Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1. Protein Sample Buffer e preparazione <ol><li> Preparazione del campione: purificare le proteine ​​di interesse e assicurarsi che tutti gli aggregati vengono rimossi, iniettando la proteina prima dell&#39;esperimento su una colonna di gel-filtrazione o mediante ultracentrifugazione (di solito 10 min a 100.000 xg è sufficiente). NOTA: Anche se auspicabile, preparati proteici altamente puri non sono un must. SPR è stato utilizzato con successo con purificazioni tutt&#39;altro che perfetto e anche con l&#39;estratto totale 8,9. </li><li> Buffer Preparazione: <ol><li> Preparare il buffer dell&#39;esperimento (chiamato &quot;tampone di corsa&quot;, o RB). Per il protocollo qui descritto, utilizzare 50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM e 0,05% (w / v) DDM (n-dodecil β-D-maltoside). Tenere presente che la scelta della composizione buffer può essere facilmente modificato secondo il sistema studiato. </li><li> Filtrare tutti i tamponi e campioni di proteine ​​con 0.22 micron filtri. Assicurarsi in anticipo che i filtri siano proteicacompatibili. In generale, le piattaforme SPR recentemente commercializzati contengono una in-line de-Gasser; Se questo non è il caso, de-gas buffer prima dell&#39;uso. </li><li> Dializzare durante la notte o diluire i campioni contro il RB per evitare discordanze tampone. Dialisi (o qualsiasi altro metodo di scambio buffer) è particolarmente consigliabile quando si utilizzano sostanze chimiche ad alta viscosità (per esempio, saccarosio, glicerolo, DMSO). Prima di collegare la bottiglia RB alla pompa tenere da parte 10 ml di RB in un tubo separato. </li></ol></li><li> Diluire il ligando magazzino concentrato in RB ad una concentrazione finale di ~ 20 ug / ml. Come regola generale, per stabile ligando di immobilizzazione, utilizzare basse concentrazioni di ligando con iniezioni più a basso flusso, in contrapposizione ad alte concentrazioni, ad alto flusso e iniezioni più brevi. </li><li> Diluire l&#39;analita nel RB alla concentrazione desiderata. Tipicamente, testare la gamma di concentrazioni per un sistema di sconosciuta affinità da 10 pM a 10 nM in diluizioni di dieci volte. Iniziare semprecon le concentrazioni inferiori prime. </li></ol> 2. Sensor Chip <ol><li> Selezione Chip: utilizzare un acido nitrilotriacetico (NTA) del circuito integrato accoppiato adatto per catturare le proteine ​​con un tag oligo-istidina. </li><li> Utilizzo Chip: <ol><li> Quando si utilizza un nuovo chip, prendere il chip fuori dal fodero, lavare delicatamente con doppia acqua distillata (DDW), asciugare accuratamente rimanenti liquidi con tergicristalli delicati, e fare attenzione a non toccare la superficie strato di oro. Posizionare il chip nel fodero con l&#39;orientamento corretto (l&#39;inserimento è liscia quando il chip è posizionato correttamente). </li><li> Quando riutilizzare un chip, togliere il chip memorizzato dal buffer, sciacquare abbondantemente con DDW e asciugare delicatamente come detto in precedenza, e mettere nel fodero originale. NOTA: L&#39;accumulo di materiale spazzatura non specifici sul chip può influenzare il suo &#39;redditività&#39;. Questo può essere monitorato confrontando UR prima ligando immobilizzazione e post stripping. Anche se molte misure possono esserefatto utilizzando lo stesso chip NiNTA, la questione della sua longevità non è una &#39;netta&#39; e varia notevolmente tra i diversi chip. </li></ol></li><li> Chip attracco: Aprire la porta chip del sensore e posizionare il chip nel fodero. Quando si utilizza un nuovo chip, il numero di serie di input del chip di mantenere record di utilizzo. Chiudere la porta e premere &#39;di chip dock&#39;. </li></ol> 3. Impostazioni di temperatura <ol><li> Impostare la temperatura della cella di chip a 25 ° C (o la temperatura preferita esperimento). </li><li> Opzionale: impostare il vano campioni a 7 ° C per mantenere le proteine ​​stabile per tutto l&#39;esperimento. </li></ol> 4. Soluzioni per Caricamento e Spogliarello Preparare le seguenti soluzioni di carico e stripping: 0.5 mM NiCl 2 in RB, 350 mM EDTA a RB (aggiungere detersivo per soluzione di EDTA ad una concentrazione finale in RB), 0,25% SDS in H 2 O, e HCl 100 mM in H 2 O. Quando si utilizza micro-centrifuga vascaES e non SPR tubi designati, non dimenticate di tagliare i tappi dei tubi. 5. Prime strumento SPR con RB 6. Avviare una nuova corsa <ol><li> Impostare la portata che verrà utilizzato durante l&#39;esperimento. Per ottenere i risultati descritti qui impostare il flusso di 50 microlitri / min. NOTA: Questo parametro può essere modificato durante l&#39;esperimento. </li><li> Definire i percorsi di flusso e riferimento sottrazione. Per ottenere i risultati descritti qui definiti i percorsi Fc = 1 e Fc = 2, sottrazione Fc = 2-1. NOTA: Il programma visualizza in tempo reale la sottrazione di due celle di misura. Tenete a mente che questo parametro non può essere modificato durante l&#39;esperimento. </li><li> Selezionare il rack idoneo campione (che può influenzare il consumo di volume del campione). </li><li> Salvare il file dei risultati. </li></ol> 7. Cicli Experiment Ogni esperimento è composto da cicli, mantenere una chiara annotazione delle iniezioni fatte in EAciclo ch, e separare il carico dei ligandi &#39;, iniezione vuoto del buffer e l&#39;iniezione analita in diversi cicli. <ol><li> Ciclo 1: preparazione Chip e nichel carico <ol><li> Assicurarsi che il flusso e percorsi sono impostati secondo al punto 6.1 e 6.2. </li><li> Iniettare 350 mM EDTA per 1 min a lavare via gli avanzi. </li><li> Impostare il flusso a 10 ml / min. </li><li> Iniettare 0,5 NiCl mM 2 per 2 minuti. NOTA: Ora la resina chip è ricoperta da ioni nichel. </li></ol></li><li> Ciclo 2: ligandi immobilizzazione <ol><li> Impostare il flusso di 15 ml / min, percorso del flusso Fc = 2. </li><li> Iniettare ligando A fino a raggiungere valori RU che sono 10-20 volte del suo peso molecolare. Ad esempio, caricare un ligando di 50 kDa a 500-1000 IF. Tenere un registro del valore RU raggiunto. </li><li> Set flusso di 15 ml / min, percorso di flusso Fc = 1. </li><li> Iniettare ligando B (controllo) fino allo stesso valore di quella di RU ligando A. Monitorare il Sensogramma sottrazione (Fc = 2-1) on-line per aiutare a controllare ilLunghezza iniezione. </li><li> Impostare il flusso a 50 ml / min, percorso del flusso Fc = 1 e Fc = 2, lavare il sistema per 5-20 minuti fino a quando la linea di base (Fc = 2-1) stabilizza. </li></ol></li><li> Ciclo 3: iniezione Blank. Questa iniezione servirà per vuoto sottrazione, pertanto includere tutti i componenti che verranno iniettati con l&#39;analita, tranne dell&#39;analita stesso. NOTA: lunghezza iniezione può variare a seconda del tempo necessario per raggiungere l&#39;equilibrio (segnale plateau). <ol><li> Impostare il flusso di 15 ml / min, percorso del flusso Fc = 1 e Fc = 2, Fc = 2-1 sottrazione. </li><li> Inserire il comando &#39;attendere&#39; (denominato qui di seguito come &#39;aspettare&#39;) per 30 secondi (per avere una linea di base stabile). </li><li> Iniettare 15 sec RB. NOTA: La durata dell&#39;iniezione può variare tra sistemi diversi, a seconda delle loro costanti cinetiche pre-equilibrio (principalmente k a). </li><li> Attendere 120-600 sec per registrare la fase di dissociazione. NOTA: La lunghezza di questa fase varia secondo la <em&gt; k d: Più lenta la dissociazione del lungo questo passaggio deve essere. Per complessi dissociare molto lente (k d &lt;10 -4 sec -1), attendere 10-15 minuti e poi procedere alla superficie rigenerazione (vedi più avanti). </li></ol></li><li> Ciclo 4: iniezione Analita <ol><li> Copia / incolla le condizioni esatte utilizzate nella iniezione di riferimento (ciclo 3) così queste due iniezioni possono essere successivamente sottratti. Cambiare la posizione dello slot nel rack da quella contenente la soluzione di controllo a uno che contiene la soluzione di analita. Scegli una concentrazione che è leggermente superiore al previsto K D. Se alcuna conoscenza preliminare è disponibile, scegliere 1 micron come un buon punto di partenza. </li></ol></li><li> Ciclo 5: iniezione Buffer <ol><li> Ripetere il ciclo 3. </li></ol></li><li> Ciclo 6: iniezione Analita <ol><li> Ciclo Repeat 4. </li></ol></li><li> Ciclo 7: Chip spogliarsi <ol><li> Impostare il flusso a 50 ml / min. &lt;/ Li&gt; <li> Iniettare 350 mM EDTA per 1 min. Ripetere questa operazione altre due volte. Non utilizzare una singola iniezione di 3 min in quanto ciò potrebbe danneggiare il chip. </li><li> Iniettare 0,25% SDS per 1 min. Ripetere questa operazione altre due volte. Non utilizzare una singola iniezione di 3 min in quanto ciò potrebbe danneggiare il chip. </li><li> Se il livello di base non viene raggiunto, iniettare HCl 100 mm per 1 min, come ulteriore passo di stripping. </li><li> Inserire il comando &#39;fine corsa&#39; che passa alla modalità standby. </li></ol></li><li> Stoccaggio Chip <ol><li> Disancorare chip del sensore e portarlo dallo strumento. </li><li> Prendete il sensore fuori dal fodero, evitare di toccare la superficie, risciacquare con DDW, e posto in un tubo da 50 ml contenente RB. Conservare a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 8. analisi dei dati utilizzando Designated Evaluation Software <ol><li> Effettuare le seguenti operazioni per elaborare i dati grezzi ottenuti da SPR prima derivazione dei parametri cinetici. <ol><li> Utilizzando il software di valutazione, apertoil file dei risultati, selezionare cicli 3-6 Fc = 2-1 (riferimento dati sottratto). </li><li> Axis turno: <ol><li> Cicli di visualizzazione 3-6. </li><li> Zero il valore Y della linea di base (30 sec tempo di attesa iniziale in ogni ciclo) al di tutte e quattro curve. </li></ol></li><li> Allineare l&#39;asse x delle quattro curve. Scegli caratteristiche marcate (ad esempio, i picchi di inizio iniezione o arrivo) per allineare perfettamente le quattro curve lungo l&#39;asse X. Impostare l&#39;ora di inizio di analita (o buffer di controllo) a zero. </li></ol></li><li> Riferimento sottrazione <ol><li> Sottrarre la risposta di fondo sottraendo curva del ciclo 3 dalla curva del ciclo di 4 e la curva del ciclo di 5 dalla curva del ciclo 6. Utilizzare il menu l&#39;operazione di sottrazione delle curve che si possono trovare nella Y sposta. NOTA: E &#39;importante eseguire questo passaggio in cui annulla tutti i componenti non specifici (non collegati all&#39;analita) che possono aver influenzato l&#39;indice di rifrazione della superficie. <ol><li> Salvare le curve sottratti in tegli scheda di progetto con un nome diverso. </li></ol></li><li> Vedere queste curve come &quot;curve doppiamente sottratta&quot;: la prima è la sottrazione 2-1 sottrazione eseguita su entrambi iniezioni, e il secondo è la sottrazione di una curva da un altro. NOTA: Tale doppio riferimento è il gold standard negli esperimenti SPR. </li><li> Sovrapponete le curve sottratti eseguendo spostamento dell&#39;asse come spiegato prima. </li></ol></li><li> Determinazione delle cinetiche costanti e montaggio di modello <ol><li> Condurre un esperimento cinetica <ol><li> Iniettare una serie di 6-7 concentrazioni di analita avere un affidabile di dati per determinare le costanti cinetiche. Scegliere concentrazioni di analiti da 10 volte sopra a 10 volte inferiore alla stima K D, in diluizioni 2-3-fold. Includere la concentrazione &quot;zero&quot;, poi utilizzato per la doppia sottrazione di riferimento (vedi sopra). Condurre iniezioni in triplice copia e in ordine casuale. </li><li> Allinearee sottrarre tutte le curve rispetto asse Y e l&#39;asse X prima di montaggio di modello. </li></ol></li><li> Montaggio Modello <ol><li> Selezionare un programma di analisi adatto. NOTA: La maggior parte dei programmi di montaggio disponibili offrono diversi modelli che possono essere applicati per il montaggio e la determinazione delle costanti cinetiche. </li><li> Applicare il modello più semplice (Langmuir) assumendo una reversibili 1: 1 interazione tra l&#39;analita ed il legante per il montaggio. A meno convincente dati sono disponibili da altri metodi sperimentali per l&#39;esistenza di una interazione più complessa, utilizzare sempre il semplice modello Langmuir. </li></ol></li></ol></li></ol>

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All authors declare that they have no competing financial interests.

SPR è un metodo altamente sensibile per studiare le interazioni molecolari, ed è spesso l&#39;unico approccio che fornisce il monitoraggio in tempo reale di transitori (ma importanti) interazioni. Un esempio è l&#39;interazione transitoria qui presentata, che non poteva essere rilevata da un altro metodo (saggi di pull-down, saggi liposomi sedimentazione 6). Inoltre, mentre altri metodi sono limitati all&#39;equilibrio misurazioni (sia quantitativa o qualitativa), SPR è uno dei pochi tecniche che misurano...

Interazioni proteina-proteina (PPI); la formazione e la dissociazione di complessi proteici, sono eventi chiave in molti processi biologici (ad esempio, la replicazione, la trascrizione, traduzione, di segnalazione, di comunicazione cellula-cellula). Studi semi-quantitativa di PPI sono spesso eseguiti con pull-down o esperimenti di immuno-precipitazione. Tuttavia, queste tecniche (e simili) sono limitati nella gamma di affinità che può essere misurata (basso e maggiore affinità micromolare) per le fasi di lavaggio che sono inerenti a tali tecniche. Tali tecniche &quot;end-point&quot; non in grado di identificare le interazioni affinità transitori o bassi che sono spesso di grandi conseguenze biologiche. Inoltre, la risoluzione temporale di tali approcci è estremamente limitato, solitamente ordini di grandezza più lento rispetto ai tassi di reazione. SPR supera queste carenze per la sua sensibilità e risoluzione temporale superiore a 1,2. SPR è un metodo privo di etichette, e come taleinterazione molecolare può essere misurata (purché le variazioni di massa possono essere rilevati). Oltre a PPI, è stato ampiamente utilizzato per caratterizzare la proteina-ligando, proteina-farmaco (o piccola molecola), proteina-DNA, e le interazioni proteina-RNA 3-5. I risultati sono registrati e tracciati in tempo reale, che consente una rapida modifica delle condizioni sperimentali e il disegno sperimentale flessibile. Il principio fisico dietro strumenti basati SPR è l&#39;utilizzo di un sistema ottico che misura un cambiamento dell&#39;indice di rifrazione sulla superficie del sensore sulla massa cambia 2. Uno dei partner interagenti (ligando di seguito) è immobilizzato su un chip matrice polimerica e la seconda molecola (in seguito analita) è fluita sulla superficie. Analita legame al ligando altera la massa sulla superficie del chip. Questo cambiamento massa è direttamente proporzionale alla variazioni dell&#39;indice di rifrazione della superficie. I risultati sono riportati in tempo reale epresentate come unità di risposta (RU) in funzione del tempo. Tale trama è definita una Sensogramma (es, Figura 1). Poiché SPR segue il decorso completa dell&#39;interazione, pre-equilibrio costanti di velocità cinetica derivano, oltre all&#39;equilibrio affinità. Come descritto di seguito, il comportamento pre-equilibrio di un dato sistema contiene molte informazioni, e fornisce una prospettiva molto diverso equilibrio da solo. Una volta che il sistema è calibrato, esperimenti sono molto veloci e richiedono solo piccole quantità di materiale proteico (microgrammi di nanogrammi importi). Raccolta delle informazioni complete cinetica di un dato sistema può essere realizzato in giorni. L&#39;elevata sensibilità della SPR offre misurazioni che non sono possibili con qualsiasi altra tecnica 6. Tuttavia, questa elevata sensibilità è una &#39;spada a doppio taglio&#39; dal momento che può essere una fonte importante per i dati falsi positivi. Qualsiasi fattore che influenza l&#39;indice di riflessione viene registrata e tracciata sul Sensogramma. Come tale, apcontrolli propriate devono essere utilizzati per eliminare i falsi positivi, e il sostegno di strategie complementari è altamente consigliato. La figura 1 illustra la progressione di un esperimento SPR tramite un chip sensore NTA-rivestito. Il Sensogramma nel riquadro A mostra l&#39;iniezione degli ioni nichel sulla matrice NTA (dati unsubtracted), e visualizza i dati BD pannelli dopo aver sottratto il segnale derivato dalla cella controllo negativo. Frecce rosse e blu mostrano inizio dell&#39;iniezione e la fine, rispettivamente. Immobilizzazione del ligando sul chip altera gradualmente la massa fino iniezione è terminata. Il plateau stabile osservata dopo la cessazione di iniezione del ligando riflette l&#39;associazione stabile del ligando alla superficie (Figura 1B, ciclo 2). Una volta che una linea di base stabile si ottiene un buffer viene iniettato il ligando e la cella di riferimento (Figura 1B, ciclo 3) .Questo iniezione serve come &#39;controllo in bianco &quot;, e saràsottratto durante l&#39;analisi. Dopo l&#39;iniezione, cambiamenti minori sono registrati, riflettendo un flusso di massa attraverso il chip. Quindi in un ciclo separato (Figura 1B, ciclo 4), l&#39;analita viene iniettato; il graduale aumento RU rappresenta l&#39;associazione della analita al ligando. I siti di legame diventano via via occupati fino al raggiungimento dell&#39;equilibrio. Appena finisce l&#39;iniezione, un calo della RU riflette dissociazione del complesso. Da tali sensograms pre-equilibrio e di equilibrio costanti di velocità possono essere derivati ​​(vedi più avanti). La figura 1 illustra l&#39;interazione transitorio tra il legante e analita. Quando l&#39;interazione è più stabile, la diminuzione del livello di IF è più lento, riflettendo una minore k d. Qui, descriviamo un esperimento SPR per caratterizzare l&#39;interazione tra un trasportatore di membrana (detergente solubilizzato) e il suo partner funzionale suo substrato affine proteina di legame 6,7. Il mod sceltael sistema è un ATP cassette binding (ABC) trasportatore, ModBC-A di Archeaglobus fulgidus. Questo sistema è stato scelto per i suoi risultati altamente riproducibili, elevato rapporto segnale-rumore, e classica &#39;on / off&#39; i tassi. Inoltre, trasportatori omologhi ABC sono a disposizione per servire come importanti controlli negativi. Il trasportatore, ModBC (ligando A) viene estratto dalla membrana con detersivo, purificata e immobilizzato sul chip. Il suo partner di interagire solubile, ModA, è l&#39;analita. Come ligando controllo negativo, una diversa RbsBC ABC trasportatore viene utilizzato (&quot;ligando B&quot;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sensor Chip NTA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">14100532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BIAevaluation</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Biacore T200 Software&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Nickel chloride</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium tungstate dihydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T2629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Lab LTD.</td>
			<td style="width:119px;">19030591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Trizma base</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:209px;">Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:209px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:107px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Sodium dodecyl sulfate solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Kimwipes KIMTECH</td>
			<td style="width:107px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:107px;">GADOT</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon (NY) Membrane Filter</td>
			<td style="width:107px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">25007--47------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">ModBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">RbsBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">ModA Substrate Binding Protein</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Nel sistema descritto, un chip NiNTA viene usato per immobilizzare il trasportatore di membrana His-tag 6,7. Essendo un homo-dimero, ogni trasportatore è doppiamente marcato, migliorando il suo legame al chip NiNTA. A seguito di nichel carico, ligando A (il trasportatore di interesse) è immobilizzato su Fc = 2, fino a ~ 3.500 RU (ciclo di protocollo 2, figura 2A etichetta nera). Quindi, utilizzando la stessa portata e durata dell&#39;iniezione, ligando B (il ligando di controllo) viene inie...

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Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) è un metodo privo di etichetta per la rilevazione delle interazioni biomolecolari in tempo reale. Qui, un protocollo per una proteina di membrana: esperimento recettore è descritto, discutendo i pro ei contro della tecnica.

Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

22.5K Views.  The Technion-Israel Institute of Technology.  Surface Plasmon Resonance (SPR) è un metodo privo di etichetta per la rilevazione delle interazioni biomolecolari in tempo reale. Qui, un protocollo per una proteina di membrana: esperimento recettore è descritto, discutendo i pro ei contro della tecnica. 

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Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato Biomolecole

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Monitoraggio in tempo reale delle interazioni ligando-recettore mediante Bonifico Fluorescence Resonance Energy

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidità-based Screening Interaction extracellulare (AVEXIS) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche Retinol Binding

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

In tempo reale Imaging di Pianta Dynamics cellulare con superficie variabile angolo epifluorescenza Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopia elettronica a scansione (SEM) Protocolli per problematico Plant, oomicete, e campioni fungine

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...