Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1. A amostra de proteína e tampão de preparação de <ol><li> Preparação da amostra: purificar as proteínas de interesse e certificar-se de todos os agregados são removidos, através da injecção da proteína antes da experiência, numa coluna de filtração em gel ou por ultracentrifugação (geralmente de 10 minutos a 100.000 xg é suficiente). Nota: Embora desejáveis, preparações de proteínas altamente puras não são uma obrigação. SPR tem sido usado com sucesso com purificações menos-que-perfeito e mesmo com 8,9 total de extrato. </li><li> Tampão de preparação: <ol><li> Preparar o tampão do experimento (chamado de &quot;tampão de corrida&quot;, ou RB). Para o protocolo descrito aqui, utilizar 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl e 0,05% (w / v) DDM (n-dodecil β-D-maltósido). Tenha em atenção que a escolha da composição do tampão pode ser facilmente modificada de acordo com o sistema estudado. </li><li> Filtre todos os tampões e amostras de proteína utilizando filtros de 0,22 um. Certifique-se de antemão que os filtros estão em proteínascompatível. Em geral, as plataformas SPR recentemente comercializados contêm um de-Gasser in-line; Se este não for o caso, de-gás buffers antes da utilização. </li><li> Dialisar durante a noite ou diluir as amostras contra o RB evitar descasamentos de buffer. A diálise (ou qualquer outro método de troca de tampão) é especialmente aconselhável quando se utiliza produtos químicos de alta viscosidade (por exemplo, sacarose, glicerol, DMSO). Antes de ligar o frasco RB para a entrada da bomba 10 ml manter afastados do RB em um tubo separado. </li></ol></li><li> Dilui-se o concentrado em estoque ligando RB para uma concentração final de ~ 20 ug / ml. Como regra geral, para a imobilização do ligando estável, use baixas concentrações ligando com injeções mais longos a baixo fluxo, ao contrário de altas concentrações, alto fluxo e injeções mais curtos. </li><li> Dilui-se o analito para o RB para a concentração desejada. Normalmente, testar a gama de concentrações para um sistema de afinidade desconhecida a partir de 10 mM a 10 nM em diluições de dez vezes. Comece semprecom as concentrações mais baixas primeiros. </li></ol> 2. Sensor Chip <ol><li> Seleção Chip: Use um ácido nitrilotriacético (NTA) de chip acoplado adequada para captar as proteínas com uma tag oligo-histidina. </li><li> Uso Chip: <ol><li> Ao usar um novo chip, tomar o chip fora da bainha, lavar cuidadosamente com água bidestilada (DDW), secar cuidadosamente líquidos remanescentes usando limpadores delicados, e certifique-se de não tocar a superfície da camada de ouro. Coloque o chip na bainha na orientação correta (a inserção é suave quando o chip é colocado corretamente). </li><li> Ao reutilizar um chip, tirar o chip armazenado a partir do buffer, lavar abundantemente com DDW e seque delicadamente como dito acima, e coloque em sua bainha de origem. NOTA: O acúmulo de material de sucata não específico no chip pode afetar a sua &quot;viabilidade&quot;. Isto pode ser monitorizado através da comparação do EF antes da imobilização do ligando e pós-extracção. Embora muitas medições podem serfeito usando o mesmo chip NiNTA, a questão da sua longevidade não é uma &#39;clara&#39; e varia muito entre as diferentes fichas. </li></ol></li><li> Chip de ancoragem: Abra a porta do chip sensor e colocar o chip na bainha. Ao usar um novo chip, número de série de entrada do chip para manter registro de uso. Feche a porta e pressione &quot;chip doca &#39;. </li></ol> 3. Ajustes de Temperatura <ol><li> Definir a temperatura da célula de chip para 25 ° C (ou a temperatura preferida experimento). </li><li> Opcional: definir o compartimento de amostras de 7 ° C para manter as proteínas estáveis ​​ao longo da experiência. </li></ol> 4. Soluções para carga e decapagem Preparar as seguintes soluções de carregamento e extracção: 0,5 mM de NiCl2 em RB, EDTA 350 mM em RB (adicionar detergente para solução de EDTA a uma concentração final como em RB), SDS a 0,25% em H 2 O, e HCl 100 mM em H 2 O. Ao utilizar banheira micro-centrífugaes e não SPR tubos designados, não se esqueça de cortar as tampas dos tubos. 5. Prime do Instrumento SPR com RB 6. Iniciar um novo Run <ol><li> Definir o caudal que irá ser utilizado durante a experiência. Para obter os resultados descritos aqui definir o fluxo para 50 mL / min. NOTA: Este parâmetro pode ser modificado durante o experimento. </li><li> Definir os caminhos de fluxo e referência subtração. Para obter os resultados descritos aqui definidos os caminhos Fc = 1 e Fc = 2, subtração Fc = 2-1. Nota: O programa irá exibir em tempo real a subtração de duas células medidos. Tenha em mente que este parâmetro não pode ser alterado durante o experimento. </li><li> Selecione o suporte de amostras adequado (que pode influenciar o consumo de volume da amostra). </li><li> Salve o arquivo de resultados. </li></ol> 7. Experimento Cycles Cada experiência é composto de ciclos, manter um registro claro das injeções feitas em eAciclo de ch, e separar o carregamento dos ligantes, injeção em branco do buffer, ea injeção analito em ciclos diferentes. <ol><li> Ciclo 1: preparação Chip e níquel carregamento <ol><li> Certifique-se que o fluxo de caminhos e são definidas de acordo com a etapa 6.1 e 6.2. </li><li> Injectar EDTA 350 mM para 1 min para lavar as sobras. </li><li> Definir fluxo de 10 ul / min. </li><li> Injectar 0,5 mM de NiCl2 durante 2 min. NOTA: Agora, a resina de chip é revestido por iões de níquel. </li></ol></li><li> Ciclo 2: Ligantes imobilização <ol><li> Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo Fc = 2. </li><li> Injectar Um ligando até atingir valores UC que são 10-20 vezes do seu peso molecular. Por exemplo, carregar um ligante de 50 kDa para 500-1.000 RUs. Mantenha um registro do valor RU alcançado. </li><li> Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo Fc = 1. </li><li> Injectar ligando B (controlo) até ao mesmo valor de EF enquanto que ligando o monitor A. sensogram subtracção (Fc = 2-1) em linha para ajudar a controlar acomprimento injecção. </li><li> Conjunto de fluxo de 50 mL / min, caminho de fluxo = 1 Fc e Fc = 2, lavar o sistema para 5-20 min, até a linha de base (Fc = 2-1) estabiliza. </li></ol></li><li> Ciclo 3: injeção em branco. Esta injecção irá servir para subtracção do branco, por conseguinte, incluir todos os componentes que vão ser injectados com a substância a analisar, com excepção do próprio analito. NOTA: Injecção comprimento pode variar dependendo do tempo que demora a atingir o equilíbrio (planaltos sinal). <ol><li> Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo = 1 Fc e Fc = 2, Fc = 2-1 subtracção. </li><li> Insira o comando &#39;esperar&#39; (referido a seguir como &quot;esperar&quot;) durante 30 segundos (para ter uma linha de base estável). </li><li> Injectar 15 seg RB. NOTA: A duração da injecção variará entre sistemas diferentes, dependendo de suas pré-equilíbrio constantes cinéticas (principalmente o k a). </li><li> Espere 120-600 sec para gravar a fase de dissociação. NOTA: A duração deste passo varia de acordo com o <em&gt; k d: A mais lenta a dissociação do mais este passo precisa ser. Para os complexos dissociar muito lentas (k d &lt;10 -4 seg -1), esperar 10-15 minutos e então proceder à tona regeneração (ver adiante). </li></ol></li><li> Ciclo 4: Injeção Analyte <ol><li> Copiar / colar as condições exatas usadas na injeção de referência (ciclo 3), de modo que essas duas injeções podem ser depois subtraído. Alterar a localização do slot no rack da que contém a solução de controle para aquele que detém a solução analisar. Escolha uma concentração que é um pouco acima do K D esperado. Se nenhum conhecimento prévio está disponível, escolher um? M como um bom ponto de partida. </li></ol></li><li> Ciclo 5: injeção de tampão <ol><li> Repita ciclo 3. </li></ol></li><li> Ciclo 6: injeção Analyte <ol><li> Repita o ciclo de 4. </li></ol></li><li> Ciclo 7: Chip despir <ol><li> Definir fluxo de 50 ul / min. &lt;/ Li&gt; <li> Injectar EDTA 350 mM durante 1 min. Repita este passo mais duas vezes. Não use uma única injeção de 3 min, pois isso pode danificar o chip. </li><li> Injectar SDS a 0,25% durante 1 min. Repita este passo mais duas vezes. Não use uma única injeção de 3 min, pois isso pode danificar o chip. </li><li> Se o nível da linha de base não for atingido, injetar HCl 100 mM durante 1 min como da fase de extracção adicional. </li><li> Insira o comando &#39;run final&#39; que muda para o modo de espera. </li></ol></li><li> Armazenamento Chip <ol><li> Desencaixar o chip sensor e levá-la para fora do instrumento. </li><li> Leve o sensor fora da bainha, evite tocar a superfície, enxagúe com DDW, e coloque em um tubo de 50 ml contendo RB. Armazenar a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 8. análise de dados usando o software designado Avaliação <ol><li> Execute as seguintes etapas para processar os dados brutos obtidos por SPR antes derivação dos parâmetros cinéticos. <ol><li> Usando o software de avaliação, abertao arquivo de resultados, selecione ciclos 3-6 Fc = 2-1 (referência de dados subtraídos). </li><li> Axis mudança: <ol><li> Ciclos de Exibição 3-6. </li><li> Zero o valor do eixo Y da linha de base (o tempo de espera de 30 segundos em cada ciclo inicial) para todos os quatro curvas. </li></ol></li><li> Alinhamento do eixo X- das quatro curvas. Escolha recursos pronunciados (por exemplo, pontos de início de injeção ou acabamento) para alinhar perfeitamente os quatro curvas ao longo do eixo-X. Definir a hora de início de objecto de análise (ou tampão de controlo) a zero. </li></ol></li><li> Subtração de Referência <ol><li> Subtrair a resposta de base por subtracção da curva do ciclo 3 a partir da curva de ciclo curva 4 e 5 do ciclo a partir da curva de ciclo 6. Utilização da operação de subtracção curva que pode ser encontrado no eixo Y desloca menu. ATENÇÃO: É importante realizar esta etapa em que anula quaisquer componentes inespecíficos (não relacionados à substância) que podem ter influenciado o índice de refração superfície. <ol><li> Salve as curvas subtraídos em tele folha do projeto com um nome diferente. </li></ol></li><li> Referem-se a estas curvas como &quot;duplamente curvas subtraídos&quot;: o primeiro é a subtracção 2-1 subtracção realizada em ambas as injecções, e o segundo é a subtracção de uma curva de outro. NOTA: Essa referência dupla é o padrão ouro em experimentos SPR. </li><li> Sobrepor as curvas subtraídos realizando mudança de eixo, como explicado antes. </li></ol></li><li> Determinação de constantes cinéticas e os ajustes do modelo <ol><li> Realização de uma experiência cinética <ol><li> Injectar uma série de concentrações de analito 6-7 para ter um confiável de dados para determinação de constantes cinéticas. Escolha concentrações de analito a partir de 10 vezes superior a 10 vezes inferior à estimativa K D, em diluições 2-3-dobra. Incluir o &quot;zero&quot; a concentração, mais tarde utilizado para subtração dupla referência (ver acima). Realizar injeções em triplicata e em ordem aleatória. </li><li> Alinhare subtrair todas as curvas em relação ao eixo Y e eixo-X antes de tentar modelo de ajustamento. </li></ol></li><li> Montagem Modelo <ol><li> Selecione um programa de análise adequado. NOTA: A maioria dos programas de adaptação disponíveis oferecem vários modelos que podem ser aplicadas para a montagem e determinação das constantes cinéticas. </li><li> Aplicar o modelo mais simples (Langmuir) assumindo uma reversível 1: 1 a interação entre o analito e o ligando para o encaixe. A menos que convencer os dados estão disponíveis a partir de outros métodos experimentais para a existência de uma interação mais complexa, use sempre o modelo de Langmuir simples. </li></ol></li></ol></li></ol>

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All authors declare that they have no competing financial interests.

SPR é um método altamente sensível para estudar interações moleculares, e muitas vezes é a única abordagem que permite o monitoramento em tempo real das interações transitórios (mas importantes). Um exemplo é a interacção transiente aqui apresentada, que não poderia ser detectado por qualquer outro método (ensaios de pull-down, ensaios de lipossomas de sedimentação 6). Além disso, enquanto que outros métodos são limitados ao equilíbrio medições (seja qualitativo ou quantitativo), SPR é...

Interacções proteína-proteína (PPI); a formação e dissociação de complexos de proteínas, são eventos chave em muitos processos biológicos (por exemplo, a replicação, transcrição, tradução, sinalização, comunicação célula-célula). Estudos semi-quantitativa da PPI são muitas vezes realizados experimentos usando imuno-precipitação pull-down ou. No entanto, estas técnicas (e semelhantes) estão limitados na gama de afinidades que pode ser medida (micromolar baixa e maior afinidade), devido aos passos de lavagem que são inerentes a tais técnicas. Tais técnicas &quot;ponto final&quot; não é possível identificar interações afinidade transitórios ou baixos que muitas vezes são de grandes consequências biológicas. Além disso, a resolução temporal de tais abordagens é extremamente limitada, geralmente ordens de grandeza mais lento do que as taxas de reacção. SPR supera essas deficiências devido à sua sensibilidade e resolução temporal superior a 1,2. SPR é um método livre de marcador, e como talinteracção molecular pode ser medida (desde que as mudanças de massa pode ser detectado). Em adição a PPI, que tem sido extensamente usado para a caracterização da proteína-ligando, proteína-fármaco (ou molécula pequena), de ADN-proteína, e interacções proteína-RNA 3-5. Os resultados são registados e representados graficamente em tempo real, que permite a modificação rápida das condições experimentais e desenho experimental flexível. O princípio por trás física instrumentos baseados SPR é a utilização de um sistema óptico que mede uma alteração do índice de refracção na superfície do sensor sobre a massa muda 2. Um dos parceiros de interacção ligando (daqui em diante) é imobilizada num chip de matriz de polímero e a segunda molécula (a seguir analito) é feito fluir através da superfície. Ligação do analito ao ligando altera a massa na superfície do chip. Essa mudança de massa é direta e proporcionalmente relacionada a mudanças no índice de refração da superfície. Os resultados são representados graficamente em tempo real eapresentadas como unidades de resposta (RU) como uma função do tempo. Uma tal trama é denominado um sensogram (por exemplo, Figura 1). Desde SPR segue o curso completo do tempo de interacção, pré-equilíbrio constantes de velocidade são derivados, em adição ao equilíbrio afinidades. Tal como pormenorizado abaixo, o comportamento de pré-equilíbrio de um dado sistema mantém muita informação, e fornece uma perspectiva muito diferente do que o equilíbrio sozinho. Uma vez que o sistema é calibrado, as experiências são muito rápidos e exigem apenas pequenas quantidades de material de proteína (microgramas de quantidades de nanogramas). A recolha de informação cinética completa de um dado sistema pode ser conseguida em dia. A elevada sensibilidade da SPR proporciona medições que não são possíveis usando qualquer outra técnica de 6. No entanto, essa alta sensibilidade é uma &quot;faca de dois gumes&quot;, pois pode ser uma importante fonte de dados falsos positivos. Qualquer fator que afeta o índice de reflexão é gravado e plotados no sensogram. Como tal, apcontroles ade- deve ser usado para eliminar falsos positivos, e apoio de abordagens complementares é altamente recomendado. A Figura 1 ilustra a progressão de uma experiência de SPR utilizando um chip sensor revestido-NTA. O sensogram no painel A mostra a injecção dos iões de níquel sobre a matriz de NTA (dados unsubtracted), e painéis BD exibir os dados depois de subtrair o sinal obtido a partir da célula de controlo negativo. Setas vermelhas e azuis mostram início de injeção e final, respectivamente. A imobilização do ligando para o chip altera gradualmente até que a massa de injecção é terminada. O patamar estável observada após o término da injecção do ligando reflecte a associação estável do ligando à superfície (Figura 1B, ciclo 2). Uma vez que uma linha de base estável é conseguido um tampão é injectado sobre o ligando e a célula de referência (Figura 1B, ciclo 3) .Este injecção serve como um &quot;controlo em branco&quot;, e serásubtraída durante a análise. Após a injecção, pequenas alterações são registadas, reflectindo um fluxo de massa através do chip. Em seguida, num ciclo separado (Figura 1B, ciclo 4), o analito é injectado; o aumento gradual no RU representa associação da substância ao ligando. Os sítios de ligação tornar-se gradualmente ocupada até que o equilíbrio seja atingido. Assim que termina a injeção, um declínio nos RUs reflete dissociação do complexo. A partir de tais sensograms constantes da taxa de pré-equilíbrio e equilíbrio podem ser derivadas (ver mais adiante). A Figura 1 representa uma interacção transiente entre o ligando e o analito. Quando a interação é mais estável, a queda no nível de RU é mais lento, refletindo uma menor k d. Relata-se um experimento SPR teve como objetivo caracterizar a interação entre um transportador de membrana (detergente solubilizado) e seu parceiro funcional proteína 6,7, ligando o seu substrato cognato. O mod escolhidosistema el é um transportador de ATP cassete de ligação (ABC), ModBC-A da Archeaglobus fulgidus. Este sistema foi escolhido por seus resultados altamente reprodutíveis, alta relação sinal-ruído, e clássica &quot;on / off&quot; taxas. Além disso, os transportadores homólogos ABC estão disponíveis para servir como controlos negativos importantes. O transportador, ModBC (ligante A) é extraído a partir da membrana usando detergentes, purificada e imobilizada sobre o chip. Seu parceiro interagindo solúvel, moda, está a analisar. Como um ligando de controlo negativo, um transportador ABC RbsBC diferente é usado (&quot;ligando B&quot;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sensor Chip NTA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">14100532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BIAevaluation</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Biacore T200 Software&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Nickel chloride</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium tungstate dihydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T2629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Lab LTD.</td>
			<td style="width:119px;">19030591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Trizma base</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:209px;">Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:209px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:107px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Sodium dodecyl sulfate solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Kimwipes KIMTECH</td>
			<td style="width:107px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:107px;">GADOT</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon (NY) Membrane Filter</td>
			<td style="width:107px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">25007--47------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">ModBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">RbsBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">ModA Substrate Binding Protein</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

No sistema aqui descrito, um chip NiNTA é usado para imobilizar o transportador de membrana marcada com His 6,7. Sendo um homo-dímero, cada transportador é duplamente marcado, melhorando a sua ligação ao chip NiNTA. Após o carregamento de níquel, ligando A (o transportador de interesse) é imobilizada em Fc = 2, até ~ 3500 RU (ciclo de protocolo 2, Figura 2A tarja preta). Em seguida, utilizando o mesmo caudal e da duração da injecção, ligando B (do ligando de controlo) injecta-se ...

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Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Superfície Plasmon Resonance (SPR) é um método livre de marcador para a detecção de interacções biomoleculares em tempo real. Nisto, um protocolo para uma proteína de membrana: interação experimento receptor é descrita, ao discutir os prós e contras da técnica.

Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

22.5K visualizações.  The Technion-Israel Institute of Technology.  Superfície Plasmon Resonance (SPR) é um método livre de marcador para a detecção de interacções biomoleculares em tempo real. Nisto, um protocolo para uma proteína de membrana: interação experimento receptor é descrita, ao discutir os prós e contras da técnica. 

Vídeo: Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Biologia

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidez baseado Triagem Interação Extracelular (AVEXIS) para a detecção escalável de baixa afinidade Extracelular receptor-ligante Interações

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Em tempo real, análises de Transporte Retinol pelo receptor de membrana da proteína de Retinol Binding

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imagens em tempo real de plantas Dynamics da superfície celular com variável de ângulo epifluorescência Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...