קצב סינתזת החלבון מוטרד במהלך המחלה וההזדקנות. התאוששות פלואורסצנטיות לאחר photobleaching, או FRAP, מאפשר מדידה של קצב סינתזת החלבון ב vivo. אנו משתמשים בתולעי C.elegans שקופות, המבטאת GFP, כמודל לניטור סינתזת החלבון החדשנית לאחר צילום.
אנו מספקים הנחיות מעשיות למדידת התאוששות פלואורסצנטיות באמצעות תולעים מהונדסות, המבטאות GFP תחת מקדמים שונים, בין אם באופן נרחב או בתאים או ברקמות ספציפיים. כמו כן, שיטה זו מציעה ניטור מהירות סינתזה של חלבונים בזמן אמת. השתמש בסטריאומיקרוסקופ ניתוח כדי להעריך את השלבים ההתפתחותיים והצמיחה של נמטודות מהופנטות מסוג פראי ומוטנטים.
בחר 10 זחלי L4 של בעלי חיים מהונדסים מסוג פראי ומוטנטים הנושאים את הכתב הפלואורסצנטי הרצוי על לוחות מדיה לצמיחה נמטודה זרע עם E.coli. דגירה ולגדל את nematodes בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 מעלות צלזיוס. ארבעה ימים לאחר מכן, הלוחית מכילה אוכלוסייה מעורבת של תולעים מהוונות.
בחר והעבר 15 זחלי L4 של כל זן על צלחות OP50 NGM טריות. בצע בדיקת FRAP, ונטר את קצב סינתזת החלבון ביום הראשון לבגרות. למחרת, להכין ולהשתמש cycloheximide המכיל לוחות NGM כשליטה חיובית.
להרוג חיידקים על ידי חשיפת צלחות NGM זרע במשך 15 דקות עם אור UV. הוסף cycloheximide על החלק העליון של צלחות זרעי חיידקים מדי 500 מיקרוגרם לכל ריכוז סופי mL בנפח אגר. אפשר לצלחות להתייבש.
העבר nematodes מהופנטים המבטאים GFP על הרכב ו cycloheximide המכיל לוחות. דגירה בעלי חיים במשך שעתיים בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 מעלות צלזיוס. בחרו והעבירו בעלי חיים מהומרים למבוגרים ליום אחד לצלחות NGM בודדות עם טיפת OP50 של 20 מיקרוליטרים במרכז.
הסר את המכסה והצב כל צלחת תחת עדשה אובייקטיבית 20H של מיקרוסקופ epifluorescent. התמקד ולכוד תמונת ייחוס לפני צילום. פוטובלך כל דגימה במשך 10 דקות.
לכוד תמונה לאחר צילום. שמור בעלי חיים בצלחות NGM בודדות, ולתת להם להתאושש. תדמיין ותקליט את ההתאוששות של כל כתב פלואורסצנטי כל שעה במשך שש שעות לפחות בסטריאומיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.
הכינו רפידות של 2%agarose, והוסיפו 10 טיפות מיקרוליטר של מאגר M9 במרכז כרית אגרוז. העבר חמישה נמטודות מהופנטות המבטאת GFP ציטופלסמי פאן-עצבי לתוך טיפה של חיץ M9. השתמש עפעף כדי להפיץ את הנוזל.
בעלי חיים מציגים תנועות מופחתות תוך שתי דקות בגלל ספיגת M9 לתוך הגר. לשנות את המיקום של nematode באמצעות פיק עפעף. מניחים את המדגם בעדשה אובייקטיבית 40H של מיקרוסקופ epifluorescent מבלי להשתמש בתעודת כיסוי.
מיקוד ולכידה של תמונת ייחוס. פוטובלך אזור עניין ממוקד למשך 90 שניות. לכוד תמונה לאחר צילום.
הוסף טיפת 10 מיקרוליטר של מאגר M9 על נמטודות פוטובלאק. תן לחיות להתאושש לחמש דקות. השתמש בבחירה עפעף או פיפטה כדי להעביר את nematodes לצלחות NGM בודדים זרע עם 20 microliters OP50 טיפה במרכז.
לכוד תמונה של כל דגימה כל שעה תחת סטריאומיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. תולעים מוטנטיות מסוג Wild-type ו-fe-2 המבטאת GFP ציטופלסמי לאורך כל הרקמות סומטיות שלהם באמצעות מקדם fe-2 הושוו בעבר, מיד לאחר photobleaching, וחמש שעות לאחר ההחלמה. בעלי חיים מסוג בר החלימו לחלוטין בזמן שלמוטנטים FE-2 הייתה יכולת התאוששות מיני.
לכן תולעים מסוג פראי ליזום את סינתזת החלבון הרגילה לאחר photobleaching, בעוד תולעים חסרות גורם חניכה תרגום mRNA fe-2 אינם מסוגלים לעשות זאת, המציין כי קצב ההתאוששות פלואורסצנטי ממחיש את קצב סינתזת החלבון ב vivo. Cycloheximide, מעכב ספציפי של תרגום mRNA יכול לשמש שליטה חיובית עבור עיכוב תרגום חלבון. ואכן, בעלי חיים מהופנטים שטופלו בציקלוהקסימיים המבטאים GFP ציטופלסמי תחת האמרגן אינם משחזרים את הפלואורסצנטיות שלהם עם הצילום.
גופי עיבוד mRNA משפיעים על קצב תרגום החלבון. נמטודות מוטנטים מסוג Wild-type ו- edc-3 המבטאת GFP pan-neuronally נבדקו עבור יכולת ההחלמה שלהם על פוטובלאצ'ים ממוקדים באזור הראש. התאוששות פלואורסצנטית היא הרבה יותר איטית בבעלי חיים edc-3 לקוי בהשוואה תולעים מסוג בר.
אפנון סינתזת חלבונים חיוני להונוסטזיס אורגניזם. במהלך ההזדקנות, סינתזת חלבונים גלובלית, כמו גם ספציפית, מוטרדת. איזון תרגום חלבונים שולט ישירות ברגישות ובהזדקנות.
באופן ספציפי, רכיבי הליבה של מכונות התרגום, כמו גם P-body אינטראקציה רכיבים להאיץ את תהליך ההזדקנות. הפרעה של חניכת תרגום מאטת את ההזדקנות. לפיכך, מדידת שיעורי סינתזת החלבון העולמית על ידי FRAP היא קריאה ישירה של תהליך ההזדקנות.
