שורות תאי ערמונית ניתנות באדיבות על ידי ד&quot;ר לינג-יו וואנג וינג אי-ד&quot;ר Jien קונג במרכז לחקר הסרטן, UC Davis. פרויקט זה נתמך על ידי מענק galvanotaxis NIH 4R33AI080604.

1. תאי culturing ערמונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות pRNS-1-1 וערמונית PNT2 תאים על 100 מנות תרבות מ&quot;מ במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקת antimycotic על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. רענן מדיום התרבות בכל יום עד שהתאים מגיעים 80% confluency לניסויי galvanotaxis. </li></ol> 2. צ&#39;יימברס Galvanotaxis הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבת תאים תחתון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב קאמרי galvanotaxis פלסטיק עם 2-propanol. החל אוטם סיליקון הכיתה הימי סביב הפתחים עגולים בצד התחתון של קאמרי עם מזרק ולצרף coverglass גדול (איור 1). השתמש בצד האחורי של המוליך כותנה לדחוף את coverglass ולנגב את הדבק העודף עם צמר גפן. הפתחים עגולים יאפשר בינוני והזרם חשמלי לזרום על התאים הממוקמים בין שני המאגרים בינוניים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך coverglass קטן כדי להפוך את 6 מ&quot;מ x 25 מפרידי מ&quot;מ עם סמן נקודת יהלומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את התא. החל 2 פסים של דבק סיליקון עם מזרק ו / או מרית מתכת, כדי ליצור משטח ערוץ x 25 מ&quot;מ 10 מ&quot;מ לקובץ מצורף תא בין 2 הפתחים עגולים על הזכוכית התחתונה. דבק 2 חתיכות של spacer זכוכית בין 2 הפתחים עגולים. השתמש בצד האחורי של החלת מהכותנה לדחוף את מפרידי ולנגב את הדבק העודף עם צמר גפן ו / או קיסמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את התא למשך 24 שעות עד שדבק סיליקון הוא נרפא. משרים את התא בלילה מים מזוקק כדי להסיר את שאריות חומצה אצטית מהדבק. ייבש את התא לשימוש מיידי, או לאחסן את התא לשימוש מאוחר יותר במכל נקי. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1: עצרת של תא galvanotaxis התחתון. ) Coverglass גדול מחובר לחלק התחתון של חדר נקי. B) Tוו חתיכות של מפרידי זכוכית מודבקות בין 2 הפתחים עגולים כדי ליצור x 25 מ&quot;מ ערוץ 10 מ&quot;מ לתאים לצרף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריעת תאים בתאי galvanotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מספרם של התאים דורשים galvanotaxis הדרושים לניסוי. שורת תאים כל טיפול או דורשת קאמרית galvanotaxis יחיד. נגב את תאי galvanotaxis עם 2-propanol. לשטוף את התאים עם PBS 3 פעמים סטריליים ולבדוק את זרימת הנוזל בין 2 הפתחים עגולים בתאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקף את התאים בצלחות תרבית תאים סטריליים ולאפשר להם לאזן על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לנתק את תאי ערמונית ממנת התרבות שלהם באמצעות 5 מיליליטר 0.25% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין-EDTA עם FBS 5 מיליליטר של 10% בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי 15 מיליליטר צינורות וצנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 200 XG, 37 ° C. לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים ב 1 מיליליטר של מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 20 μl של פתרון תא לטעון לחדר ספירה ולחשב את מספר התא. התאם את ריכוז התא עד 8 ​​x 10 4 תאים / מיליליטר עם מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את תאי galvanotaxis מתוך 37 ° C החממה. זרעי 350 μl של ההשעיה התא אל תא אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בתאי הלילה בצלחת התרבות עם Kimwipe הרטוב או בתא לחות בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol></li></ol><img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2:. מתזמן את התאים לתא התא התחתון הוא מיובש וניקה תאי ערמונית) הם trypsinized, נספרו ומועברים לתא וטופחו לילה B) coverglass עליון מחובר ללאטום את החדר לפני צילומים... <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">ssembling תאים העליונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התא העליון לפני צילומים. מיקרוסקופ יכול להכיל רק הדמיה קאמרית galvanotaxis אחת בכל פעם. להתחמם 10 מיליליטר של מדיום התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך כל תא galvanotaxis. העבר את תא galvanotaxis מהחממות לצלחת התחממות 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים עם מדיום התרבות להסיר את התאים הפנויים. השאר 400 μl של מדיום בתא. השתמש במזרק ללמרוח משחה ואקום גבוהה על גבי שני מפרידי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף coverglass קטן לאטום את החדר. לחץ בעדינות במורד coverglass עם הצד האחורי של המוליך כותנה. נגב את המדיום העודף עם צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את משטח הזכוכית ולמרוח משחה ואקום גבוהה כדי לאטום את הפער בין coverglass והקאמרי. השתמש במרית מתכת כדי להפיץ את השומן. הוסף 4 מיליליטר של מדיום התרבות למאגרים הפנימיים ולבדוק את זרימת הנוזל בין המאגרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך אגרגשרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך זוג צינורות PVC הארוך 2 אינץ &#39;(503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 כותל), להפוך ולהכניס אותם לתוך כוס מיליליטר 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד 200 מ&quot;ג Bacto-אגר ולהוסיף אותו בבקבוק 50 מיליליטר עם מדיום תרבות 10 מיליליטר כדי להפוך 2% ג&#39;ל אגר. מיקרוגל למשך 30 שניות. טען את הג&#39;ל אגר לצינורות פלסטיק עם pipet העברה. השאר את אגר גשרים בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות כדי לחזק את אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני תרבות 2 מיליליטר למאגרים החיצוניים של תא galvanotaxis. הכנס את אגר גשרים למאגרים בינוניים הפנימיים וחיצוניים לנהל הנוכחי. </li></ol></li></ol><img alt="איור 3" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" /> איור 3:. צילומי התאים בתא תרשים כדי להדגים את ההרכבה הסופית של חדר galvanotaxis. התא אטום לחלוטין עם גריז ואקום גבוה. בינוני מתווסף to למלא את המאגרים, ושני גשרים אגר מוכנסים לתוך התא. אז קאמרי galvanotaxis מועבר לבמה מיקרוסקופ ואלקטרודות מחוברות ליישם השדה החשמלי. צדתי להציג של חדר galvanotaxis התאסף מוצג על מנת להוכיח כי הזרם החשמלי זורם על התאים באמצעות הגשרים אגר והרווח בין הזכוכית המכסה. הדמיה 3. זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התא הסביבתי על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 בשעת האוויר במחזור 2 לפני ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על המיקרוסקופ וליזום את תוכנת רכישת התמונה. כייל את הבמה מיקרוסקופ ובחר את מטרת 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תאי galvanotaxis לבמה מיקרוסקופ, לאבטח את החדר עם קלטת ולהתמקד בתאים. הכנס את האלקטרודות galvanotaxis למאגרים החיצוניים עם קתודה בצד ימין. לאבטח את החוט ואלקטרודות עם קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את bo הכחx ליישם שדה חשמלי לתא. מדוד את מתח הפלט עם מד המתח על פני התא להגיע 2.5 וולט לתא 25 מ&quot;מ הארוך (100 mV / מ&quot;מ). לשמור על עוצמת השדה במהלך הניסוי על ידי התאמת התפוקה הנוכחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 10 נקודות על פני התא לצלם בתוכנה כדי ליצור עשרה זמן לשגות סרטים. להגדיר את תנאי רכישה במרווחים של 10 דקות לשעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל צילומים ולהתאים את התפוקה הנוכחית במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הניסוי, להסיר את התא מהבמה ולתקן את התאים עם אלכוהול 95%. לפרוץ את החדר עם סכין גילוח לנקות מחדש להשתמש בו. </li></ol> 4. כימות Galvanotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הזמן לשגות הסרטים ורי-אוריינט הקתודה לחלק העליון של התמונות. לייצא את הסרטים לתוכנת המעקב הסלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני לעקוב (x, y) העמדה של 10-20 תאים בכל נקודת זמן מכל סרט (4 איור, B).מרחקי ההגירה והזוויות ביחס לכיוון צפון-דרום, באותו הכיוון של השדה החשמלי, יחושבו בתוכנת מעקב תא (איור 4C). הערה: מהירות ההגירה הממוצעת מומרת ממרחק ההגירה הכולל וכולל זמן צילומים. כיווניות מומרת מהזוויות לערך קוסינוס. אם תאים לנדוד עם יווניות אקראיות, הממוצע של קוסינוס נטו יהיה קרוב לאפס. אם התאים להעביר ישירות לכיוון הקתודה, ערך קוסינוס יהיה +1. אם התאים להעביר ישירות לכיוון האנודה, ערך קוסינוס יהיה -1. </li></ol><img alt="איור 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" /> איור 4: מעקב סלולארי למדוד יווניות) כיסוי של קווי מעקב עם תמונות תא.. העמדות (x, y) של התאים manuaמעקב lly בזמן לשגות הסרטים. . אם התאים לנדוד באופן אקראי, קוסינוס הממוצע הוא קרוב לאפס B) עם זאת, אם התאים נודדים לעבר הקתודה או האנודה, הערך של קוסינוס הממוצע הוא קרוב ל+ (קתודה) או -. (האנודה) 1.0 C ) כיווניות מוצגות על ידי ערך קוסינוס, אשר מומר מזוויות ההגירה (θ). קוסינוס (θ) שווה את היחס של המרחק (מרחק הגירה) לb מרחק (המרחק המוקרן לכיוון השדה החשמלי). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את המדידות. לייבא את הנתונים ליישום מסד נתונים כדי לחשב את התוצאות המשולבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים בשילוב של מהירות הגירה ממוצעת וערך קוסינוס הממוצע לגיליון אלקטרוני כדי לתכנן את הגרפים בר (איור 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe.">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).</li><li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+electric+currents+might+guide+rostral+migration+of+neuroblasts.">Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts.</a> EMBO Rep. 14 (2), 184-190 (2013).</li><li>Hotary, K. B., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+electrical+currents+and+voltage+gradients+in+Xenopus+embryos+and+the+consequences+of+their+disruption.">Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption.</a> Dev Biol. 166 (2), 789-800 (1994).</li><li>Hotary, K. B., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+role+for+endogenous+electrical+fields+in+chick+embryo+development.">Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development.</a> Development. 114 (4), 985-996 (1992).</li><li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+axon+guidance+in+embryonic+retina:+galvanotropism+revisited.">Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited.</a> Biochem Biophys Res Commun. 431 (2), 280-283 (2013).</li><li>Wood, M. D., Willits, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applied+electric+field+enhances+DRG+neurite+growth:+influence+of+stimulation+media,+surface+coating+and+growth+supplements.">Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements.</a> J Neural Eng. 6 (4), 046003 (2009).</li><li>Kucerova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+electrical+signals+in+murine+corneal+wound+re-epithelialization.">The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization.</a> J Cell Physiol. 226 (6), 1544-1553 (2011).</li><li>Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Dermal+fibroblasts+do+not+exhibit+directional+migration+on+collagen+I+in+direct-current+electric+fields+of+physiological+strength.">Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength.</a> Exp Dermatol. 12 (4), 396-402 (2003).</li><li>Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis+of+cellular+membrane+components+creates+the+directional+cue+guiding+keratocyte+galvanotaxis.">Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis.</a> Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).</li><li>Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+migrate+to+the+negative+pole+in+direct+current+electric+fields+comparable+to+those+measured+in+mammalian+wounds.">Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds.</a> J Cell Sci. 109 (1), 199-207 (1996).</li><li>Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+electric+fields+induce+rapid+directional+migration+in+cultured+human+corneal+epithelial+cells.">DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells.</a> Exp Eye Res. 70 (5), 667-673 (2000).</li><li>Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields.">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J Cell Sci. 112 (12), 1967-1978 (1999).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+T+lymphocytes+migrate+toward+the+cathode+of+DC+electric+fields+in+microfluidic+devices.">Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices.</a> Lab Chip. 11 (7), 1298-1304 (2011).</li><li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors.">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).</li><li>Wu, D., Ma, X., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+Electric+Fields+Direct+Breast+Cancer+Cell+Migration,+Induce+EGFR+Polarization,+and+Increase+the+Intracellular+Level+of+Calcium+Ions.+.">DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. .</a> Cell Biochem Biophys. 67 (3), 1115-1125 (2013).</li><li>Martin-Granados, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+PP1/NIPP1+in+steering+migration+of+human+cancer+cells.">A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), 40769 (2012).</li><li>Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+sodium+channel+mediates+the+directionality+of+galvanotaxis+in+human+keratinocytes.">The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes.</a> J Cell Sci. 126 (9), 1942-1951 (2013).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN.">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).</li><li>Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influx+of+extracellular+Ca2++is+necessary+for+electrotaxis+in+Dictyostelium.">Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium.</a> J Cell Sci. 119 (22), 4741-4748 (2006).</li><li>Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+corneal+epithelial+sheets+in+physiological+electric+fields.">Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (13), 2548-2558 (1996).</li><li>Peng, H. B., Jaffe, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+of+fucoid+eggs+by+steady+electrical+fields.">Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields.</a> Dev Biol. 53 (2), 277-284 (1976).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+adult+human+prostatic+epithelial-cells+immortalized+by+polybrene-induced+DNA+transfection+with+a+plasmid+containing+an+origin-defective+sv40-genome.">Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome.</a> Int J Oncol. 4 (4), 821-830 (1994).</li><li>Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+sv40+in+normal+human+prostatic+epithelial+and+fibroblastic+cells+-+differentiation+pattern+of+non-tumorigenic+cell-lines.">Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines.</a> Int J Oncol. 6 (2), 333-343 (1995).</li><li>Aurich-Costa, J., Vannier, A., Gr&#233;goire, E., Nowak, F., Cherif, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPM-FISH,+a+new+M-FISH+approach+using+IRS-PCR+painting+probes:+application+to+the+analysis+of+seven+human+prostate+cell+lines.">IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines.</a> Genes Chromosomes Cancer. 30 (2), 143-160 (2001).</li><li>Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+requirements+of+prostatic+epithelial+cell+lines+for+acinar+morphogenesis+and+lumen+formation+in+vitro:+role+of+extracellular+calcium.">Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium.</a> Prostate. 67 (15), 1601-1613 (2007).</li><li>Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+epithelial+cell+lines+form+spheroids+with+evidence+of+glandular+differentiation+in+three-dimensional+Matrigel+cultures.">Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures.</a> Br J Cancer. 85 (4), 590-599 (2001).</li><li>Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+galvanotaxis+assay+for+analysis+of+neural+precursor+cell+migration+kinetics+in+an+externally+applied+direct+current+electric+field.">A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field.</a> J Vis Exp. (68), (2012).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-controlled+directed+migration+of+neural+progenitor+cells+in+2D+and+3D+environments.">Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>Pullar, C. E., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+mediates+keratinocyte+directional+migration+in+an+electric+field.">Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field.</a> J Cell Sci. 118 (9), 2023-2034 (2005).</li><li>Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imposition+of+a+physiologic+DC+electric+field+alters+the+migratory+response+of+human+keratinocytes+on+extracellular+matrix+molecules.">Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules.</a> J Invest Dermatol. 106 (4), 642-646 (1996).</li><li>Feng, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+migration+of+neural+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+by+an+electric+field.">Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field.</a> Stem Cells. 30 (2), 349-355 (2012).</li><li>Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle+array+for+measuring+wound+generated+electric+fields.">Microneedle array for measuring wound generated electric fields.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).</li><li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing.">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הניתוח של תגובת galvanotaxis של תא היה חיווי פונקציונלי חשוב עבור רבים נודדים או צמיחה סלולריות מעבד 27, 28. כאן אנו משתמשים קאמריים מחוייט עם משטח זכוכית לצלם את שתי שורות תאי ערמונית. שורות תאים אלה הפגינו דרגות שונות של galvanotaxis, ואנחנו משערים כי הלוקליזציה תאית או ההפ?...

שדות חשמליים אנדוגני מתגלים ברקמות שונות, כגון עור 1, 32, 33 ומוח 2. השדה החשמלי הפיזיולוגי משרת פונקציות ביולוגיות ספציפיות, כוללים פיתוח בימוי עובר 3, 4, המנחה את תולדה של תהליכים עצביים 5, 6 וקידום סגירת אפיתל קרני ופצע 1, 7. במבחנה, יישום של שדה חשמלי נוכחי ישיר לתאים בתרבית מחקה את השדה החשמלי הפיזיולוגי וגורם הגירה כיוונית תא, או galvanotaxis. Galvanotaxis נחקר בfibroblasts 8, קרטינוציטים דגים 9, אפיתל אדם וקרטינוציטים קרנית 10-12, לימפוציטים מסוג 13, neuroblasts 2, ובתאים עצביים 14. כאשר נחשפו לשדה המופעל, רוב התאים למדו להעביר directionally כלפי cathodal (-) הקוטב. ובכל זאת, כמה תאי סרטן, כוללים מאוד גרורתיתאי סרטן השד אנושיים ושורת תאי סרטן הערמונית האנושית PC-3M, לעבור לanodal (+) קוטב 15, 16. מספר מנגנונים מוצעים לתווך galvanotaxis או להסביר את היכולת של התאים לחוש את השדה החשמלי, כולל הפעלה של EGF קולטני 12, ערוץ נתרן אפיתל 17, PI3K וPTEN 18, ושחרורו של סידן יונים 15, 19. המנגנון הוא עדיין לא הבין באופן מלא וזה אפשרי, כי מסלולי איתות מרובים מעורבים בgalvanotaxis. שיטת galvanotaxis 2-ממדית אנחנו מדגימים כאן היא שימושית כדי לאפיין את ההגירה כיוונית של חסיד, תאי ניעתי, או כדי לפקח על הגירת תאים בודדת 10, 12, 17 או הגירה של גיליון של תאים ומחוברות 18, 20. טכניקה זו שונה מ פנג והיפה 21, וNishimura et al. 10 עם, תאי PVC ברורים מחוייט, עם coversl הנשלףשב&quot;ס מאפשר לאחזור תא קל לאחר galvanotaxis לניתוח משני, כגון הדמיה חיסונית הקרינה. משטח הזכוכית של תאי galvanotaxis הוא אופטי תואם, המאפשר לצלם בהגדלה גבוהה ועם תאי fluorescently שכותרתו. זה גם מאפשר עיצוב ניסיוני עם שינוי של משטח הזכוכית, כגון שינוי ציפוי פני השטח או חיובים. מפרידי עשויים מס &#39;1 coverglass משמשים בתאי כדי למזער את הזרימה הנוכחית על התאים; לכן חימום ג&#39;אול, שהוא פרופורציונאלי לריבוע של הזרימה הנוכחית, לא לחמם יותר מדי את התאים במהלך הניסוי. הגשרים אגר החיבור למנוע מגע ישיר של אלקטרודות עם התאים ולמנוע שינוי של pH הבינוני או ריכוז יון בgalvanotaxis. שתי שורות תאי ערמונית אנושית שאינם סרטניות נבדקו לתגובת galvanotaxis במחקר זה. PRNS-1-1 22 וPNT2 23 שניהם SV40-הונצחו, שורות תאי גורם תלוי צמיחה המבטאות את סמני אפיתל cytokeratin 5, 8, 18 ו -19 עם ביטוי נמוך או לא של אנטיגן הספציפי לערמונית (PSA). שני שורות התאים לשמור על מורפולוגיה המצולעים של תאי האפיתל נורמלים, אבל הנורמליות של כרומוזום נצפתה בkaryotyping 22, 24. למרות שpRNS-1-1 וPNT2 לשתף התנהגויות דומות ברוב הניסויים, הם עושים להראות הבדלים במבנה של מבנה acinar וב galvanotaxis. על מטריצת 3-D, Matrigel, pRNS-1-1 תאים ליצור מבני acinar חלולים עם לומן הדומה לרקמת בלוטת הערמונית הרגילה 25. עם זאת, תאי PNT2 יוצרים spheroids המוצק ללא לומן או אפיתל המקוטב 26. תאי pRNS-1-1 גם להפגין תגובת galvanotactic גבוהה מPNT2 במחקר הנוכחי. המתאם בין ההיווצרות של מבנה acinar וgalvanotaxis בpRNS-1-1 מצביע על כך שאותות galvanotactic עשויים לשחק תפקיד בארגון יחסי הציבורתנועות ostate בלוטת רקמה בתגובה לשדות חשמליים אנדוגני, ומספקת מאפיינים נוספים להפלות בין 2 שורות תאים אלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:323px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cells</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRNS-1-1 prostate cells</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Lee et. al., (1994)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNT2 prostate cells</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95012613-1VL</td>
			<td>Berthon et al., (1995)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medium and solutions</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td>warm up to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premium</td>
			<td style="width:117px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11150</td>
			<td>10% in PBS, warm up to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td style="width:117px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240</td>
			<td>add 5mL to 500mL medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-propanol</td>
			<td style="width:117px;">VWR</td>
			<td>BDH1133-5GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:117px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>warm up to 37&#176;C before use, treat cells for 3-5 min at 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galvanotaxis device</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Galvanotaxis chambers</td>
			<td style="width:117px;">Precision Plastics Inc, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom-designed (1/4&#34; X 2&#34; X 3.5&#34;), non-toxic, clear PVC chambers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Galvanotaxis electrodes</td>
			<td style="width:117px;">UCD electric shop</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>platinum coiled electrodes with flexable cords</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Galvanotaxis power box</td>
			<td style="width:117px;">Substrate Engineering, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom-designed DC power output with voltmeter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1</td>
			<td style="width:117px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">3307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point marker</td>
			<td style="width:117px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Marine grade silicon sealer, clear</td>
			<td style="width:117px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">051135-08019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:117px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">2021846-0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6mL syringe</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-561-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nichiryo Syringe, 1.5mL</td>
			<td style="width:117px;">Nichiryo</td>
			<td style="width:119px;">SG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cotton applicators</td>
			<td style="width:117px;">Purtian Medical Products</td>
			<td style="width:119px;">806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qtips</td>
			<td style="width:117px;">Johnson &#38; Johnson</td>
			<td style="width:119px;">729389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene 180 PVC tubing&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">8000-9030</td>
			<td>503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto-Agar</td>
			<td style="width:117px;">Difco</td>
			<td style="width:119px;">0140-01</td>
			<td>make 2% agar solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:117px;">Personna</td>
			<td style="width:119px;">74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipments and Software</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop Centrifuge</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810R</td>
			<td>operated with an A-4-62 rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellometer Auto T4</td>
			<td style="width:117px;">Nexcelom</td>
			<td style="width:119px;">Auto T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cellometer counting chambers</td>
			<td style="width:117px;">Nexcelom</td>
			<td style="width:119px;">CHT4-SD100-002</td>
			<td>load 20uL cell solutions to count</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Culture Temp Warming plate</td>
			<td style="width:117px;">Bel-Art Scienceware</td>
			<td style="width:119px;">370150000</td>
			<td>to keep the galvanotaxis chambers at 37&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber</td>
			<td style="width:117px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plan Fluor 10X/0.30 objective len</td>
			<td style="width:117px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Retiga EX CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed air with 5% CO2&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>special order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Volocity 6.3</td>
			<td style="width:117px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image acquiring software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Improvision OpenLab 5.5.2</td>
			<td style="width:117px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Cell tracking software and customized to measure migration angles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FileMaker Pro Advanced, 8.0</td>
			<td style="width:117px;">FileMaker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microsoft Excel 2008 for Mac</td>
			<td style="width:117px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing custom-designed galvanotaxis chambers to study directional migration of prostate cells

השדה החשמלי הפיזיולוגי משרת פונקציות ביולוגיות ספציפיות, כגון בימוי נדידת תאים בפיתוח עובר, תולדה עצבית וריפוי פצע אפיתל. הפעלת שדה חשמלי של זרם ישיר לתאים בתרבית במבחנה גורמת הגירה כיוונית תא, או galvanotaxis. שיטת galvanotaxis 2-ממדית אנחנו מדגימים כאן היא שונה עם פולי מחוייט (ויניל כלוריד) (PVC) תאים, משטח זכוכית, אלקטרודות פלטינה והשימוש בבמה ממונעת שבו התאים הם צילמו. תאי PVC ואלקטרודות פלטינה להציג cytotoxicity נמוך והם סבירים ומחדש שמישים. משטח הזכוכית והבמה מיקרוסקופ הממונעת לשפר את האיכות של תמונות ומאפשרים שינויים אפשריים למשטח הזכוכית וטיפולים לתאים. אנחנו צילמנו את galvanotaxis של שני קווים שאינם סרטניים-הונצח SV40 ערמונית תא, pRNS-1-1 וPNT2. שתי שורות תאים אלה מראות מהירויות הגירה דומות ושניהם נודדים לעברהקתודה, אבל הם עושים להראות במידה שונה של יווניות בgalvanotaxis. התוצאות שהתקבלו באמצעות פרוטוקול זה מצביעים על כך שpRNS-1-1 ושורות תאי PNT2 עשוי להיות מאפיינים מהותיים שונים המסדירים תגובות הנדידה כיוונית שלהם.

שתי שורות של תאי ערמונית (pRNS-1-1 וPNT2) נחקרו בשיטה זו. תאים בשני הקווים להעביר במהירויות דומות של 1.0 +/- 0.3 מיקרון / min במהלך 2 שעות (איור 5 א). עם זאת, כיווניות לשדה החשמלי היא 0.7 +/- 0.3 לpRNS-1-1 הקו, ו -0.2 +/- 0.8 לקו PNT2 (איור 5). התוצאות מראות הבדל משמעותי בgalvanotaxis של שתי ש...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells at JoVE.com

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

ניצול לשכות Galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

utilizing-custom-designed-galvanotaxis-chambers-to-study-directional

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Views.  University of California, Davis. We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Video: Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

באמצעות קאקו-2 תאים לחקר ליפידים תחבורה במעי

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells