Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1. protéine échantillon et le tampon Préparation <ol><li> Préparation de l&#39;échantillon: purifier les protéines d&#39;intérêt et se assurer que tous les agrégats sont éliminés, par injection de la protéine avant l&#39;expérience sur une colonne de filtration sur gel ou par ultracentrifugation (habituellement 10 minutes à 100 000 xg est suffisante). NOTE: Bien que souhaitables préparations de protéines, très pures ne sont pas un must. SPR a été utilisé avec succès par purifications moins-que-parfait et même avec 8,9 extrait total. </li><li> Buffer préparation: <ol><li> Préparer le tampon de l&#39;expérience (appelé &quot;tampon en cours&quot;, ou RB). Pour le protocole décrit ici, en utilisant du Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM et 0,05% (p / v) DDM (β-D-maltoside de n-dodécyle). Gardez à l&#39;esprit que le choix de la composition du tampon peut être facilement modifiée en fonction du système étudié. </li><li> Filtrer tous les tampons et les échantillons de protéines en utilisant des filtres de 0,22 um. Assurez-vous à l&#39;avance que les filtres sont protéinocompatible. En général, les plates-formes SPR récemment commercialisés contiennent un de-Gasser en ligne; si ce ne est pas le cas, de gaz les tampons avant de l&#39;utiliser. </li><li> Dialyser nuit ou diluer les échantillons contre le RB à éviter les décalages de tampons. Dialyse (ou toute autre méthode d&#39;échange de tampon) est particulièrement recommandé lors de l&#39;utilisation de produits chimiques de haute viscosité (par exemple, le saccharose, le glycérol, le DMSO). Avant de raccorder la bouteille de RB à l&#39;entrée de la pompe garder de côté 10 ml de la RB dans un tube séparé. </li></ol></li><li> Diluer le ligand mère concentrée dans RB à une concentration finale de ~ 20 pg / ml. En règle générale, pour l&#39;immobilisation stable ligand, utiliser de faibles concentrations de ligands avec plus injections à faible débit, par opposition à des concentrations élevées, haut débit et des injections plus courtes. </li><li> Diluer l&#39;analyte dans le RB à la concentration désirée. Typiquement, tester la gamme de concentrations pour un système d&#39;affinité inconnue de 10 pM à 10 nM dans des dilutions de dix fois. Toujours commenceravec les concentrations plus faibles en premier. </li></ol> 2. Sensor Chip <ol><li> sélection de puce: Utilisez un acide nitrilotriacétique (NTA) couplé à puce adaptée pour capturer des protéines avec une étiquette de oligo-histidine. </li><li> l&#39;utilisation de la puce: <ol><li> Lorsque vous utilisez une nouvelle puce, prendre la puce à partir de la gaine, rincer doucement avec de l&#39;eau bidistillée (DDW), sécher soigneusement liquides restants utilisant essuie délicates, et assurez-vous de ne pas toucher la surface de la couche d&#39;or. Placez la puce dans son fourreau dans le bon sens (l&#39;insertion est lisse lorsque la puce est correctement placé). </li><li> Lors de la réutilisation d&#39;une puce, prendre la puce stockées dans la mémoire tampon, rincer abondamment à l&#39;DDW et sécher délicatement comme indiqué ci-dessus, et la placer dans son fourreau d&#39;origine. NOTE: L&#39;accumulation de matériaux de récupération non spécifique sur la puce peut affecter sa «viabilité». Ceci peut être contrôlé en comparant les EF avant et après l&#39;immobilisation du ligand de décapage. Bien que de nombreuses mesures peuvent êtrefait en utilisant la même puce NiNTA, la question de sa longévité ne est pas une «claire» et varie considérablement entre les différentes puces. </li></ol></li><li> Chip accueil: Ouvrez la porte de la puce de capteur et placer la puce dans son fourreau. Lorsque vous utilisez une nouvelle puce, le numéro de série de la puce entrée de garder une trace d&#39;utilisation. Fermez la porte et appuyez sur «puce de quai». </li></ol> 3. Réglages de température <ol><li> Régler la température de cellule de la puce à 25 ° C (ou la température de l&#39;expérience de préférence). </li><li> Facultatif: régler le compartiment échantillons à 7 ° C pour garder les protéines stable tout au long de l&#39;expérience. </li></ol> 4. Solutions pour le chargement et à dénuder Préparer les solutions suivantes de chargement et de stripage: mM NiCl 0,5 2 dans RB mM, EDTA 350 RB (ajouter un détergent à la solution d&#39;EDTA à une concentration finale en RB), 0,25% de SDS à H 2 O et HCl 100 mM dans H 2 O. Lors de l&#39;utilisation de micro-centrifugeuse baignoirees et non SPR tubes désignés, ne oubliez pas de couper les bouchons des tubes. 5. Premier l&#39;instrument SPR avec RB 6. Commencer un nouveau Run <ol><li> Réglez le débit qui sera utilisé pendant l&#39;expérience. Pour obtenir les résultats décrits ici régler le débit à 50 pl / min. NOTE: Ce paramètre peut être modifiée au cours de l&#39;expérience. </li><li> Définir les chemins d&#39;écoulement et la soustraction de référence. Pour obtenir les résultats décrits ici définir les chemins Fc et Fc = 1 = 2, la soustraction Fc = 2-1. NOTE: Le programme affiche en temps réel la soustraction de deux cellules mesurées. Gardez à l&#39;esprit que ce paramètre ne peut être modifiée pendant l&#39;expérience. </li><li> Sélectionner le rack d&#39;échantillons approprié (qui peut influer sur la consommation de volume de l&#39;échantillon). </li><li> Enregistrez le fichier de résultats. </li></ol> 7. Expérience Cycles Chaque expérience est composé de cycles, garder une trace claire des injections faites dans eacycle de ch, et séparer loading les ligands, injection vierge de la mémoire tampon, et l&#39;injection d&#39;analyte dans différents cycles. <ol><li> Cycle 1: préparation de Chip et le nickel chargement <ol><li> Assurez-vous que le flux et les chemins sont fixés selon l&#39;étape 6.1 et 6.2. </li><li> Injecter 350 mM d&#39;EDTA pendant 1 min à lavent restes. </li><li> Régler le débit à 10 pl / min. </li><li> Injecter 0,5 mM NiCl 2 pendant 2 min. NOTE: Maintenant la résine à puce est recouverte par des ions de nickel. </li></ol></li><li> Cycle 2: l&#39;immobilisation des ligands <ol><li> Réglez le débit à 15 pl / min, chemin d&#39;écoulement Fc = 2. </li><li> Injecter ligand A jusqu&#39;à atteindre des valeurs RU qui sont de 10 à 20 fois de son poids moléculaire. Par exemple, charger un ligand de 50 kDa à 500-1000 EF. Gardez une trace de la valeur RU atteint. </li><li> Réglez le débit à 15 pl / min, chemin d&#39;écoulement Fc = 1. </li><li> Injecter ligand B (contrôle) jusqu&#39;à la même valeur que celle de RU ligand A. surveiller les sensogramme de soustraction (Fc = 2-1) en ligne pour aider à contrôler lalongueur d&#39;injection. </li><li> Réglez le débit à 50 pl / min, chemin d&#39;écoulement Fc = 1 et Fc = 2, laver le système de 5-20 min jusqu&#39;à ce que la ligne de base (Fc = 2-1) se stabilise. </li></ol></li><li> Cycle 3: injection Blank. Cette injection servira pour la soustraction vide, donc inclure tous les composants qui seront injectés avec l&#39;analyte, sauf l&#39;analyte lui-même. REMARQUE: longueur d&#39;injection peut varier en fonction du temps nécessaire pour atteindre l&#39;équilibre (signal de plateaux). <ol><li> Réglez le débit à 15 pl / min, chemin d&#39;écoulement Fc = 1 et Fc = 2, Fc = 2-1 soustraction. </li><li> Insérez la commande «wait» (appelée ci-après «wait &#39;) pendant 30 secondes (pour avoir une ligne de base stable). </li><li> Injecter 15 sec RB. REMARQUE: La durée de l&#39;injection varie entre les différents systèmes, en fonction de leurs constantes cinétiques pré-équilibre (principalement le k A). </li><li> Attendez 120-600 sec pour enregistrer la phase de dissociation. NOTE: La longueur de cette étape varie selon le <em&gt; k d: Le ralentissement de la dissociation plus long cette étape doit être. Pour les complexes dissociants très lentes (k d &lt;10 -4 s -1), attendez 10 à 15 min, puis procéder à la régénération de surface (voir plus loin). </li></ol></li><li> Cycle 4: injection Analyte <ol><li> Copiez / collez les conditions exactes utilisées dans le injection de référence (cycle 3) de sorte que ces deux injections peuvent être soustraites tard. Modifier l&#39;emplacement de la fente dans le rack par celui qui détient la solution de contrôle à celui qui détient la solution d&#39;analyte. Choisissez une concentration qui est légèrement supérieur à la K attendue D. Si aucune connaissance préalable ne est disponible, choisissez une uM comme un bon point de départ. </li></ol></li><li> Cycle 5: injection Buffer <ol><li> Répétez le cycle 3. </li></ol></li><li> Cycle 6: injection Analyte <ol><li> Répétez le cycle 4. </li></ol></li><li> Cycle 7: Chip dépouiller <ol><li> Régler le débit à 50 pl / min. &lt;/ Li&gt; <li> Injecter 350 mM d&#39;EDTA pendant 1 min. Répétez cette étape deux fois plus. Ne pas utiliser une seule injection de 3 min car cela pourrait endommager la puce. </li><li> Injecter 0,25% de SDS pendant 1 min. Répétez cette étape deux fois plus. Ne pas utiliser une seule injection de 3 min car cela pourrait endommager la puce. </li><li> Si le niveau de base ne est pas atteint, injecter HCl 100 mM pendant 1 min comme étape d&#39;extraction supplémentaire. </li><li> Insérez la commande &#39;de fin de course »qui passe en mode veille. </li></ol></li><li> stockage à puce <ol><li> Détacher la puce du capteur et de le sortir de l&#39;instrument. </li><li> Prenez le capteur hors de son fourreau, évitez de toucher la surface, rincer à DDW, et le placer dans un tube de 50 ml contenant RB. Conserver à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 8. Analyse des données en utilisant le logiciel désigné évaluation <ol><li> Effectuez les étapes suivantes pour traiter les données brutes obtenues par SPR avant calcul des paramètres cinétiques. <ol><li> Utilisation du logiciel d&#39;évaluation, ouvertle fichier de résultats, sélectionnez cycles 3-6 Fc = 2-1 (référence soustrait des données). </li><li> Axe changement: <ol><li> Afficher cycles 3-6. </li><li> Zéro, la valeur de l&#39;axe Y de la ligne de base (initial des temps d&#39;attente de 30 secondes dans chaque cycle) à l&#39;ensemble des quatre courbes. </li></ol></li><li> Aligner l&#39;axe des x de quatre courbes. Choisissez caractéristiques prononcées (par exemple, les pics de début d&#39;injection ou d&#39;arrivée) d&#39;aligner parfaitement les quatre courbes le long de l&#39;axe-X. Réglez l&#39;heure du début de l&#39;analyte (tampon ou de contrôle) à zéro. </li></ol></li><li> Référence soustraction <ol><li> Soustraire la réponse de fond en soustrayant la courbe du cycle 3 de la courbe du cycle de 4 et la courbe de cycle de 5 de la courbe du cycle de 6. Utilisez l&#39;opération de soustraction courbe qui peut être trouvé dans l&#39;axe Y se déplace menu. NOTE: Il est important d&#39;effectuer cette étape qu&#39;il annule tous les composants non spécifiques (sans rapport avec l&#39;analyte) qui ont pu influencer l&#39;indice de réfraction de surface. <ol><li> Enregistrer les courbes soustraits à til Fiche de projet sous un nom différent. </li></ol></li><li> Reportez-vous à ces courbes que &quot;courbes doublement soustraite»: la première soustraction est la soustraction 2-1 effectuée sur deux injections, et la seconde est la soustraction d&#39;une courbe d&#39;un autre. NOTE: Cette double-référencement est l&#39;étalon-or dans les expériences SPR. </li><li> Superposer les courbes soustraits en effectuant axe changement comme expliqué précédemment. </li></ol></li><li> Détermination de la cinétique constantes et ajustement du modèle <ol><li> Mener une expérience cinétique <ol><li> Injecter une série de 6-7 concentrations d&#39;analyte d&#39;avoir un système fiable de données pour la détermination constantes cinétiques. Choisissez concentrations analyte de 10 fois supérieure à 10 fois inférieure au montant estimatif K D, dans des dilutions 2-3-fold. Inclure la concentration &quot;zéro&quot;, utilisé plus tard pour le double soustraction de référence (voir ci-dessus). Mener injections en triple et dans un ordre aléatoire. </li><li> Aligneret soustraire toutes les courbes par rapport à l&#39;axe Y et l&#39;axe X avant de l&#39;ajustement du modèle. </li></ol></li><li> Ajustement du modèle <ol><li> Sélectionnez un programme d&#39;analyse approprié. REMARQUE: La plupart des programmes ajustés disponibles offrent plusieurs modèles qui peuvent être appliquées pour le montage et la détermination des constantes cinétiques. </li><li> Appliquer le modèle le plus simple (Langmuir) en supposant une réversible 1: une interaction entre l&#39;analyte et le ligand pour le montage. Sauf convaincre les données sont disponibles à partir d&#39;autres méthodes expérimentales pour l&#39;existence d&#39;une interaction plus complexe, toujours utiliser le modèle de Langmuir simple. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis.">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).</li><li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance:+a+laboratory+medicine+perspective.">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).</li><li>Kyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+MafG+interaction+with+Maf+recognition+element+arrays+by+surface+plasmon+resonance+imaging+technique.">Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique.</a> Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+studies+of+RNA&#8211;protein+interactions+using+surface+plasmon+resonance.">Kinetic studies of RNA&#8211;protein interactions using surface plasmon resonance.</a> Methods. 26, 95-104 (2002).</li><li>Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+molybdate/tungstate+ABC+transporters+that+interact+very+differently+with+their+substrate+binding+proteins.">Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li><li>Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Proteins+in+Crude+Cell+Lysate+with+Antibody+Arrays+by+a+Surface+Plasmon+Resonance+Imaging+Technique.">Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique.</a> Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).</li><li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protein+kinase+activities+of+cell+lysates+using+peptide+microarrays+based+on+surface+plasmon+resonance+imaging.">Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).</li><li>Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).</li><li>Van Der Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface plasmon resonance. Protein&#8211; ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li></ol>

All authors declare that they have no competing financial interests.

SPR est une méthode très sensible pour étudier les interactions moléculaires, et est souvent la seule approche qui permet la surveillance en temps réel des interactions transitoires (mais importantes). Un exemple est l&#39;interaction transitoire présentée ici, qui ne pouvait pas être détecté par toute autre méthode (dosages déroulants, liposomes sédimentation essais 6). De plus, tandis que d&#39;autres procédés sont limités à l&#39;équilibre des mesures (que ce soit quantitative ou qualitat...

Les interactions protéine-protéine (PPI); la formation et la dissociation des complexes de protéines, sont des événements clés dans de nombreux processus biologiques (par exemple, la replication, la transcription, la traduction, la signalisation, la communication cellule-cellule). Études semi-quantitative de PPI sont souvent effectuées à l&#39;aide déroulant ou expériences immuno-précipitation. Cependant, ces techniques (et similaires) sont limités dans la gamme des affinités qui peut être mesurée (à faible et une plus grande affinité micromolaire) en raison des étapes de lavage qui sont inhérents à ces techniques. Ces techniques &quot;point final&quot; ne peuvent pas identifier les interactions d&#39;affinité transitoires ou basses qui sont souvent de grandes conséquences biologiques. En outre, la résolution temporelle de ces approches est extrêmement limitée, généralement ordres de grandeur plus lent que les taux de la réaction. SPR surmonte ces lacunes en raison de sa sensibilité accrue et une résolution temporelle supérieure 1,2. SPR est un procédé sans étiquette, et en tant que telinteraction moléculaire peut être mesurée (à condition que les changements de masse peuvent être détectées). En plus de l&#39;IPP, il a été largement utilisée pour caractériser la protéine-ligand, protéine-médicament (ou une petite molécule), la protéine-ADN et les interactions protéine-ARN 3-5. Les résultats sont enregistrés et tracés en temps réel, ce qui permet la modification rapide des conditions expérimentales et la conception expérimentale flexible. Le principe physique derrière instruments basés SPR est l&#39;utilisation d&#39;un système optique qui mesure un changement de l&#39;indice de réfraction sur la surface du capteur change masse sur deux. L&#39;un des partenaires d&#39;interaction de ligands (ci-après) est immobilisée sur une puce à matrice de polymère et la deuxième molécule (ci-après analyte) est coulé sur la surface. Analyte liaison au ligand modifie la masse sur la surface de la puce. Ce changement de masse est directement liée et proportionnellement à l&#39;évolution de l&#39;indice de réfraction de la surface. Les résultats sont tracés en temps réel etprésenté sous forme d&#39;unités de réponse (RU) en fonction du temps. Un tel complot est appelé sensogramme (par exemple, la figure 1). Depuis SPR suit le cours du temps complet de l&#39;interaction, de pré-équilibre constantes cinétiques sont dérivés, en plus de l&#39;équilibre affinités. Comme détaillé ci-dessous, le comportement d&#39;un système donné pré-équilibre détient beaucoup d&#39;informations, et offre une perspective très différente de l&#39;équilibre seul. Une fois que le système est étalonné, des expériences sont très rapides et ne ont besoin que de petites quantités de matière protéique (microgramme à des quantités nanogramme). La collecte de l&#39;information cinétique complète d&#39;un système donné peut être réalisé en quelques jours. La grande sensibilité de SPR offre mesures qui ne sont pas possible en utilisant toute autre technique 6. Cependant, cette sensibilité élevée est une «arme à double tranchant» car il peut être une source importante pour les données faussement positifs. Tout facteur qui affecte l&#39;indice de réflexion est enregistrée et tracée sur l&#39;sensogramme. En tant que tel, apcontrôles propriées doivent être utilisés pour éliminer les faux positifs, et le soutien des approches complémentaires est fortement conseillé. La figure 1 illustre la progression d&#39;une expérience SPR utilisant une puce de capteur revêtue de NTA. Le Sensogramme dans le panneau A montre l&#39;injection des ions nickel sur la matrice NTA (données non soustraites), et des panneaux BD afficher les données après la soustraction du signal dérivé à partir de la cellule témoin négatif. Flèches rouges et bleus montrent début d&#39;injection et à la fin, respectivement. Immobilisation du ligand sur la puce modifie progressivement la masse jusqu&#39;à ce que l&#39;injection est terminée. Le plateau stable observée après la fin de l&#39;injection de ligand reflète l&#39;association stable du ligand à la surface (figure 1B, le cycle 2). Une fois une ligne de base stable soit atteint, un tampon est injecté sur le ligand et la cellule de référence (figure 1B, cycle 3) .Cet injection sert de «contrôle à blanc&quot;, et serasoustrait lors de l&#39;analyse. Lors de l&#39;injection, des changements mineurs sont enregistrés, ce qui reflète un flux de masse à travers la puce. Ensuite, dans un cycle séparé (figure 1B, le cycle 4), l&#39;analyte est injectée; l&#39;augmentation progressive de RU représente l&#39;association de l&#39;analyte au ligand. Les sites de liaison deviennent progressivement occupées jusqu&#39;à ce qu&#39;un équilibre soit atteint. Dès que se termine l&#39;injection, une diminution de EF reflète la dissociation du complexe. De tels sensograms constantes de vitesse pré-équilibre et d&#39;équilibre peuvent être dérivées (voir plus loin). La figure 1 représente une interaction transitoire entre le ligand et l&#39;analyte. Lorsque l&#39;interaction est plus stable, la baisse du niveau RU est plus lent, reflétant une plus faible k d. Nous décrivons ici une expérience SPR visant à caractériser l&#39;interaction entre un transporteur membranaire (détergent solubilisé) et son partenaire fonctionnelle, son substrat apparenté protéines 6,7 contraignant. Le mod choisiel est un système ATP binding cassette (ABC) transporteur, ModBC-A de Archeaglobus fulgidus. Ce système a été choisi pour ses résultats hautement reproductibles, haute rapport signal sur bruit, et classique &quot;on / off&quot; taux. En outre, les transporteurs ABC homologues sont disponibles pour servir de témoins négatifs importants. Le transporteur, ModBC (ligand A) est extrait de la membrane avec un détergent, purifiée et immobilisée sur la puce. Son partenaire d&#39;interaction soluble, moda, est l&#39;analyte. Comme un ligand témoin négatif, un transporteur ABC différente RbsBC est utilisé (&quot;ligand B&quot;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sensor Chip NTA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">14100532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BIAevaluation</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Biacore T200 Software&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Nickel chloride</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium tungstate dihydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T2629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Lab LTD.</td>
			<td style="width:119px;">19030591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Trizma base</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:209px;">Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:209px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:107px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Sodium dodecyl sulfate solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Kimwipes KIMTECH</td>
			<td style="width:107px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:107px;">GADOT</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon (NY) Membrane Filter</td>
			<td style="width:107px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">25007--47------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">ModBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">RbsBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">ModA Substrate Binding Protein</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Dans le système décrit ici, une puce NiNTA est utilisée pour immobiliser le transporteur membranaire marquée par His 6,7. Être un homo-dimère, chaque transporteur est doublement marqué, l&#39;amélioration de sa liaison à la puce NiNTA. Après le chargement de nickel, ligand A (le transporteur d&#39;intérêt) est immobilisé sur Fc = 2, jusqu&#39;à ~ 3500 RU (cycle de protocole 2, Figure 2A label noir). Puis, en utilisant le même débit et la durée d&#39;injection, le ligand B (le...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR at JoVE.com

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Résonance plasmonique de surface (SPR) est une méthode sans étiquette pour la détection des interactions biomoléculaires en temps réel. Ici, un protocole pour une protéine de la membrane: expérience de l&#39;interaction du récepteur est décrite, tout en discutant les avantages et les inconvénients de la technique.

Temps réel Mesures de Membrane Protein Receptor Interactions: Utilisation de résonance plasmonique de surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

real-time-measurements-membrane-proteinreceptor-interactions-using

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

22.5K vues.  The Technion-Israel Institute of Technology.  Résonance plasmonique de surface (SPR) est une méthode sans étiquette pour la détection des interactions biomoléculaires en temps réel. Ici, un protocole pour une protéine de la membrane: expérience de l'interaction du récepteur est décrite, tout en discutant les avantages et les inconvénients de la technique. 

Vidéo: Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Système automatisé pour les simples mesures de fluorescence de la molécule de surface immobilisée Biomolécules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Recherche

Biologie

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Surveillance en temps réel des interactions ligand-récepteur avec Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

L&#39;avidité d&#39;un dépistage interaction extracellulaire (AVEXIS) pour la détection évolutive de faible affinité extracellulaires interactions récepteur-ligand

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Les analyses en temps réel des Transports rétinol par le récepteur membranaire de plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imagerie en temps réel des plantes Dynamics de surface cellulaire avec angle variable épifluorescence Microscopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopie électronique à balayage (MEB) Protocoles pour Problematic plantes, Oomycètes et échantillons Fungal

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...