הפלקה של וירוסי הרפס סימפלקס

הפרוטוקול מסייע לתלמידים לזהות זיהומים בודדים בבירור ולבצע את הבדיקה בקלות, מה שהופך אותו ליעיל יותר לכמת טיטר ויראלי. פרוטוקול זה משלב הליך קיבעון והכתמה פשוט המפיק תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הדיוק והיעילות של טיפולים אנטי-ויראליים נגד מחלות.

המשוכות הקשות יותר של פרוטוקול הפלקה הזה הן ספירת התאים עבור זריעת לוחות, מוודאים שהתאים אינם צפופים, מתייבשים או נשרטים לאורך כל התהליך. אפשר גם למצוא קושי באופי הקפדני הכולל של פרוטוקול זה. עם זאת, בפועל הוא תורם מרכזי של ההצלחה של ניסוי זה.

כדי להתחיל, להשלים את דילול המדגם בתוספת של וירוס לתאים במושב מעבדה אחד. לדלל באופן סדרתי כל דגימת וירוס להיות פלאק ב- PBS. בדרך כלל יש להשתמש בדילולים של פי 10 למעקב המדויק ביותר.

שמור את כל הדילולים הנגיפיים על הקרח עד שיהיה מוכן להוסיף את דגימות הנגיף המדוללות האלה לתאים. הסר את מדיום תרבית התאים מבאר אחת או שתיים באמצעות פיפטה. הוסף בזהירות את דגימת הווירוס המדוללת טיפה לכל חד שכבתי של תאים dropwise דרך הצד של כל באר.

חזור על התהליך עבור כל באר אחת או שתיים עד הצלחת כולה מתמלאת עם דגימות וירוס להיות פלאק. רוק בעדינות את הצלחת כולה ביד. ואז לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לאפשר את ספיחת הנגיף.

לאחר כל 10 דקות, להסיר את הצלחת מן האינקובטור, בעדינות לטלטל אותו שוב כדי להפיץ את הנגיף באופן שווה יותר על פני כל באר, ולאחר מכן למקם אותו בחזרה באינקובטור. כדי להפחית את האפשרות של ספירה בשוגג של inoculum unabsorbed, להסיר את דגימת הנגיף מן הבארות באמצעות קצה פיפטה 1000 מיקרוליטר ולהשליך את המדגם בכוס פסולת. מניחים 2.5 מיליליטר של כיסוי מתילצלולוז על הצלחת, ומחזירים אותו לאינקובטור.

לחטא את הפסולת, בדרך כלל עם תוספת של אקונומיקה, יודופר, או וירוקסיד דומה, לפני הסרתו מארון הבטיחות הביולוגית. לאחר הדגירה בת היומיים, הסירו את שכבת היתר של מתילצללוז מבאר אחת או שתיים בכל פעם באמצעות פיפטה, והניחו אותה בכוס פסולת. הוסף כשני מיליליטר של 1% סגול קריסטל ב 50% אתנול לכל באר.

לדגור על הצלחת עם כל הבארות מלאות בכתם במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בשלב זה, לחטא את הפסולת כפי שהוכח בעבר. לשטוף את הצלחות במרץ עם מי ברז עד נגר ברור.

ודא שיש הבדלים של פי 10 במספר הלוחות בכל סדרת דילול. האיור מתאר ירידה של פי 10 בספירת הלוחות שבהם מספר הלוחות הניתן לספירה ירד בטווח של 10 עד מינוס 4 עבור כל שלושת המשכפלים. שלוש התמונות הראשונות באיור מתארות לוחות בדילול של 10 עד מינוס שלוש.

עם זאת, השורה התחתונה מציגה תוצאות כאשר בדיקת פלאק אינה מתנהלת היטב. ישנם מעט מאוד לוחות הנראים מכל דילול באזורים הנראים לעין סביב החלק העליון שבו תאי Vero הוסרו לחלוטין מן המצע. באופן דומה, נתון זה מראה בעיות עם תאים מתייבשים או טיפול לקוי במהלך בדיקת פלאק.

עם זאת, נתון זה מראה באופן ביקורתי זריעת תאי Vero עניים. כל באר מראה כתמים סגולים כהים יותר, המעידים על תאים שאינם מתפשטים היטב על פני הבאר ונערמו זה על גבי זה באשכולות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ודא שהנגיף מתפשט באופן אחיד על פני הצלחת כדי למנוע לוחות מגובשים בדיקות פלאק יעילים יותר מאשר שיטות כמותיות אחרות כי זה סופר רק וירוס חי.

בדרך זו, יעילות אנטי ויראלית אמיתית ניתן לבסס. בנוסף, טכניקה זו אפשרה לנו לכמת נוכחות ויראלית על fomites ולחקור את האפקטיביות של אספקת תרופות ממכשירים רפואיים חדשניים בתוך המגזר שלנו של מחקר וירוס הרפס.