Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1. proteína de la muestra y la Preparación Buffer <ol><li> Preparación de la muestra: purificar las proteínas de interés y asegurarse de que se eliminan todos los agregados, mediante la inyección de la proteína antes del experimento en una columna de filtración en gel o por ultracentrifugación (por lo general 10 minutos a 100.000 xg es suficiente). NOTA: Aunque los preparados de proteínas deseables, altamente puros no son una necesidad. SPR ha sido utilizado con éxito con menos-que-perfecta purificaciones y hasta con 8,9 total del extracto. </li><li> Preparación Buffer: <ol><li> Preparar el tampón del experimento (denominado &quot;tampón&quot;, o RB). Para el protocolo descrito aquí, utilizar Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,05% (w / v) DDM (n-dodecil β-D-maltósido). Tenga en cuenta que la elección de la composición del tampón se puede modificar fácilmente de acuerdo con el sistema estudiado. </li><li> Filtra todos los tampones y muestras de proteínas utilizando 0,22 micras filtros. Asegúrese de antemano que los filtros están en proteínascompatible. En general, las plataformas SPR recientemente comercializados contienen un filtro en línea de-Gasser; Si este no es el caso, de-gas los tampones antes de su uso. </li><li> Dializar noche o diluir las muestras contra la RB para evitar desajustes de amortiguamiento. Diálisis (o cualquier otro método de intercambio de tampón) es especialmente recomendable cuando se utilizan productos químicos de alta viscosidad (por ejemplo, sacarosa, glicerol, DMSO). Antes de conectar la botella RB a la entrada de la bomba mantener a un lado 10 ml de la RB en un tubo separado. </li></ol></li><li> Diluir el ligando madre concentrada en RB a una concentración final de ~ 20 mg / ml. Como regla general, para la inmovilización del ligando estable, utilizar concentraciones de ligando bajas con inyecciones más largos a bajo flujo, en oposición a altas concentraciones, de alto flujo y las inyecciones más cortas. </li><li> Diluir el analito en el RB a la concentración deseada. Típicamente, probar la gama de concentraciones para un sistema de afinidad desconocido de 10 M a 10 nM en diluciones de diez veces. Comience siemprecon las concentraciones más bajas primero. </li></ol> 2. Sensor de Chip <ol><li> Selección Chip: Utilice un ácido nitrilotriacético (NTA) de chip acoplado adecuado para la captura de proteínas con una etiqueta oligo-histidina. </li><li> Uso Chip: <ol><li> Cuando se utiliza un nuevo chip, tomar el chip fuera de la vaina, enjuague suavemente con agua doblemente destilada (DDW), secar líquidos restantes cuidadosamente usando limpiadores delicados, y asegúrese de no tocar la superficie de la capa de oro. Coloque el chip en la vaina en la orientación correcta (la inserción es suave cuando el chip se coloca correctamente). </li><li> Cuando vuelva a utilizar un chip, sacar el chip almacenado desde la memoria intermedia, enjuague bien con DDW y seca suavemente como se ha dicho, y colocar en su vaina originales. NOTA: La acumulación de material de chatarra no específica en el chip puede afectar a su &#39;viabilidad&#39;. Esto puede ser controlado mediante la comparación de las EF antes de la inmovilización del ligando y post extracción. Aunque muchas mediciones pueden serhecho usando el mismo chip NiNTA, el tema de su longevidad no es una &#39;clara&#39; y varía mucho entre los diferentes chips. </li></ol></li><li> Docking Chip: Abra la puerta chip sensor y coloque el chip en su vaina. Cuando se utiliza un nuevo chip, el número de serie de entrada del chip para mantener registro de uso. Cierre la puerta y pulse &#39;chip de muelle &quot;. </li></ol> 3. Los ajustes de temperatura <ol><li> Ajuste la temperatura de la célula de chips a 25 ° C (o la temperatura experimento preferido). </li><li> Opcional: establecer el compartimiento de muestras a 7 ° C para mantener las proteínas estable durante todo el experimento. </li></ol> 4. Las soluciones para carga y el arrastre Preparar las siguientes soluciones para la carga y el arrastre: 0,5 mM NiCl 2 en RB, EDTA 350 mM en RB (añadir detergente a la solución de EDTA a una concentración final como en RB), 0,25% SDS en H 2 O, y HCl 100 mM en H 2 O. Cuando se utiliza bañera de micro-centrífugaes y no SPR tubos designados, no se olvide de cortar las tapas de los tubos. 5. Primer Instrumento SPR con RB 6. Iniciar un nuevo Run <ol><li> Ajuste el caudal que se utilizará durante el experimento. Para obtener los resultados descritos aquí establecer el flujo de 50 l / min. NOTA: Este parámetro se puede modificar durante el experimento. </li><li> Definir las vías de flujo y la resta de referencia. Para obtener los resultados descritos aquí establecidas las rutas de Fc = 1 y Fc = 2, Fc sustracción = 2-1. NOTA: El programa mostrará en tiempo real la sustracción de dos células de medición. Tenga en cuenta que este parámetro no puede ser alterado durante el experimento. </li><li> Seleccione la gradilla de muestras adecuado (que puede influir en el consumo de volumen de la muestra). </li><li> Guarde el archivo de resultados. </li></ol> 7. Ciclos Experiment Cada experimento se compone de ciclos, mantener un registro claro de las inyecciones realizadas en eaciclo ch, y separar la carga de los ligandos, la inyección en blanco de la memoria intermedia, y la inyección analito en diferentes ciclos. <ol><li> Ciclo 1: preparación Chip y níquel carga <ol><li> Asegúrese de que el flujo y caminos se establecen de acuerdo con el paso 6.1 y 6.2. </li><li> Inyectar EDTA 350 mM durante 1 min para lavar platos sobrantes. </li><li> Definir el flujo de 10 l / min. </li><li> Inyectar 0,5 mM NiCl2 durante 2 min. NOTA: Ahora el chip de resina se recubre por iones de níquel. </li></ol></li><li> Ciclo 2: Ligandos inmovilización <ol><li> Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 2. </li><li> Inyectar ligando A hasta alcanzar valores de RU que son 10-20 veces de su peso molecular. Por ejemplo, cargar un ligando de 50 kDa a 500-1000 EF. Mantenga un registro del valor RU logrado. </li><li> Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1. </li><li> Inyectar ligando B (control) hasta el mismo valor que el de RU ligando A. Seguimiento de la Sensograma resta (Fc = 2-1) en línea para ayudar a controlar lalongitud de la inyección. </li><li> Flujo Set a 50 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1 y Fc = 2, lavar el sistema de 5-20 minutos hasta que la línea de base (Fc = 2-1) se estabiliza. </li></ol></li><li> Ciclo 3: inyección en blanco. Esta inyección servirá para la resta en blanco, por lo tanto, incluir todos los componentes que se inyectan con el analito, excepto el propio analito. NOTA: La longitud de inyección puede variar en función del tiempo que tarda en alcanzar el equilibrio (mesetas de la señal). <ol><li> Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1 y Fc = 2, Fc = 1.2 resta. </li><li> Introduzca el comando &#39;espera&#39; (en lo sucesivo como &quot;esperar&quot;) durante 30 segundos (para tener una línea de base estable). </li><li> Inyectar 15 seg RB. NOTA: La duración de la inyección puede variar entre los diferentes sistemas, en función de sus constantes cinéticas pre-equilibrio (sobre todo el k A). </li><li> Espere 120-600 segundos para registrar la fase de disociación. NOTA: La duración de esta etapa varía de acuerdo con el <em&gt; k d: Cuanto menor sea la disociación cuanto más tiempo este paso tiene que ser. Para los complejos de disociación muy lenta (k d &lt;10 -4 s -1), espere 10 a 15 minutos y luego se procederá a la superficie de regeneración (ver más adelante). </li></ol></li><li> Ciclo 4: inyección de analitos <ol><li> Copia / pega las condiciones exactas utilizadas en la inyección de referencia (ciclo 3), por lo que estos dos inyecciones pueden ser más tarde restan. Cambio de la ubicación de la ranura en el bastidor de la que contiene la solución de control a uno que tiene la solución de analito. Elija una concentración que es ligeramente superior a la esperada K D. Si no hay ningún conocimiento previo está disponible, elija 1 mM como un buen punto de partida. </li></ol></li><li> Ciclo 5: Inyección Buffer <ol><li> Repita el ciclo de 3. </li></ol></li><li> Ciclo 6: inyección del analito <ol><li> Repita el ciclo de 4. </li></ol></li><li> Ciclo 7: Chip desnudarse <ol><li> Definir el flujo de 50 l / min. &lt;/ Li&gt; <li> Inyectar EDTA 350 mM durante 1 min. Repita este paso dos veces más. No utilice una sola inyección de 3 minutos ya que esto puede dañar el chip. </li><li> Inyectar 0,25% SDS durante 1 min. Repita este paso dos veces más. No utilice una sola inyección de 3 minutos ya que esto puede dañar el chip. </li><li> Si no se alcanza el nivel de referencia, inyectar HCl 100 mM durante 1 min como etapa de separación adicional. </li><li> Introduzca el comando &#39;run final&#39; que cambia al modo de espera. </li></ol></li><li> Almacenamiento chip <ol><li> Desacoplar el chip sensor y lo saca del instrumento. </li><li> Tome el sensor fuera de su funda, evite tocar la superficie, enjuagar con DDW, y colocar en un tubo de 50 ml que contiene RB. Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 8. Análisis de datos utilizando Designado Software de evaluación <ol><li> Realice los siguientes pasos para procesar los datos brutos obtenidos por SPR antes de derivación de los parámetros cinéticos. <ol><li> Utilizando el software de evaluación, abiertael archivo de resultados, seleccione los ciclos 3-6 Fc = 2.1 (referencia resta de datos). </li><li> Eje de cambio: <ol><li> Mostrar ciclos 3-6. </li><li> Poner a cero el valor del eje Y de la línea de base (el 30 seg tiempo de espera inicial en cada ciclo) a la de todos los cuatro curvas. </li></ol></li><li> Alinear el eje X de las cuatro curvas. Elija las acentuadas características (por ejemplo, los picos de salida de la inyección o el final) para alinear perfectamente los cuatro curvas a lo largo del eje X. Establezca la hora del comienzo de analito (o tampón de control) a cero. </li></ol></li><li> Referencia de resta <ol><li> Restar la respuesta de fondo restando la curva de ciclo 3 de la curva de ciclo de 4 y la curva de ciclo 5 de la curva de ciclo de la operación 6. Uso curva de sustracción que se puede encontrar en el eje Y se desplaza menú. NOTA: Es importante realizar este paso en que anula los componentes no específicos (relacionados con el analito) que pueden haber influido en el índice de refracción de la superficie. <ol><li> Guarde las curvas restados en tél hoja de proyecto bajo un nombre diferente. </li></ol></li><li> Consulte estas curvas como &quot;curvas&quot; doblemente restados: la primera es la sustracción 2-1 resta se realiza en ambas inyecciones, y la segunda es la resta de una curva de otro. NOTA: Tal doble referencias es el estándar de oro en los experimentos de SPR. </li><li> Superposición de las curvas sustraídas mediante la realización de cambio del eje como se ha explicado antes. </li></ol></li><li> Determinación de la cinética de las constantes y ajuste del modelo <ol><li> La realización de un experimento de cinética <ol><li> Inyectar una serie de 6-7 concentraciones de analitos tener un fiable de datos para la determinación de las constantes cinéticas. Elige concentraciones de analito a partir de 10 veces por encima de 10 veces por debajo del estimado K D, en diluciones 2-3 veces. Incluya la concentración &quot;cero&quot;, posteriormente utilizado para la sustracción de referencia de matrimonio (ver arriba). Llevar a cabo inyecciones por triplicado y en orden aleatorio. </li><li> Alineary restar todas las curvas con respecto al eje Y y el eje X antes de intentar el ajuste del modelo. </li></ol></li><li> Ajuste del modelo <ol><li> Seleccione un programa de análisis adecuado. NOTA: La mayoría de los programas de ajuste disponibles ofrecen varios modelos que se pueden aplicar para el montaje y la determinación de las constantes cinéticas. </li><li> Aplicar el modelo más simple (Langmuir) suponiendo una reversible 1: 1 la interacción entre el analito y el ligando para el montaje. A menos convincentes datos disponibles de otros métodos experimentales para la existencia de una interacción más compleja, utilice siempre el modelo de Langmuir simple. </li></ol></li></ol></li></ol>

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All authors declare that they have no competing financial interests.

SPR es un método muy sensible para estudiar las interacciones moleculares, y es a menudo el único enfoque que proporciona monitoreo en tiempo real de (pero importantes) interacciones transitorias. Un ejemplo es la interacción transitoria presentada en este documento, que no podía ser detectado por cualquier otro método (pull-down ensayos, los ensayos de liposomas de sedimentación 6). Por otra parte, mientras que otros métodos están limitados a mediciones de equilibrio (ya sea cuantitativa o cualitativ...

Interacciones proteína-proteína (PPI); la formación y disociación de complejos de proteínas, son acontecimientos clave en muchos procesos biológicos (por ejemplo, replicación, transcripción, traducción, señalización, comunicación célula-célula). Estudios semi-cuantitativos de PPI se realizan a menudo utilizando desplegable o experimentos de inmuno-precipitación. Sin embargo, estas técnicas (y similares) están limitados en la gama de afinidades que se puede medir (micromolar bajo y mayor afinidad) debido a las etapas de lavado que son inherentes a tales técnicas. Tales técnicas de &quot;punto final&quot; no pueden identificar interacciones transitorias o de baja afinidad que a menudo son de grandes consecuencias biológicas. Además, la resolución temporal de estos enfoques es extremadamente limitado, generalmente órdenes de magnitud más lento que las tarifas de la reacción. SPR superar estas críticas debido a su mayor sensibilidad y resolución temporal superior 1,2. SPR es un método libre de etiquetas, y como talinteracción molecular se puede medir (siempre y cuando los cambios de masa pueden detectarse). Además de PPI, se ha utilizado ampliamente para caracterizar la proteína-ligando, la proteína-fármaco (o una molécula pequeña), la proteína de ADN, y las interacciones proteína-ARN 3-5. Los resultados se registran y se representan en tiempo real, que permite la modificación rápida de las condiciones experimentales y diseño experimental flexible. El principio físico detrás instrumentos basados ​​en SPR es la utilización de un sistema óptico que mide un cambio del índice de refracción en la superficie del sensor a los cambios de masa 2. Uno de los socios que interactúan (ligando de aquí en adelante) está inmovilizado en un chip de matriz de polímero y la segunda molécula (analito en lo sucesivo) se hace fluir sobre la superficie. El analito se une al ligando altera la masa sobre la superficie del chip. Este cambio de masa está directamente relacionado y proporcional a los cambios en el índice de refracción de la superficie. Los resultados se representan en tiempo real ypresentarse como unidades de respuesta (RU) como una función del tiempo. Tal trama se denomina una Sensograma (por ejemplo, Figura 1). Desde SPR sigue el transcurso de tiempo completo de la interacción, pre-equilibrio constantes de velocidad cinética se derivan, además de equilibrio afinidades. Como se detalla a continuación, el comportamiento de pre-equilibrio de un sistema dado tiene mucha información, y proporciona una perspectiva muy diferente de equilibrio solo. Una vez que el sistema se calibra, los experimentos son muy rápidos y requieren sólo pequeñas cantidades de material de proteína (microgramos a nanogramos cantidades). Recogida de la información cinética completa de un sistema dado se puede lograr en día. La alta sensibilidad del SPR proporciona mediciones que no son posibles de utilizar cualquier otra técnica 6. Sin embargo, esta alta sensibilidad es un &quot;arma de doble filo&quot;, ya que puede ser una fuente importante de datos falsos positivos. Cualquier factor que afecta el índice de reflexión se registra y se representa en el Sensograma. Como tal, apcontroles apro- deben utilizarse para eliminar los falsos positivos, y el apoyo de enfoques complementarios, es muy recomendable. La Figura 1 ilustra la progresión de un experimento SPR usando un chip sensor recubierto-NTA. El Sensograma en el panel A muestra la inyección de los iones de níquel más de la matriz de NTA (datos sin sustraer), y los paneles BD mostrar los datos después de restar la señal derivada de la célula control negativo. Flechas rojas y azules muestran inicio de la inyección y final, respectivamente. La inmovilización del ligando en el chip altera gradualmente la masa hasta que se termine la inyección. La meseta estable observada después de la terminación de la inyección del ligando refleja la asociación estable del ligando a la superficie (Figura 1B, ciclo 2). Una vez que se consigue una línea de base estable un tampón se inyecta sobre el ligando y la célula de referencia (Figura 1B, el ciclo 3) .Este inyección sirve como un &quot;blanco de control&quot;, y serásustraído durante el análisis. Tras la inyección, se registran cambios menores, lo que refleja un flujo de masa a través del chip. Luego, en un ciclo separado (Figura 1B, ciclo de 4), se inyecta el analito; el aumento gradual de RU representa la asociación de analito al ligando. Los sitios de unión ocupados se vuelven gradualmente hasta que se alcanza el equilibrio. Tan pronto como termina la inyección, la disminución de las EEFF refleja la disociación del complejo. De tales sensograms pre-equilibrio de equilibrio y constantes de velocidad se pueden derivar (ver más adelante). La Figura 1 representa una interacción transitoria entre el ligando y el analito. Cuando la interacción es más estable, el descenso en el nivel de RU es más lento, lo que refleja un menor k d. Aquí se describe un experimento SPR objetivo de caracterizar la interacción entre un transportador de membrana (detergente solubiliza) y su socio funcional, su sustrato cognado proteína de unión 6,7. El mod elegidosistema el es un casete de unión a ATP (ABC) transportador, ModBC-A de Archeaglobus fulgidus. Este sistema fue seleccionada por sus resultados altamente reproducibles, alta relación señal-ruido, y clásico &#39;on / off&#39; tarifas. Además, los transportadores ABC homólogos están disponibles para servir como importantes controles negativos. El transportador, ModBC (ligando A) se extrae de la membrana utilizando detergente, purificada e inmovilizada en el chip. Su interacción socio soluble, Moda, es el analito. Como un ligando de control negativo, un RbsBC transportador ABC diferente se utiliza (&quot;ligando B&quot;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sensor Chip NTA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">14100532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BIAevaluation</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Biacore T200 Software&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Nickel chloride</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium tungstate dihydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T2629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Lab LTD.</td>
			<td style="width:119px;">19030591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Trizma base</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:209px;">Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:209px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:107px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Sodium dodecyl sulfate solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Kimwipes KIMTECH</td>
			<td style="width:107px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:107px;">GADOT</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon (NY) Membrane Filter</td>
			<td style="width:107px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">25007--47------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">ModBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">RbsBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">ModA Substrate Binding Protein</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

En el sistema descrito en el presente documento, un chip de NiNTA se utiliza para inmovilizar el transportador de membrana Su-etiquetados 6,7. Al ser un homo-dímero, cada transportador está doblemente etiquetada, mejorando su unión al chip NiNTA. Después de la carga de níquel, ligando A (el transportador de interés) se inmoviliza sobre Fc = 2, hasta ~ 3500 RU (ciclo de protocolo 2, Figura 2A etiqueta negro). Luego, utilizando el mismo flujo y la duración de la inyección, ligando B (el...

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Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Resonancia de plasmón superficial (SPR) es un método de etiqueta libre para la detección de interacciones biomoleculares en tiempo real. En esto, un protocolo para una proteína de membrana: la interacción experimento receptor se describe, mientras se discuten las ventajas y desventajas de la técnica.

Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

22.5K vistas.  The Technion-Israel Institute of Technology.  Resonancia de plasmón superficial (SPR) es un método de etiqueta libre para la detección de interacciones biomoleculares en tiempo real. En esto, un protocolo para una proteína de membrana: la interacción experimento receptor se describe, mientras se discuten las ventajas y desventajas de la técnica. 

Video: Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Sistema Automatizado de Soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada Biomoléculas

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Investigación

Biología

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidez detección basada en la interacción extracelular (AVEXIS) para la detección escalable de extracelular de baja afinidad interacciones ligando-receptor

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

En tiempo real de análisis de transporte de retinol en el receptor de la membrana de plasma Proteína Fijadora del Retinol

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Escaneado de Protocolos de Microscopía Electrónica (SEM) para la Problemática de la planta, Oomycete, y muestras de hongos

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...