העבודה שהובילה לפרסום זה קיבלה מימון מתכנית מארי קירי COFUND &quot;U-הניידות&quot;, cofinanced על ידי האוניברסיטה של מלאגה ותכנית האיחוד האירופי 7 מסגרת ה (FP7/2007-2013) תחת GA מס 246,550. העבודה במעבדה שלנו היא נתמכת על ידי מענקים מ-NIH, משרד החקלאות / NIFA, NSF, בארד, וBSF לVC

1. ביטוי חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה של מערכת ביטוי בחר במערכת, כלומר, וקטורים ושיטת הצגת וקטור, מתאימה ביותר לביטוי של החלבון של העניין באורגניזם / תא דגם הספציפי. שים לב כי assay שלנו דורש ביטוי של החלבונים שנבדקו בכמויות בקלות detectible, אשר מושגת על ידי מיטב שינוי זמני של מספר הגדול של תאים. בצמחים, למשל, זה הכי טוב מושגת באמצעות פלסמידים ינארי כוקטורי ביטוי וAgrobacterium כמערכת אספקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנייה של וקטורי ביטוי בינארי לשכפל את רצף הקידוד (ים) של החלבון (ים) של עניין לתוך וקטור ביטוי לבד או בשילוב של תרגום לתג epitope. שימוש וקטורים שמתאימים למערכת הביטוי שבחר ונהלי ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיים לשיבוט גנטי. למסירת גן בתיווך Agrobacterium, להעסיק וקטורים בינאריים ולהציג אותם, גם באמצעות standaפרוטוקולי rd, למתח Agrobacterium, כגון EHA105, לחיסון הבא של רקמות צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה של מיני צמחים בחר את מיני צמחים שבו החלבון (ים) של העניין יבוא לידי ביטוי. שימו לב כי, בעוד שניתן להשתמש בם בכל מיני צמחים רגישים לשינוי גנטי בתיווך Agrobacterium, מיני הצמחים שלנו בחירה הוא ניקוטיאנה benthamiana, אשר גדל בקלות, רגיש מאוד לAgrobacterium, ויש לו עלים גדולים שהם מחוסן בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידול צמחים לגדל את הצמח אחת ל -4 עד 6 שבועות בסיר עם Pro-Mix BX בסיר (20 סנטימטר x 20 סנטימטר x 20 סנטימטר) בתנאי סביבה מבוקרים (למשל, תא צמיחה) של יום ארוך (כלומר, 16 שעות של 130 -150 ΜE m-2 אור S-1 ב23 מעלות צלזיוס וחשוכות שעות 8 ב20 מעלות צלזיוס) ו40-65% לחות יחסית. 1.5.2 לדשן מדי פעם עם מוצרים זמינים מסחרי לפי הוראות יצרן. ברגע שהצמח גדל, בחרמשאיר אותך עם הגודל של 50 מ&quot;מ x 70 מ&quot;מ או גדול יותר (מדידות אורך אלה אינן כוללות פטוטרת) עבור חיסון Agrobacterium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיסון עם Agrobacterium לגדול זן Agrobacterium מחסה המבנה בינארי המבטא את החלבון (ים) נבדק מצעד 1.3 הלילה בשעה 28 מעלות צלזיוס במדיום YEP (peptone 1%, 1% תמצית שמרים, ו0.5% NaCl) בתוספת האנטיביוטיקה מתאימה (למשל, 100 מ&quot;ג / סטרפטומיצין L ו10 ריפאמפיצין מ&quot;ג / ליטר עבור וקטורים מבוססי pPZP-RSC2 24-25). 1.6.2 צנטריפוגה התאים, resuspended לOD 600 = 0.5 במאגר הסתננות [10 מ&quot;מ MgCl 2, 10 Mes מ&quot;מ (pH 5.6), 100 acetosyringone מיקרומטר], ו דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. חדור בתרבות לצד abaxial של עלה, באמצעות מזרק מחטים 1 מ&quot;ל; לציין כי העלים מחוסן באתרו, ואילו מצורף למפעל. 1.6.3 לאחר החדירה, מגדל את הצמח ל72 שעות תחת משטר אור 16 h &amp; 130-150181 #; m-2 אור E S-1 ב23 ° כהה h C / 8 ב20 מעלות צלזיוס לפני הקציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום של מעכבי proteasomal תומכים ברעיון כי החלבון (ים) שנבדק הוא מושפל על דרך מסלול proteasomal, השתמש MG132 מעכבי proteasomal הספציפי וlactacystin 28-29, שאמור להפחית או אפילו לחסום השפלה. ארבע שעות לפני קצירת (ראה שלב 2.1), לחדור לאזורי עלים מחוסן Agrobacterium עם 10 מיקרומטר MG132 (EMD Millipore) או 10 lactacystin מיקרומטר (סיגמא אולדריץ &#39;) או מדומה לטפל עלה עם הממסים בהתאמה, כלומר, DMSO 0.1% או מים מזוקקים. </li></ol> 2. הכנת תמציות תא ללא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצירה ליף קציר האזורים מחוסן של העלה, בדרך כלל CA. 200-400 מ&quot;ג של משקל טרי, וטוחנים אותם לאבקה דקה בחנקן נוזלי. לחלופין, חרוז-לנצח את הרקמות, באמצעות כל חרוז-מקצף (למשל, Biospec) או amalgamator שיניים (למשל, TPC מתקדם<html> טכנולוגיות) ישירות למאגר השפלה (ראה שלב 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת חלבון הכן כוללת תמצית חלבון על ידי הצבת רקמות קרקע ל500 μL של חיץ השפלה [50mm טריס-HCL (pH 7.5), 100 mM NaCl, 10 מ&quot;מ MgCl 2, 5 מ&quot;מ DTT, 5 מ&quot;מ אדנוזין 5&#39;-טריפוספט, ומעכבי פרוטאז 1x קוקטייל (סיגמא אולדריץ &#39;)]. שים לב כי מעכבי פרוטאז הקוקטייל משפיע בעיקר על סרין, ציסטאין, אספרטית, וmetalloproteases ואינו מפריע לפרוטאז 26S. להבהיר את התמצית על ידי שתי centrifugations הרציף ב12,000 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת פירוק חלבונים העבר את הכמויות שווה של תמציות, בדרך כלל 20 μL, לmicrofuge צינורות דגירה אותם בטמפרטורת חדר להגדלת פרקי זמן. בדרך כלל, זמן מדגם אפס, ו5, 10, 15, 20, ו30 נקודות זמן דקות. לעצור תגובות על ידי רתחה בחיץ ג&#39;ל מדגם SDS, ולנתח אותם על ידי מערבי סופג. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. זיהוי פירוק חלבונים על ידי immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל אלקטרופורזה 3.1.1 לפתור דגימות חלבון על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide וelectrotransfer החלבונים החליטו קרום ניטרוצלולוזה על פי הפרוטוקול הסטנדרטי 30. 3.1.2 קביעת ריכוז חלבון בשיטת ברדפורד (Bio-Rad), ולטעון 50-80 מיקרוגרם של חלבון בסך הכל לכל נתיב. ודא כי כל הדגימות נטענות באותה מידה. עבור פקדי טעינה, להשוות עוצמות של מיני חלבון נמצאים בכל מקום, כגון רשתות גדולות המשוערת RuBisCO אשר נודדות כלהקה גדולה עם ניידות electrophoretic יחסי של כ 50 kDa, הם יכולים להיות מזוהים על ג&#39;לים המוכתם הכחול Coomassie או על Ponceau S-או ניאון SYPRO רובי מוכתם קרומי ניטרוצלולוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה לחסום את הקרום עם 5% חלב דל שומן ב TBST (10 מ&quot;מ טריס-HCl, 140 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4) עבור h 1 בטמפרטורת חדר. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדן ראשוני מדולל נוגדנים נגד epitope עיקריים ב1% חלב דל שומן ב TBST לריכוז המומלץ על ידי היצרן ודגירה עם הקרום החסום עבור h 1 בטמפרטורת חדר או ללילה ב 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטיפה יש לשטוף את הממברנה היא שטפה ב20 TBST מיליליטר במשך 15 דקות פעם אחת, ופעמים במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדנים משני מדולל נוגדנים משני (למשל, IgG נגד ארנב) מצומד עם peroxidase סוס צנון (HRP) ב 1% חלב דל שומן ב TBST כפי שהומלץ על ידי היצרן ו דגירה עם הקרום עבור h 1 בטמפרטורת חדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור יש לשטוף את הקרום שוב כפי שמתואר בשלב 3.4. לאחר השטיפה הסופית ב TBST, לדמיין את החלבונים של עניין עם מצע chemiluminescent HRP, לרוב באמצעות ערכת ECL. </li></ol>

<ol>
	<li>Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+control+in+ubiquitin-dependent+proteolysis:+don&#8217;t+Skp+the+F-box+hypothesis.">Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don&#8217;t Skp the F-box hypothesis.</a> Trends Genet. 14, 236-243 (1998).</li><li>Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+and+cullin/ring+H2-based+ubiquitin+ligases.">SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases.</a> Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).</li><li>Callis, J., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+in+signaling.">Protein degradation in signaling.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).</li><li>Hellmann, H., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+development:+regulation+by+protein+degradation.">Plant development: regulation by protein degradation.</a> Science. 297, 793-797 (2002).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Dharmasiri, S., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+regulated+protein+degradation+in+auxin+response.">The role of regulated protein degradation in auxin response.</a> Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).</li><li>Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens.">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li><li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+ubiquitin-26S-proteasome+pathway+in+gibberellin+signaling.">A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling.</a> Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).</li><li>Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+26S+proteasome+system+in+the+signaling+pathways+of+TGF-beta+superfamily.">The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily.</a> Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).</li><li>Pagano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+DNA+synthesis+and+mitosis+by+the+Skp2-+p27-Cdk1/2+axis.">Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis.</a> Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).</li><li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+of+the+host+SCF+ubiquitin+ligase+machinery+by+plant+pathogens.">Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens.</a> Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+the+biology+behind+the+&amp;#34;gene-jockeying&amp;#34;+tool.">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &amp;#34;gene-jockeying&amp;#34; tool.</a> Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).</li><li>Schrammeijer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+virulence+protein+VirF+of+Agrobacterium+tumefaciens+with+plant+homologs+of+the+yeast+Skp1+protein.">Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein.</a> Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).</li><li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity.">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li><li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium.">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li><li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway.">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).</li><li>Zhou, P., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+degradation+of+the+substrate+recognition+subunits+of+SCF+ubiquitin-protein+ligases.">Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases.</a> Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).</li><li>Galan, J. M., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+degradation+of+multiple+F-box+proteins+by+an+autocatalytic+mechanism.">Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).</li><li>Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tome-1,+a+trigger+of+mitotic+entry,+is+degraded+during+G1+via+the+APC.">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li><li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo.">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li><li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector.">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li><li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP/Slimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase.">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li><li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSAT+vectors:+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants.">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li><li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units.">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li><li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li><li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells.">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome:+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms.">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li><li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin.">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li><li>Ausobel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3/LOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses).">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

assay זה מסתמך על הביטוי של החלבונים שנבדקו ברקמות צמח, ולכן תהליך התדרדרות proteasomal הפוטנציאל ברור שמתרחש כבר בתוך רקמות החיות. אנו assay יציבות חלבון, לעומת זאת, רק בתמציות, בזמן אפס מדגם המשמש כנקודת התייחסות הראשונית. לפיכך, אנו מגדירים אותו כassay ללא תא. <p class="jove_content" style=...

המסלול הפרוטאזום ubiquitin/26S מתגלה כמנגנון נפוץ לבקרה של תגובות ביולוגיות שונות, כוללים תקנת תעתיק, התקדמות מחזור התא והולכים אותות, קולט למטה תקנה או אנדוציטוזה, בין השאר מעבד 1-4. במסלול זה, חלבון המטרה מתויג על ידי יוביקוויטין שאריות אשר מחוברות ראשונה באמצעות אג&quot;ח thiolester לאנזים שמפעיל את היוביקוויטין E1 ולאחר מכן translocated לשאריות חומצת אמינו ציסטאין של אנזים היוביקוויטין-נטיית E2, סוף סוף, E2 אינטראקציה עם האנזים E3 יוביקוויטין , וכתוצאה מכך polyubiquitination של מצע החלבון. סופו של דבר, חלבוני polyubiquitinated מוכרים ומושפלים על ידי הפרוטאזום 26S. במנגנון זה, אנזים E3 מציין את המצע ומשמש כמרכיב הרגולציה המרכזי של מערכת ubiquitin/26S הפרוטאזום (UPS). ligases E3 יכול לפעול באופן עצמאי, כגון ligases תחום RING, או כחלק מSCF multisubunit (Sמורכב kp1/Cullin/F-box חלבון), כגון ligases תחום ה-F-התיבה. מסלולי השפלה proteasomal תיווך SCF מעורבים ברגולציה של שעתוק, מחזור תא, העברת אותות 5-10 ופונקציות רבות הסלולר גדולים אחרות. חוץ מתפקידים אלה קריטיים בויסות תהליכים תאיים, UPS לוקח את הבמה המרכזית ביחסי גומלין הצמח לפתוגן רבים. לדוגמא, ראיות מצביעות על כך שהגדלת מספר פתוגנים צמח, כוללים tumefaciens Agrobacterium, מסתמכים על UPS המארח לכדי להקל על תהליך ההדבקה 11. Agrobacterium מעורר גידולי neoplastic על צמחים, המייצגים את המארחים הטבעיים שלה, וזה גם יכול להפוך מגוון רחב של אאוקריוטים אחרים, מפטריות 1,2 לתאים אנושיים 12,13. במהלך ההדבקה שלו, Agrobacterium מייצא אלמנט ה-DNA (T-DNA) וכמה ארסיות חלבונים (Vir) לתוך התא המארח 12-13. אחד מהחלבונים האלה הוא VirF, חלבון ה-F-התיבה הראשונה שנמצאכדי להיות מקודד על ידי הגנום פרוקריוטים 14. כחלק ממכלול SCF ubiquitin האנזים, VirF, וhomolog המארח הפונקציונלי שלה 15 VBF, להקל על זיהום Agrobacterium באמצעות פירוק חלבונים בתיווך UPS, אשר ככל הנראה מאפשר uncoating של T-DNA חיידקים הפולש מחלבונים החיידקים ומארח הנלווים לה, VirE2 וVIP1, בהתאמה 16,17. מעניין לציין, כי חלבוני ה-F-תיבה רבות, כולל VirF, הם מיסודם לא יציבים בשל proteolysis שלהם, שמתווך על ידי פעילות autoubiquitination 18,19 או על ידי ligases E3 אחר שחלבוני ה-F-תיבה עשויים לשמש כמצעי 20-23. כאשר לומדים את פעילות הביוכימית של חלבוני ה-F-תיבה, ligases היוביקוויטין אחר, ו / או מצעים שלהם, זה יהיה מאוד שימושי כדי להעסיק assay פשוט ואמין לשפלת proteasomal. כאן אנו מתארים פרוטוקול אחד כזה לניתוח יציבות חלבון בתאללא מערכת. ב assay זה, היציבות של מצע UPS הוא ניתח בנוכחותו או היעדריו של אחד מהמרכיבים החיוניים של מסלול proteasomal השפלה, כגון חלבון ה-F-תיבה, במערכת ללא תא. באופן כללי, אנו מביעים את החלבון (ים) שנבדק ברקמות צמח, להכין תמציות תא ללא מרקמות אלה ולפקח על הכמויות של החלבון (ים) של עניין על ידי מערבי סופג. מנגנון UPS תלוי של פירוק חלבונים מודגם על ידי הכללתם של מעכבי proteasomal ספציפיים ו / או שימוש coexpression של צורה דומיננטית שלילית של מרכיב SCF, Cullin. הואיל ואנו להמחיש assay זה באמצעות השפלה proteasomal של חלבון ארבידופסיס VIP1 17 על ידי חלבון ה-F-תיבת 15 VBF, זה עשוי להיות מועסק על מנת לחקור את היציבות של כל מצעי proteasomal אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Protein assay kit</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Proteinase inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mini-Protean system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Semi-dry western blotting SD electrotransfer system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Affinity Purified Rabbit Anti-Ha</td>
			<td style="width:129px;">icllab</td>
			<td>RHGT-45A-Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate</td>
			<td style="width:129px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane</td>
			<td style="width:129px;">Pall Corportation</td>
			<td style="width:119px;">27377-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Immobilon western chemiluminescent HRP substrate</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MG132</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td>474790-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate</td>
			<td style="width:129px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">35055</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying proteasomal degradation in a cell-free system in plants

מסלול היוביקוויטין-proteasome לפירוק חלבונים התפתחה כאחד מהמנגנונים החשובים ביותר לרגולציה של קשת רחבה של תפקודים תאיים כמעט בכל יצורי אוקריוטים. באופן ספציפי, בצמחים, במערכת ubiquitin/26S הפרוטאזום (UPS) מסדירה פירוק חלבונים ותורמת באופן משמעותי לפיתוח של מגוון רחב של תהליכים, כולל תגובה חיסונית, פיתוח ומוות תאים מתוכנת. יתר על כן, ראיות מצביעות על כך שהגדלת פתוגנים רבים צמח, כגון Agrobacterium, לנצל את UPS המארח לזיהום יעיל, תוך שימת דגש על החשיבות של UPS באינטראקציות הצמח לפתוגן. הספציפיות המצע של UPS מושגת על ידי האנזים יוביקוויטין E3 שפועל בתיאום עם E1 ו-E2 ligases לזהות ולסמן את מולקולות חלבון ספציפיות המיועדות לפירוק על ידי הצמדת אליהם שרשרות של מולקולות יוביקוויטין. סוג אחד של ligases E3 הוא SCF (Skp1 / Cחלבון מורכב Ullin / F-box), שדווקא מכיר במצעי UPS ומטרותיהם לubiquitination באמצעות מרכיב חלבון ה-F-התיבה שלו. כדי לחקור את התפקיד פוטנציאלי של UPS בתהליך ביולוגי של עניין, חשוב לתכנן assay פשוט ואמין לפירוק חלבונים בתיווך UPS. כאן, אנו מתארים assay אחד כזה באמצעות מערכת ללא תא צמח. assay זה יכול להיות מותאם למחקרים של התפקידים של פירוק חלבונים מווסת בתהליכים תאיים שונים, עם דגש מיוחד על אינטראקציות חלבון מצע F-box.

איור 1, שהותאם מזלצמן ואח&#39;. 17, מדגים ניסויי נציג לצורך זיהוי של השפלה proteasomal במערכת ללא תא. באופן ספציפי, אנחנו מדגימים יציבות של VIP1 חלבון הקשורות להגנת צמח על ידי חלבון ה-F-תיבת VBF דרך מסלול SCF VBF בנ benthamiana. VBF ארבידופסיס וחלבונים מתויג...

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants at JoVE.com

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש &quot;תגים&quot; מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמין לשפלת proteasomal של חלבונים.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

assaying-proteasomal-degradation-in-a-cell-free-system-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K Views.  Stony Brook University, State University of New York.  פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש "תגים" מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמ?...

Video: Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

שמירה ב Wolbachia בינוני סלולרי חינם

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

פרוטוקול פשוט למיפוי תכונות ארכיטקטורת מערכת שורש הצמח

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

כימות חדירת שומן בשרירי השלד באמצעות דה-צלולריזציה

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

מחבר זרקור: כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.

כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...

הטמעת תגובות CFPS במגוון מטריצות הידרוג'ל

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. While the dominant paradigm for the deployment of gene networks is within a cellular chassis, synthetic gene networks may also be deployed in cell-free environments. Promising applications of cell-free gene networks include biosensors, as these devices have been demonstrated against biotic (Ebola, Zika, and SARS-CoV-2 viruses) and abiotic (heavy metals, sulfides, pesticides, and other organic contaminants) targets. Cell-free systems are typically deployed in liquid form within a reaction vessel. Being able to embed such reactions in a physical matrix, however, may facilitate their broader application in a wider set of environments. To this end, methods for embedding cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in a variety of hydrogel matrices have been developed. One of the key properties of hydrogels conducive to this work is the high-water reconstitution capacity of hydrogel materials. Additionally, hydrogels possess physical and chemical characteristics that are functionally beneficial. Hydrogels can be freeze-dried for storage and rehydrated for use later. Two step-by-step protocols for the inclusion and assay of CFPS reactions in hydrogels are presented. First, a CFPS system can be incorporated into a hydrogel via rehydration with a cell lysate. The system within the hydrogel can then be induced or expressed constitutively for complete protein expression through the hydrogel. Second, cell lysate can be introduced to a hydrogel at the point of polymerization, and the entire system can be freeze-dried and rehydrated at a later point with an aqueous solution containing the inducer for the expression system encoded within the hydrogel. These methods have the potential to allow for cell-free gene networks that confer sensory capabilities to hydrogel materials, with the potential for deployment beyond the laboratory.

מחבר זרקור: גישה חדשנית להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים 

Here, we present two protocols for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogel matrices without the need for an external liquid phase.

שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים בקנה מידה מאקרו

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...