Ajouter 10 ml supplémentaires de fixateur et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant en laissant 1 ml dans le tube et remettre en suspension par pipetage. Ajouter 14 ml de fixateur frais et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.7 fois plus. </li><li> Ajouter 14 ml de fixateur frais. Sceller les bouchons avec du Parafilm et stocker la nuit à -20 ° C. </li></ol> 3 Préparation des étalements de chromosomes en métaphase <ol><li> Définir une chambre environnementale régulée à 22,9 ° C et 52% d&#39;humidité. </li><li> Centrifugeuse les cellules B fixé à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer fixateur laissant 70 pi dans le tube et remettre en suspension par pipetage. </li><li> Placer les lames marquées dans la chambre d&#39;humidité à un angle de 35 °. Baisse de 35 pi des cellules B remises en suspension sur une lame et déposer deux diapositives par échantillon. Laisser sécher les lames dans la chambre humide pendant 30 min, puis stocker les diapositivesdans une boîte, à 37 ° C. </li></ol> 4. télomères PNA FISH <ol><li> Préparation de la sonde <ol><li> Formamide désionisée pré-chaud à 37 ° C. Mélanger 2 pi de sonde de PNA avec des télomères formamide préchauffé 7 pi désionisée et incuber à 37 ° C sous agitation pendant 1 heure. </li><li> Préchauffer maître FISH mélange à 37 ° C. Ajouter 7 pi préchauffé maître FISH mélange au mélange de l&#39;étape 4.1.1 et incuber à 37 ° C pendant 1-3 heures. </li><li> Dénaturer le mélange de la sonde pendant 8 min à 80 ° C. Pré-recuire la sonde pendant 1 heure à 37 ° C. </li></ol></li><li> Le prétraitement des diapositives chromosomiques <ol><li> Pré-réchauffer un bocal en verre coulissante coloration contenant 50 ml de HCl 0,01 M à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Placer les lames dans un pot différent lame de verre-coloration contenant 2x SSC pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 2 ul de la pepsine actions pour le verre préchauffé pot coulissant coloration et mélanger en inversant. Placer les lames dans ce sl de verrepot ide-coloration et incuber 90 secondes à 37 ° C. </li><li> Laver les lames 2x dans un bocal en verre coulissant différente coloration contient 1x PBS pendant 5 min de chaque à la température ambiante en agitant. Ensuite, laver les lames pendant 5 min dans du PBS 1X / MgCl 2 à la température ambiante en agitant. </li><li> Placer les lames dans un bocal en verre coulissante coloration fraîchement préparé contenant 1% de formaldéhyde / PBS 1x / MgCl 2 pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver les lames pendant 5 min dans un bocal en verre coulissant différente coloration contient 1x PBS à température ambiante en agitant. </li><li> Préparer une série de déshydratation de l&#39;éthanol en avoir séparé les bocaux en verre coulissante coloration contenant 70%, 90% et 100% d&#39;éthanol. </li><li> Placer les lames dans chaque pot pendant 3 minutes, en commençant avec 70% d&#39;éthanol, puis 90% d&#39;éthanol, puis 100% d&#39;éthanol. Placez les pots d&#39;éthanol à -20 ° C lorsque vous avez terminé. </li><li> Laisser les lames sécher à l&#39;air en appuyant sur un excès d&#39;éthanol sur une serviette en papier et étaiement diapositives à un angle de 35 °. Une fois sec, maRK une zone de 18 x 18 mm pour l&#39;hybridation sur le dos des lames à l&#39;aide d&#39;un stylet en diamant. </li></ol></li><li> La dénaturation des lames de FISH <ol><li> Appliquer formamide 120 ul 70% déminéralisée / 2X SSC à un 24 x 60 mm lamelle. Appuyez sur la diapositive à la lamelle. Dénaturer la lame à 80 ° C sur une plaque chaude pendant 90 secondes. </li><li> Coulisser rapidement et soigneusement la lamelle couvre-objet et de placer la lame dans la glace froide éthanol à 70% pendant 3 min, suivie de 90% d&#39;éthanol, et 100% d&#39;éthanol pour chaque 3 min. Laisser les lames sécher à l&#39;air. </li><li> Préparer une chambre humide en alignant une boîte en plastique avec un couvercle étanche et papier de soie humide. Le papier doit être humide, mais pas saturé d&#39;eau. </li><li> Dans une chambre humide, appliquer le mélange de la sonde pré-recuit de l&#39;étape 4.1.3 pour la zone marquée sur la lame, couvrir avec un couvercle de glissement mm 18 x 18 et incuber à 37 ° C pendant 1 heure. </li></ol></li><li> Lavage post-incubation <ol><li> Préchauffer 50% de formamide / SSC 2x, 1x SSC et 4x SSC / 0,1% de Tween-20 à 45 °; Bain d&#39;eau. </li><li> Retirez délicatement les lamelles et laver les lames dans préchauffé 50% de formamide / 2x SSC 3xfor 5 min chacun dans l&#39;obscurité et la secousse. Laver les lames dans préchauffé 1x SSC 3xfor 5 min chacun, secouant. Enfin, laver les lames dans préchauffé 4x SSC / 0,1% de Tween-20 3xfor 5 min chacun. </li><li> Colorer les lames pendant 3 min dans DAPI dans un bocal en verre coulissant de coloration lumière protégée. </li><li> Laver les lames pendant 5 min dans du SSC 2x, secouant. Appliquer 35 pi de milieu de montage Mowiol, couvrir avec 24 x 60 mm lamelles et stocker les lames à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5 L&#39;analyse microscopique des chromosomes <ol><li> Analyser les diapositives en métaphase l&#39;aide d&#39;un microscope à épifluorescence standard. Utilisez une plate-forme d&#39;imagerie avec une étape automatisée telle que la plate-forme métasystèmes Metafer pour obtenir de meilleurs résultats. Pour chaque diffusion de la métaphase, de recueillir une image de fluorescence DAPI pour visualiser les chromosomes, et une image pour le signal fluorescent du télomère probe. (Par exemple, d&#39;autres substances fluorescentes Cy3 sont disponibles et fonctionnent aussi bien.) </li><li> Superposition des images avec un programme d&#39;analyse d&#39;image et d&#39;analyser. </li></ol>

<ol>
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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflits d&#39;intérêts.

Alors que les lymphocytes B activés sont particulièrement adaptés à la préparation des étalements de chromosomes mitotiques, d&#39;autres types de cellules peuvent également être utilisés. Lymphocytes T part un grand nombre des avantages de cellules B, comme elles peuvent être purifiées à partir de ganglions lymphatiques ou de la rate, et ont un indice mitotique élevé lorsqu&#39;ils sont stimulés par la croissance dans un milieu contenant des mitogenes appropriés 8. Les cellules souches embryo...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Le cancer est causé par l&#39;accumulation de mutations affectant les gènes qui régulent la croissance cellulaire normale. Mutation est une conséquence de changements dans la structure et la séquence du génome causée par des dommages à l&#39;ADN. lésions de l&#39;ADN peut se faire par une variété de processus, y compris des agents exogènes tels que des rayonnements ionisants, et en tant que sous-produit du métabolisme cellulaire normal, comme la désamination spontanée de bases nucléotidiques ou des dommages survenus par contact avec des espèces réactives de l&#39;oxygène 1. Bien que les cellules de mammifères possèdent une gamme d&#39;activités de réparation qui peuvent inverser les dommages de l&#39;ADN ou de rétablir l&#39;ordre sur les sites de coupure, les mutations s&#39;accumulent néanmoins tout au long de la durée de vie d&#39;une cellule. dommage de l&#39;ADN peut en outre contribuer à la sénescence et la perte d&#39;activité de cellules souches, deux processus qui sont associées à la maladie de vieillissement associée à deux. Comprendre la réparation des lésions de l&#39;ADN est donc d&#39;une importance capitale dans la lutte contre deux signequestions ificant en matière de santé publique. Plus de preuves suggère que les mammifères voies de réparation d&#39;ADN peuvent contribuer à l&#39;évolution du génome des cellules cancéreuses 3,4, ce qui rend encore plus impératif de comprendre les processus impliqués dans la répression de mutation au niveau moléculaire. La visualisation directe des aberrations chromosomiques est un moyen puissant et quantitatifs de déterminer l&#39;étendue de l&#39;instabilité génomique dans un type cellulaire particulier. Chromosomes condensés à partir de cellules en métaphase peuvent être isolés et contrôlés en utilisant la microscopie à fluorescence ou la lumière. Ces approches cytogénétiques ont été dans la pratique depuis plusieurs décennies et peuvent être utilisés pour démontrer l&#39;apparition des translocations spécifiques ou les types d&#39;aberrations chromosomiques associées à la perte des activités de réparation d&#39;ADN. Le protocole se prête à plusieurs extensions potentielles: les chromosomes peuvent être marquées avec des sondes pour caryotype spectral (SKY) ou multicolore fluorescent hybridation in situ(MFISH) pour identifier des translocations 5,6. Ces techniques permettent également la fréquence des translocations chromosomiques et la structure de translocations chromosomiques complexes à déterminer, qui fournit des informations supplémentaires au-delà de ce qui est possible avec ce protocole. En variante, des sondes spécifiques des séquences peuvent être produites et utilisées pour tester la fréquence de cassure de l&#39;ADN génomique dans les sites sélectionnés 7. Dans ce protocole, nous décrivons la préparation du chromosome métaphasique se propage à partir de lymphocytes B. Un acide nucléique peptidique (PNA) sonde marquée par fluorescence pour des répétitions télomériques est utilisé, qui marque de manière efficace les télomères se propage chromosome en métaphase Ce protocole présente plusieurs avantages. Les cellules B peuvent être amenés à se développer à l&#39;index mitotique élevé de sorte que les écarts de haute qualité peuvent toujours être produites. Cellules B de souris génétiquement modifiées sont aussi beaucoup moins susceptibles de contenir des mutations génétiques secondaires qui peuvent fausser l&#39;analyse de la contributionde gènes spécifiques à l&#39;intégrité du génome. L&#39;approche PNA-FISH peut être complété en une seule journée, et permet notation plus précise des cassures chromosomiques. En utilisant cette approche, en particulier en combinaison avec des équipements spécifiques décrites dans ce protocole, il est possible de produire de très cohérentes, les écarts de haute qualité et d&#39;analyser rapidement le taux et le type d&#39;instabilité génomique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

Réparation de l&#39;ADN défectueux entraîne une augmentation de l&#39;instabilité génomique, ce qui est la cause de mutations qui conduisent à la tumorigenèse. L&#39;analyse de la fréquence et le type d&#39;aberrations chromosomiques dans des types cellulaires différents permet défauts dans les voies de réparation d&#39;ADN à être élucidés. Compréhension des mammifères réparation de l&#39;ADN en biologie a été grandement aidé par la production de souris avec des coups de grâce dans les gènes spécifiques. L&#39;objectif de ce protocole est de quantifier l&#39;instabilité génomique dans les lymphocytes B de souris. Étiquetage des télomères en utilisant des sondes PNA-FISH (acide nucléique peptidique - hybridation fluorescente in situ) facilite l&#39;analyse rapide de l&#39;instabilité génomique des spreads métaphase chromosomiques. Les cellules B ont des avantages spécifiques par rapport à des fibroblastes, car ils ont une ploïdie normale et un indice mitotique élevé. Culture à court terme des cellules B permet donc une mesure précise de l&#39;instabilité génomique dans une population de cellules primaires qui est susceptible d&#39;avoir moins mutation génétique secondaires que ce que l&#39;on trouve généralement dans les fibroblastes transformés ou des lignées cellulaires de patients.

Chromosomes métaphasiques dérivés d&#39;une cellule doivent former un ensemble discret contenant 40 chromosomes (si l&#39;on utilise des cellules de souris) (figure 1A). Chaque chromosome a un centromère, à une extrémité, qui est visible comme une sphère de lumière bleue. Dans chromosomes normaux, deux signaux de télomères sont observés à la fin des chromatides et deux signaux de chaque centromère. Les noyaux en interphase seront présents sur la lame ainsi. Ceux-ci seront visibles comme d...

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Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Voies de réparation d&#39;ADN sont essentielles pour le maintien de l&#39;intégrité du génome et la prévention de la mutation et le cancer. L&#39;objectif de ce protocole est de quantifier l&#39;instabilité génomique par l&#39;observation directe des aberrations chromosomiques en métaphase se propage à partir de cellules B de souris en utilisant hybridation fluorescente in situ (FISH) pour les répétitions d&#39;ADN télomérique dans.

Analyse rapide des aberrations chromosomiques dans les lymphocytes B de souris par PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

rapid-analysis-chromosome-aberrations-mouse-b-lymphocytes-pna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K vues.  Rutgers, the State University of New Jersey.  Voies de réparation d'ADN sont essentielles pour le maintien de l'intégrité du génome et la prévention de la mutation et le cancer. L'objectif de ce protocole est de quantifier l'instabilité génomique par l'observation directe des aberrations chromosomiques en métaphase se propage à partir de cellules B de souris en utilisant hybridation fluorescente in situ (FISH) pour les répétitions d'ADN télomérique dans.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Recherche

Immunologie et infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Méthodes d&#39;évaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolement des lymphocytes de souris muqueuses génitales Tract

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many proteins. Classic imaging techniques have been used to study these phenomena. However, they required the manual acquisition of many cells followed by time consuming quantification of the morphology and the co-localization of the staining of tens of cells. Here, a rapid and powerful method is described to study these phenomena on samples consisting of several thousands of cells using an imaging flow cytometry technology that combines the advantages of a microscope with those of a cytometer. Using T lymphocytes stimulated with CCL19 and staining for MHC Class I molecules and filamentous actin, a gating strategy is presented to measure simultaneously the degree of shape alterations and the extent of co-localization of markers that are affected by CCL19 signaling. Moreover, this gating strategy allowed us to observe the segregation of filamentous actin (at the front) and phosphorylated Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) proteins (at the rear) in polarized T cells after CXCL12 stimulation. This technique was also useful to observe the blocking effect on polarization of two different elements: inhibition of actin polymerization by a pharmacological inhibitor and expression of mutants of the Par6/atypical PKC signaling pathway. Thus, evidence is shown that this technique is useful to analyze both morphological alterations and protein redistributions.

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Analyse rapide et robuste de cellulaire et moléculaire de polarisation induite par des chimiokines de signalisation

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Détection de True IgE exprimant Souris B cellules de la lignée

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l&#39;analyse des lymphocytes infiltrant

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Protocole d&#39;isolation efficace pour B et les lymphocytes T à partir des amygdales palatines humaines

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Rapid Détection moléculaire et différenciation des virus grippaux A et B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Quantification rapide de blastogenesis mitogene induite dans les lymphocytes T pour l&#39;identification des médicaments immunomodulateurs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...