Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1.タンパク質サンプルおよびバッファの準備<ol><li>サンプル調製：目的のタンパク質を精製し、ゲルろ過カラムにまたは超遠心分離により、実験前にタンパク質を注入することにより、すべての集計が削除されていることを確認し（100,000 XGが十分で通常10分で）。 注：望ましいが、高純度のタンパク質調製物は必須ではありません。 SPRが正常より少なくより完璧な精製であっても全抽出物の8,9で使用されてきた。 </li><li>バッファーの調製： <ol><li> （「バッファを実行している」と呼ばれる、またはRB）実験のバッファを準備します。プロトコルは、ここで説明のために、50mMのトリス塩酸pH7.5で、150mMのNaClおよび0.05％（w / v）のDDM（n-ドデシルβ-D-マルトシド）を使用する。緩衝液組成の選択が容易に研究し、システムに応じて変更することができることに留意してください。 </li><li> 0.22μmのフィルターを使用してすべてのバッファとタンパク質サンプルをフィルタリングします。フィルタは、タンパク質であることを事前に確認してください互換性。一般に、最近市販SPRプラットフォームは、インライン脱ガッサーを含む。そうでない場合には、脱ガスバッファ使用前。 </li><li>一晩透析またはバッファの不一致を回避するために、RBに対してサンプルを希釈。高粘度（ 例えば 、スクロース、グリセロール、DMSO）の化学物質を使用した場合、透析（または緩衝液交換の他の方法）が特に推奨される。ポンプ入口にRBボトルを接続する前に別のチューブに置いRBの10ミリリットルを保つ。 </li></ol></li><li> 〜を20μg/ mlの最終濃度になるようにRBに濃縮リガンドストックを希釈する。経験則として、安定したリガンド固定化のために、高濃度の、高流量と短​​い注射とは対照的に、低流量でより長い注射で低リガンド濃度を使用しています。 </li><li>所望の濃度にRBに検体を希釈する。一般的に、10倍希釈で10 nMの10μMから未知の親和性のシステムのための濃度の範囲をテストします。常に開始最初のより低い濃度で。 </li></ol> 2.センサーチップ<ol><li>チップ選択：三酢酸（NTA）、オリゴヒ​​スチジンタグを有するタンパク質を捕捉するのに適した結合されたチップを使用してください。 </li><li>チップの使用状況： <ol><li>新しいチップを使用する場合は、シースからチップを取り出して再蒸留水（DDW）で軽くすすいで、繊細なワイパーを使って慎重に残りの液体を乾燥し、金層の表面に触れないように注意してください。 （チップが適切に配置されたときに挿入がスムーズです）正しい方向に戻す鞘にチップを置きます。 </li><li>チップを再利用する場合、バッファから格納されたチップを取り出し、上記のように優しくDDWとドライで十分に洗い流し、そして、元の鞘に入れる。 注：チップ上の非特異的なジャンク材料の蓄積は、その「可能性」を影響を与えることができます。これは、リガンド固定ポストストリッピングする前のRUを比較することによってモニターすることができる。多くの測定が可能ですが同じのNiNTAチップを使用して行わ、その長寿の問題は、「明確な」ものではなく、異なるチップ間で大きく異なる。 </li></ol></li><li>チップドッキング：センサチップのドアを開いて、その鞘にチップを置く。新しいチップを使用する場合は、入力チップのシリアル番号が使用記録を維持する。ドアを押して「ドックチップ」を閉じます。 </li></ol> 3.温度設定<ol><li> 25°C（または好適な実験温度）チップ電池温度を設定する。 </li><li>オプション：実験を通して安定した蛋白質を保つために7℃までのサンプルコンパートメントを設定します。 </li></ol>ロードとストリップ4.ソリューション H 2 O中RB（RBのように最終濃度にEDTA溶液に洗剤を追加）でRBさ0.5mmのNiCl 2、350 mMのEDTA、0.25％SDS、及びHで100 mMの塩酸：ロードおよびストリッピングのために、以下のソリューションを準備2 O.マイクロ遠心機用浴槽を使用している場合ESとしない指定されたチューブをSPR、チューブのキャップを遮断することを忘れないでください。 5. RBと首相SPR計測器 6.新しいファイル名を指定して実行を開始します<ol><li>実験中に使用される流量を設定する。ここに記載された結果を得るために50μL/分への流れを設定する。 注：このパラメータは、実験中に変更することができます。 </li><li>流路及び基準減算を定義します。ここに記載された結果を得るためにFcが= 1およびFc = 2、減算のFc = 2-1のパスを設定する。 注：このプログラムは、リアルタイムで測定された2つのセルの減算が表示されます。このパラメータは実験中に変更できないことに注意してください。 </li><li>適切な検体ラックを選択し（これは試料容量の消費に影響を与えることができる）。 </li><li>結果ファイルを保存します。 </li></ol> 7.実験サイクル各実験は、EAで行わ注射の明確な記録を保持し、サイクルで構成されているCHサイクル、およびリガンド」のローディング、バッファのブランク注入、および異なるサイクルへの分析物の注入を分離する。 <ol><li>サイクル1：チップの準備とニッケルのロード<ol><li>フローとパスがステップ6.1および6.2に応じて設定されていることを確認。 </li><li>残り物を洗い流すために1分間350 mMのEDTAを注入。 </li><li> 10μL/ minに設定の流れ。 </li><li> 2分間0.5 mMののNiCl 2を注入。 注：ここでチップ樹脂ニッケルイオンによってコーティングされている。 </li></ol></li><li>サイクル2：固定化リガンド<ol><li> 15μL/分、流路のFc = 2に設定の流れ。 </li><li>その分子量の10〜20倍であるRU値に到達するまで配位子Aを注入。例えば、500〜1,000のRUに50kDaの体のリガンドをロードします。達成RU値の記録を保管してください。 </li><li> 15μlの/分、流路のFc = 1に設定流量。 </li><li>制御しやすくするためにオンライン減算センソグラム（FC = 2-1）を監視するリガンドAのと同じRU値までリガンドB（コントロール）を注入注射の長さ。 </li><li>を50μl/分で、流路のFc = 1およびFc = 2に設定されたフローは、ベースラインになるまで5〜20分間システムを洗浄（のFc = 2-1）が安定する。 </li></ol></li><li>サイクル3：ブランク注入。この注入は、分析物自体を除いて、検体と注入されるすべてのコンポーネントが含まれ、したがって、空白の減算に役立つ。 注：注入長さは、平衡（シグナルプラトー）に到達するのに要する時間に応じて変えることができる。 <ol><li> 15μlの/分、流路のFc = 1およびFc = 2は、Fc = 2-1減算に設定流量。 </li><li> 30秒間（「待つ」と以後呼ぶ）「待つ」コマンドを挿入します（安定したベースラインを持っている）。 </li><li> 15秒RBを注入。 注：注射の継続時間は、それらの前平衡反応速度定数（主にk個のA）に応じて、異なるシステム間で異なります。 </li><li>解離相を記録するために120から600秒待ってください。 注：このステップの長さは、に応じて変化する<eM&gt; K D：長い解離遅いこのステップでは、する必要がある。非常に遅い解離性複合体（K dは &lt;10 -4秒-1）の場合は、10〜15分待ってから（後述）の再生を表面に進みます。 </li></ol></li><li>サイクル4：検体注入<ol><li>コピー/基準噴射（サイクル3）で使用される正確な条件ので、これら2回の注射を後で減算することができる貼り付けます。検体溶液を保持しているものに制御ソリューションを保持して1からラック内のスロットの場所を変更します。少し期待されるK Dの上にある濃度を選択してください。事前の知識が使用できない場合は、出発点として1μMを選択する。 </li></ol></li><li>サイクル5：バッファインジェクション<ol><li>繰り返しサイクル3。 </li></ol></li><li>サイクル6：検体注入<ol><li>繰り返しサイクル4。 </li></ol></li><li>サイクル7：チップは取り除く<ol><li> 50μL/ minに設定の流れ。&lt;/ LI&gt; <li> 1分間350 mMのEDTAを注入。このステップをさらに2回繰り返します。これは、チップに損傷を与える可能性がある3分の単回注射を使用しないでください。 </li><li> 1分間の0.25％SDSを注入。このステップをさらに2回繰り返します。これは、チップに損傷を与える可能性がある3分の単回注射を使用しないでください。 </li><li>ベースラインレベルに達していない場合は、追加のストリッピング工程として1分間の100mMのHClを注入する。 </li><li>スタンバイモードに切り替わり &#39;末端の実行」コマンドを挿入します。 </li></ol></li><li>チップ収納<ol><li>センサチップのドッキングを解除すると、機器の外にそれを取る。 </li><li> DDWで洗い流し、表面に触れないように、その鞘からセンサーを取り出し、とRBを含む50 mlチューブ内の場所。 4℃で保存。 </li></ol></li></ol>指定評価版ソフトウェアを使用して、8データ分析<ol><li>動力学的パラメータの導出前にSPRによって得られた生データを処理するために、次の手順を実行します。 <ol><li>評価ソフトウェアを使用して、オープン結果ファイルを選択しサイクル3-6のFc = 2-1（参照は、データを減算）。 </li><li>軸シフト： <ol><li>表示サイクル3-6。 </li><li>ゼロすべての4つの曲線のベースライン（各サイクルの最初の30秒の待ち時間）のY軸値。 </li></ol></li><li> 4つの曲線のX軸の位置を合わせます。顕著な特徴を選択してください（ 例えば 、噴射開始または仕上げのスパイクは）完全にX軸に沿って4つの曲線を整列させる。ゼロに分析物（または対照緩衝液）の開始時刻を設定します。 </li></ol></li><li>参考減算<ol><li>サイクル4サイクル6. Y軸のシフトメニューで見つけることができカーブ減算操作の曲線からサイクル5のカーブの曲線からサイクル3の曲線を減算することによってバックグラウンド応答を引く。 注：それは、表面の屈折率に影響を与えた可能性（分析物に関係のない）非特異的要素をannulsとして、この手順を実行することが重要です。 <ol><li>トンで減算曲線を保存彼は別の名前の下に、プロジェクトのシート。 </li></ol></li><li> 「二重に差し引か曲線」として、これらの曲線を参照してください。第1の減算は両方の注射で行わ2-1引き算であり、第二は、別の1の曲線の引き算である。 注：このような二重参照は、SPR実験でのゴールドスタンダードです。 </li><li>前に説明したように軸シフトを行うことにより、減算、曲線オーバーレイ。 </li></ol></li><li>動力学定数の決定とモデルフィッティング<ol><li>速度実験を実施<ol><li>反応速度定数の決定のためのデータの信頼性を持っている6-7の検体濃度の一連の注入。 2-3倍希釈で、推定K Dの下に10倍に上記の10倍から分析物の濃度を選択してください。 （上記参照）、後に二重の基準減算に使用される「ゼロ」濃度を、含める。三重でランダムな順序で注射を実施する。 </li><li>整列するモデルフィッティングを試みる前に、Y軸、X軸に対してすべての曲線を減算する。 </li></ol></li><li>モデルフィッティング<ol><li>適切な解析プログラムを選択します。 注：ほとんどの利用可能なフィッティングのプログラムは、フィッティングと反応速度定数の決定のためにも適用することができるいくつかのモデルを提供します。 </li><li>分析対象とフィッティングのためのリガンドとの間の1相互作用：リバーシブル1を想定した最も単純なモデル（ラングミュア）を適用します。説得力のあるデータをより複雑な相互作用の存在を他の実験方法から利用可能である場合を除き、常に単純なラングミュアモデルを使用します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis.">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).</li><li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance:+a+laboratory+medicine+perspective.">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).</li><li>Kyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+MafG+interaction+with+Maf+recognition+element+arrays+by+surface+plasmon+resonance+imaging+technique.">Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique.</a> Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+studies+of+RNA&#8211;protein+interactions+using+surface+plasmon+resonance.">Kinetic studies of RNA&#8211;protein interactions using surface plasmon resonance.</a> Methods. 26, 95-104 (2002).</li><li>Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+molybdate/tungstate+ABC+transporters+that+interact+very+differently+with+their+substrate+binding+proteins.">Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li><li>Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Proteins+in+Crude+Cell+Lysate+with+Antibody+Arrays+by+a+Surface+Plasmon+Resonance+Imaging+Technique.">Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique.</a> Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).</li><li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protein+kinase+activities+of+cell+lysates+using+peptide+microarrays+based+on+surface+plasmon+resonance+imaging.">Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).</li><li>Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).</li><li>Van Der Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface plasmon resonance. Protein&#8211; ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).</li><li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation.">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li></ol>

All authors declare that they have no competing financial interests.

SPRは、分子相互作用を研究するための高感度な方法であり、多くの場合、一過性の（まだ重要な）相互作用のリアルタイム監視を提供する唯一のアプローチである。例は、他の方法（プルダウンアッセイ、リポソーム沈降アッセイ6）によって検出することができなかった、本明細書に提示過渡相互作用である。他の方法（定量的または定性的のいずれか）の測定値を平衡に制限され...

タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）タンパク質複合体の形成および解離は、多くの生物学的プロセスにおいて重要な事象（ 例えば 、複製、転写、翻訳、シグナル伝達、細胞間コミュニケーション）である。 PPIの半定量的研究は、多くの場合、プルダウンまたは免疫沈降実験を用いて行われる。しかしながら、これらの（および類似の）技術により、このような技術に固有の洗浄工程に（低マイクロモルより高い親和性）を測定することができる親和性の範囲が限られている。このような「エンドポイント」技術は、多くの場合、大きな生物学的結果のある一過性または低親和性相互作用を同定することはできない。さらに、このようなアプローチの時間分解能は、反応の速度より通常数桁遅い極めて限られている。 SPRは、その高まり感度と優れた時間分解能1,2に、これらの欠点を克服する。 SPRは、ラベルフリーの方法であり、等（質量変化を検出することができる限り、）分子相互作用を測定することができる。 PPIに加えて、広範囲のタンパク質-リガンド、タンパク質-薬物（または小分子）、タンパク質、DNA、およびタンパク質-RNA相互作用3-5を特徴付けるために使用されている。結果は、実験条件と柔軟な実験設計の迅速な変更を可能にする、リアルタイムで記録し、プロットした。 SPRベースの計測器の背後にある物理的原理は、2を変更質量にセンサ表面に屈折率の変化を測定する光学系の利用である。相互作用パートナー（以下、リガンド）の一つは、ポリマーマトリックスチップと第二の分子（以下、分析物）の表面上に流している上に固定されている。リガンドに結合する分析物は、チップ表面上の質量を変化させる。この質量変化は、直接的に比例して表面の屈折率の変化に関連している。結果をリアルタイムでプロットし、時間の関数として応答単位（RU）として提示する。このようなプロットは、センサーグラムと呼ばれる（ 例えば 、 図1）。 SPRは、相互作用の完全な時間経過をたどるので、予め平衡反応速度定数は親和性を平衡に加えて、導出される。以下に詳述されるように、与えられたシステムのプレ平衡挙動は、多くの情報を保持しており、単独の均衡よりも非常に異なる視点を提供します。システムが校正されると、実験は非常に高速であり、タンパク質材料（金額ナノグラムするマイクログラム）を少量しか必要とします。与えられたシステムの完全な運動情報を収集する日で達成することができる。 SPRの高感度は、他の技法6を使用して可能でない測定値が得られる。しかし、この高感度は、偽陽性のデータのための主要な源とすることができるので、「両刃の剣」である。反射率に影響を与える要因を記録し、センサーグラム上にプロットされている。そのような、APとしてpropriateコントロールは、偽陽性を排除するために使用されなければならない、と補完的なアプローチからの支援を強くお勧めします。 図1は NTAでコーティングされたセンサーチップを用いたSPR実験の進行を示している。パネルAのセンソグラムはNTAマトリックス（非サブトラクションデータ）上のニッケルイオンの注入を示し、パネルはBDは、陰性対照細胞由来の信号を減​​算した後にデータを表示する。赤と青の矢印は、注入の開始と終了を示す。注入が終了するまで、チップ上へのリガンドの固定化は徐々に質量を変化させる。リガンドの噴射の終了後に観察され、安定した高原は、表面へのリガンド（ 図1B、サイクル2）の安定な会合を反映している。安定なベースラインが達成されると、バッファは、リガンド上に注入し、基準セル（ 図1B、サイクル3）。この注射は、「ブランクコントロール」として機能しているであろう分析中に差し引か。注射の際、多少の変更は、チップを通して質量の流れを反映して、記録されている。その後、独立したサイクル（ 図1B、サイクル4）で、分析物を注入されます。 RUの緩やかな増加は、リガンドへの検体の関連を表します。平衡に達するまで、結合部位は、徐々に占有になる。とすぐに注入が終了すると、RUはの低下が複雑なの解離を反映している。予備平衡平衡速度定数を導出することができるようなセンサーグラムから（後述）。 図1は、リガンドとアナライトとの間の過渡的な相互作用を示している。相互作用がより安定しているとき、RUレベルの減少はより低いk dを反映遅い。 ここで、我々は、その同族基質タンパク質6,7結合膜輸送（洗剤が可溶化）とその機能的パートナーとの相互作用を特徴づけることを目的としSPR実験について説明します。選ばれたMODエル·システムは、ATP結合カセット（ABC）トランスポーター、ArcheaglobusのフルギダスのModBC-Aである。このシステムは、信号対雑音比、および古典的な「オン/オフ」速度にその再現性の高い結果が、高信号のために選択した。さらに、同族体ABCトランスポーターが重要な負の対照として役立つために利用可能である。トランスポーター、ModBC（配位子A）がチップ上に精製し、固定化され、界面活性剤を用いて膜から抽出される。その可溶性相互作用パートナー、MODAは、分析対象である。陰性対照リガンドとして、別のABCトランスポーターRbsBCは（「リガンドB」）が使用されている。

<table><tbody><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td></td></tr><tr><td>Sensor Chip NTA&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>14100532</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 Software&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nickel chloride</td><td>Sigma</td><td>N6136</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tungstate dihydrate</td><td>Sigma</td><td>T2629</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride&amp;nbsp;</td><td>Bio-Lab LTD.</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-D-Maltopyranoside (DDM)</td><td>Affymetrix</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes KIMTECH</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>GADOT</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Nylon (NY) Membrane Filter</td><td>Sartorius</td><td>25007--47------N</td><td></td></tr><tr><td>ModBC ABC transporter</td><td>Lewinson lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RbsBC ABC transporter</td><td>Lewinson lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ModA Substrate Binding Protein</td><td>Lewinson lab</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

本明細書に記載のシステムにおいて、のNiNTAチップは、Hisタグ、膜輸送体6,7を固定するために使用される。ホモ二量体であること、各トランスポーターは、二重のはのNiNTAチップへの結合を改善し、タグ付けされている。ニッケルロード以下、リガンドA（関心のトランスポーター）〜3500 RU（プロトコルサイクル2、 図2A黒ラベル）までは、Fc = 2上に固定されている。その?...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR at JoVE.com

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

表面プラズモン共鳴（SPR）は、リアルタイムでの生体分子相互作用を検出するためのラベルフリー法である。ここで、膜タンパク質のためのプロトコル：技術の長所と短所を議論しながら、受容体相互作用の実験は、記載されている。

膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

real-time-measurements-membrane-proteinreceptor-interactions-using

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

22.6K ビュー.  The Technion-Israel Institute of Technology. 表面プラズモン共鳴（SPR）は、リアルタイムでの生体分子相互作用を検出するためのラベルフリー法である。ここで、膜タンパク質のためのプロトコル：技術の長所と短所を議論しながら、受容体相互作用の実験は、記載されている。 

ビデオ: Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA is a novel transcription activator found specifically in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia. Protein pulldown assays using affinity beads have revealed that GrgA binds two &#963; factors, namely &#963;66 and &#963;28, which recognize different sets of promoters for genes whose products are differentially required at developmental stages. We have used BLI to confirm and further characterize the interactions. BLI demonstrates several advantages over pulldown: 1) It reveals real-time association and dissociation between binding partners, 2) It generates quantitative kinetic parameters, and 3) It can detect bindings that pulldown assays often fail to detect. These characteristics have enabled us to deduce the physiological roles of GrgA in gene expression regulation in Chlamydia, and possible detailed interaction mechanisms. We envision that this relatively affordable technology can be extremely useful for studying transcription and other biological processes.

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interactions of transcription factors (TFs) with the RNA polymerase are usually studied using pulldown assays. We apply a Biolayer Interferometry (BLI) technology to characterize the interaction of GrgA with the chlamydial RNA polymerase. Compared to pulldown assays, BLI detects real-time association and dissociation, offers higher sensitivity, and is highly quantitative.

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

生化学

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

生物工学

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

単一細胞分泌物の時空間イメージング用ラベルフリー技術

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

蛍光共鳴エネルギー移動によるリガンド - 受容体相互作用のリアルタイム監視

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

生物学

Real-Time Detection of Dynamic Affinity between Biomolecules Using Surface Plasmon Resonance (SPR) Technology

Surface plasmon resonance (SPR) technology is a sensitive precise method for detecting viruses, pathogenic molecular proteins, and receptors, determining blood types, and detecting food adulteration, among other biomolecular detections. This technology allows for the rapid identification of potential binding between biomolecules, facilitating fast and user-friendly, non-invasive screening of various indicators without the need for labeling. Additionally, SPR technology facilitates real-time detection for high-throughput drug screening. In this program, the application field and basic principles of SPR technology are briefly introduced. The operation process is outlined in detail, starting with instrument calibration and basic system operation, followed by ligand capture and multi-cycle analysis of the analyte. The real-time curve and experimental results of binding quercetin and calycosin to KCNJ2 protein were elaborated upon. Overall, SPR technology provides a highly specific, simple, sensitive, and rapid method for drug screening, real-time detection of related pharmacokinetics, virus detection, and environmental and food safety identification.

Real-Time Detection of Dynamic Affinity between Biomolecules Using Surface Plasmon Resonance SPR Technology

The present study aims to elucidate the principle and methodology of surface plasmon resonance (SPR) technology, which finds versatile applications across multiple domains. This article describes SPR technology, its operational simplicity, and its remarkable efficacy, with the goal of fostering broader awareness and adoption of this technology among readers.

Surface plasmon resonance (SPR) technology is a sensitive precise method for detecting viruses, pathogenic molecular proteins, and receptors, determining ...

医学

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter and are used as a means of intercellular communication. They are emerging as promising diagnostic and therapeutic tools for a variety of diseases. There are two main biogenesis processes used by cells to produce EVs with differences in size, composition, and content. Due to their high complexity in size, composition, and cell origin, their characterization requires a combination of analytical techniques. This project involves the development of a new generation of multiparametric analytical platforms with increased throughput for the characterization of subpopulations of EVs. To achieve this goal, the work starts from the nanobioanalytical platform (NBA) established by the group, which allows an original investigation of EVs based on a combination of multiplexed biosensing methods with metrological and morphomechanical analyses by atomic force microscopy (AFM) of vesicular targets trapped on a microarray biochip. The objective was to complete this EV investigation with a phenotypic and molecular analysis by Raman spectroscopy. These developments enable the proposal of a multimodal and easy-to-use analytical solution for the discrimination of EV subsets in biological fluids with clinical potential

This paper proposes a new generation of multiparametric analytical platforms with increased throughput for the characterization of extracellular vesicle subsets. The method is based on a combination of multiplexed biosensing methods with metrological and morphomechanical analyses by atomic force microscopy, coupled with Raman spectroscopy, to qualify vesicular targets trapped on a microarray biochip.

細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Surface Plasmon Resonance (SPR)

Surface plasmon resonance (SPR) is the underlying optical phenomenon behind label-free biosensors to evaluate the molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration of biomolecules. In SPR, biomolecular interactions occur on a biosensor made of a thin layer of metal on a prism. Real-time interactions of biomolecules can be monitored by measuring the changes of light reflected off the underside of the metal.
This video describes the basic concepts of SPR and how it is used to analyze and visualize biomolecular interactions. This is followed by a sample preparation and experimental protocol for investigating binding rates using SPR. In the applications section, SPR imaging, localized SPR, and quantum dot enhanced SPR are explored.
<div class="chapter_text" id="script_0">
Surface plasmon resonance, or SPR, is the underlying phenomenon behind certain label-free biosensors for evaluating binding and adsorption interactions of biomolecules. Binding assays that require labeling, such as ELISA, can be a time-consuming process, and may alter the functionality of the analyte. In SPR, biomolecular interactions occur on a special sensor made of a thin layer of metal on one face of a prism. By monitoring the changes in light reflected off of the underside of the metal, SPR instruments visualize these interactions in real-time without the use of labels. This video will introduce the principles of SPR, a general procedure for SPR imaging, and some applications of in biochemistry.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
An SPR sensor is usually made of a thin layer of a noble metal atop the face of a prism. To take readings from the sensor, light is reflected off of the prism-metal interface into a photodetector. The reflected light will have a high intensity except at a certain angle, related to the electronic properties of the metal surface, known as the &#34;surface plasmon resonance angle&#34;.
As molecules bind to the surface, the electronic properties of the metal change, which in turn adjusts the angle. As new proteins attach, forming complexes, the angle will shift further. By measuring relative changes in the SPR angle, interactions like these can be monitored in real-time.
Another technique called localized, or &#34;L&#34;SPR, uses metal nanoparticles as the sensor surface. The properties that affect the SPR angle are highly localized to each nanoparticle, which improves sensitivity and signal resolution.
When investigating binding interactions with standard SPR, the sensor is generally mounted in a platform that becomes the floor of a flow cell in the instrument. The biomolecules of interest are carried through the flow cell by buffer solution. The sensor surface is often first coated with a substrate that has a high affinity for the metal. This ensures that a significant amount of ligand, which in turn binds to the analyte of interest, will be immobilized onto the sensor and reduces the likelihood that the ligand will dissociate during the procedure.
Once the ligand is immobilized on the sensor, the analyte is flowed over the sensor in buffer. By monitoring the change in the SPR angle over time as the analyte binds to the ligand, the binding rate and other kinetic information can be calculated.
The reflectance data can also be used for SPR imaging, or SPRi, by directing the reflected light to a CCD detector. This produces a high-contrast, high-resolution image of the entire sensor surface. Using SPR and the related techniques, questions can be answered about molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration.
Now that you understand what is being measured in an SPR experiment, let&#39;s look at a procedure for investigating binding rates.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
Before beginning the procedure, the running and sample buffers must be prepared. The running buffer is used to deposit the ligand onto the sensor, and the sample buffer is used to deposit the analyte. The sensor chip is carefully cleaned and loaded into a sheath. Then, the device is placed into the instrument, where it becomes the bottom of the flow cell. The instrument software is set up for the experiment and subsequent analysis. If necessary, the sensor surface is primed with a substrate to capture the ligand. The ligand is flowed over the sensor surface in the running buffer, where it is captured by the substrate on the sensor surface.
Then, the analyte in the sample buffer is run through the flow cell, where it selectively binds to the immobilized ligand. The change in reflectance is plotted and compared against controls to determine rate constants and other reaction kinetics data for the investigated reaction.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
Now that you understand how an SPR experiment is performed, let&#39;s look at a few other applications of SPR in biochemistry.
Here, SPR imaging was used to evaluate proteins with an array of eleven receptors on a sensor. 3D graphs of reflectivity versus time and receptor concentration were prepared from the reflectivity data for each protein. These &#34;profiles&#34; are characteristic to each protein, and thus could subsequently be used for protein identification.
In this experiment, cell secretions were studied using a custom-made LSPR sensor. The sensor was also compatible with SPRi and fluorescence microscopy. Upon depositing the cell on the sensor, the interaction of cell secretions with the nanoparticle array could be measured with high spatial resolution.
Here, the use of quantum dots, nanoscale semiconductors, as an SPR signal enhancement agent mixed with the analyte was investigated. This enhanced &#34;nano-SPRi&#34; method was compared to assays by standard SPRi and the ELISA method. The nano-SPRi method significantly improved the sensitivity and limit of detection while still being less time-consuming than the ELISA method.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on surface plasmon resonance. This phenomenon is used to monitor and image biomolecular interactions without the use of labels. This video introduced the principles of SPR, a typical protocol for performing an SPR experiment, and a few applications of SPR in biochemistry.
Thanks for watching!
</div>

Surface Plasmon Resonance SPR: Label-Free Detection

表面プラズモン共鳴 (SPR)

Surface plasmon resonance (SPR) is the underlying optical phenomenon behind label-free biosensors to evaluate the molecular affinity, kinetics, ...

Education

JoVE Science Education

化学

Surface Plasmon Resonance to Study Biomolecular Interactions Using a Sensor Chip

Source: Maier, I. <a href="https://app.jove.com/v/63541">Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video describes the surface plasmon resonance, or SPR, technique for studying the interaction between two molecules using a sensor chip. The change in resonance angle and the intensity of the reflected light are detected as a function of the association and dissociation of two molecules, and this provides information about the interactions between the two molecules.

表面プラズモン共鳴によるセンサーチップを用いた生体分子間相互作用の研究

Source: Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (2022)
This video describes the surface plasmon resonance, or ...