אנו מודים לחברי מעבדת Wobus להערות והצעות קריטיות. העבודה במעבדה של CEW מומנה על ידי קרנות הזניקו מאוניברסיטת מישיגן, מענק פיתוח קריירה ממרכז NIH / NIAID מצוינות האזוריים לביו הגנה והמחקר העולה מחלות זיהומיות (RCE) תכנית, אזור V הגדול &#39; RCE &#39;אגמים (פרס NIH 1-U54-AI-057153) וNIH R01 AI080611. MBG-H. מומן על ידי הניסויי אימונולוגיה (NIH T32 A1007413-16) ואת המנגנונים המולקולריים בפתוגנזה של חיידקים (NIH T32 A1007528) מעניקה הכשרה לאוניברסיטת מישיגן. JBC מומן על ידי Coordenação דה Aperfeiçoamento דה דה pessoal Nível סופריור (שכמיות), ברזיליה, ברזיל.

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטת assay פלאק לMNV-1 מוצגת כאן היא דרך של כימות חלקיקי MNV זיהומיות. על ידי ביצוע פעולות assay המאוירים באיור 3, ניתן לקבל titers הנגיפי לשעתק. המגבלה של זיהוי של assay תלויה בדילול מתחיל בשימוש. כאשר מתחילים עם דילול 1:10 של מדגם, כמתואר לעיל, המגבלה של זיהוי של assay פלאק היא 10 pfu (כלומר, לוח 1 גלוי ב10 -1 דילול). מאחר וכל רובד מייצג וירוס אחד, assay פלאק יכול לשמש גם כדי לטהר אוכלוסיות משובטות של MNV באמצעות הרמת שלטים מבודדים והפצתם כפי שתוארה לעיל 1. בנוסף, טהרת הפלאק יכולה לשמש גם כדי להפריד בין אוכלוסיית וירוס בודדה מאוכלוסיות וירוסים מעורבות. הגבלה של שימוש assay פלאק לגילוי זיהום MNV היא שלא כל זני MNV יוצרים פלאק 4. עם זאת, ייתכן שניתן יהיה להתגבר על inability של כמה זני MNV, שבודדו מבעלי חיים, ליצירת פלאק ידי passaging וירוסים אלה התוקפים בתרבית הרקמה 7. חלופה לassay פלאק היא למדוד חלקיקים מזהמים באמצעות 50 טכניקת TCID 3, 4. assay זה מכמת את כמות הווירוס הנדרש כדי לייצר CPE ב50% מתאי תרבית רקמה מחוסנת לאחר דילולי נקודתי קצה ולוקח 1 שבוע כדי להשלים לMNV 4. בנוסף להיות איטי יותר מאשר assay פלאק, 50 assay TCID הוא גם לא רגיש כמו (מגבלה של זיהוי = 200 TCID 50 / מ&quot;ל) בשל הרעילות של דגימות רקמה לתאי 264.7 RAW 4. אף ששלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול תוארו לאורך הפרוטוקול, הסעיף הבא מספק סיכום כדי להקל על בעיות ירי. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא להבטיח שתאי 264.7 RAW נשארים קיימא לאורך assay לתומך בשכפול נגיף. זה יכוללהיות במעקב בכל שלב של הבדיקה באמצעות מיקרוסקופ אור. כדאיויות תא מובטחת בשתי דרכים. ראשית, יש להיזהר לא לתת לתאים יתייבשו בזמן טיפול צלחות. לפיכך, צלחות מחוסנות אחד בכל פעם, התנדנדו בתקופת הזיהום, וצריכות להישאר סגורים כל פעם שהם לא מטופלים. שנית, הוסיפו פתרונות לתאים צריכים להיות מתאזנים ל ~ 37 ° C. יתר על כן, הוא חיוני לבריאות הכללית של 264.7 תאי RAW לשמור עליהם בתקשורת המכילה רעלן פנימי סרום נמוך (&lt;10 איחוד האירופי / מ&quot;ל), המגביל את ההפעלה של תאים. בנוסף, יש לנו נצפו שיעור כישלון גבוה יותר של assay פלאק בעת שימוש בתאים ממעבר 30 ומעלה. למרות שזה עשוי להשתנות ממעבדה למעבדה, חשוב לכלול ביקורת חיובית (למשל, דוגמה עם כייל נגיף ידוע) כדי להבטיח titers לשעתק, במיוחד כאשר באמצעות תאי 264.7 RAW מעבר גבוהים יותר. כדי להגביל את השימוש בתאי מעבר גבוהים יותר, מומלץ להקפיא את המבחנות של תחילת passaתאי ge עם קבלת 264.7 תאי RAW ולהתחיל תרבות חדשה מהבקבוקונים קפואים לעתים קרובות. להתחיל מחדש עם תרביות תאי מעבר נמוכות גם להיות שימושי כאשר תאים להציג מאפיינים שונו, כמו אי ספיקה לדבוק, שינויים במורפולוגיה של תאים (לדוגמה מסיבוב לדק והתפשט החוצה), או כאשר זיהום Mycoplasma זוהה. נקודה חשובה נוספת לשים לב להיא להבטיח שטיפי פיפטה משתנים בין דגימות ובמהלך הדילולים. זה יבטיח דילולים סידוריים מדויקים ולמנוע זיהום צולב בין דגימות. צעד אחד בפרוטוקול שבו ניתן להשתמש באותו קצה פיפטה שוב הוא כאשר דילולים סידוריים של אותו המדגם מתווספים לבארות. במקרה כזה, צריך להתחיל מבידוד המדולל ביותר ועד נמוך, ונמרצות פיפטה מעלה ומטה בעת עריכת דילול חדש. פרוטוקול assay פלאק הוא amendable למספר שינויים. שינוי אחד שיכול להתבצע כאשר tכאן הם לא מספיק תאים לinoculating בארות בשתי עותקים, הוא להדביק רק טובה אחת לכל דילול. עם זאת, מאחר שנפח הבידוד הוא 0.5 מ&quot;ל, מספר פלאק אז צריך להכפיל בפקטור של 2 לנרמל לpfu / מ&quot;ל. Assay פלאק יכול גם להיות מותאם לשימוש עם כל שורת תאי חסיד אחרת שיכולה לתמוך בשכפול של MNV, ואת זה כבר תאר לmicroglial קו BV-2 התא העכברי 8. שינויים אחרים שניתן ליישם הם עיבודים שתוארו בפרוטוקולי assay פלאק שפותחו עבור וירוסים אחרים. במקרה של MNV, את השינויים הבאים כבר יושמו בהצלחה, השימוש בתאית מתיל במקום לוחית ים 9 agarose, וצביעת תאים בסגולים או מתילן הכחול במקום האדום ניטראלית 10, 11 גביש. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם לפי צורך לכמת וירוסי פלאק יוצרים אחרים או שימוש לothאה וירוסים הגורמים לזיהומים בממוסס 264.7 תאי RAW, מה שהופך אותו לכלי שימושי לכמת חלקיקים נגיפיים מידבקים באופן כללי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> DMEM / סוכר גבוה </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x פניצילין וסטרפטומיצין </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 חומצות אמינו לא חיוני מ&quot;מ </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 מ&quot;מ (100x) L-גלוטמין </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> ים הרובד agarose </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> ניטראליים אדום 0.33% </td><td> סיגמא </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1.0 מ&quot;מ חרוזי Zirconia / סיליקה </td><td> מוצרי BioSpec </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Rocker מהירות המודל 35 </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> כלי Lyser Magna </td><td> רוש </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> שורת תאי גלם 264.7 </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> רקמת תרבות חממה </td><td> סנה </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

norovirus Murine (MNV) הוא הנציג היחיד של סוג norovirus שיעילות גדל בתרבית רקמת 1, 2. תמוגה תא והשפעת cytopathic (CPE) הם נצפו במהלך MNV-1 זיהום של תאי דנדריטים Murine או מקרופגים 1. מאפיין זה של MNV-1 יכול לשמש כדי לכמת את מספר החלקיקים מזהמים במדגם שניתן על ידי ביצוע בדיקת רובד 1. Assay פלאק מסתמך על יכולתו של MNV-1 לlyse תאים וליצור חורים בשכבת תאים מחוברת, הנקראות לוחות 3. טכניקות מרובות יכולות לשמש כדי לזהות זיהומים נגיפיים בתרבות רקמות, רקמות נקטפו, קלינית, ודגימות סביבתיות, אך לא לכל המידה את מספר החלקיקים מזהמים (למשל qRT-PCR). אחת הדרכים לכמת חלקיקים נגיפיים מידבקים הוא לבצע assay פלאק 3, שיתואר בהרחבה בהמשך. וריאציה על assay פלאק MNV היא פלואורידassay escent מיקוד, שבו אנטיגן MNV immunostained בmonolayers הסלולרי 4. בדיקה זו יכולה להיות מהירה יותר, שכן ביטוי האנטיגן נגיפי קודמת להיווצרות הפלאק. זה גם שימושי עבור titrating וירוסים מסוגלים ליצור את הפלאק. עם זאת, בדיקת מיקוד הניאון דורשת משאבים נוספים מעבר לאלו של assay פלאק, כמו נוגדנים ומיקרוסקופ כדי לספור יחידות מוקד יוצרים. זיהומיות MNV גם ניתן לכמת על ידי קביעת 50% מינון רקמות תרבות זיהומיים (TCID 50) 3. בדיקה זו מודדת את כמות הווירוס הנדרש כדי לייצר CPE ב50% מתאי תרבית רקמה מחוסנת ידי טיטרציה נקודת הסיום 5. עם זאת, מגבלתו של גילוי היא גבוהה יותר בהשוואה ל4 assay פלאק. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול assay פלאק שניתן להשתמש בו בצורה יעילה כדי לקבוע את מספר חלקיקי MNV זיהומיות להציג בדגימות ביולוגיות או סביבתיות 1, 4, 6. שיטה זו היא based על הכנת דילולים סידוריים 10-קיפול של דגימות MNV המכילים, המשמשים לחסן monolayer של תאים מתירנית (264.7 תאי macrophage Murine RAW). וירוס מותר לצרף לmonolayer התא לתקופת זמן נתונה ולאחר מכן aspirated לפני מכסה תאים עם תערובת של agarose ותקשורת סלולרית תרבות. אגר מאפשר את התפשטות צאצאים נגיפיים לתאים שכנים תוך הגבלת התפשטות לתאים הנמצאים בריחוק. כתוצאה מכך, תאים נגועים lysed וחורי טופס בmonolayer המכונים פלאק. עם התפשטותו של הווירוס מספקת, לוחות הפכו מכתימים הבא גלויה של תאים עם צבעים כמו אדום, ניטראלי, כחול תילן, או סגול גביש. בדילולים נמוכים, כל רובד נובע מחלקיק אחד מדבק נגיפי והצאצאים שלה, שהתפשט גם לתאים שכנים. לפיכך, לספור את מספר הלוחיות מאפשר לחשב יחידות שלט יוצרים (pfu) נוכחיות במדגם החי 3.

Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Plaque Assay for Murine Norovirus

כאן אנו מתארים שיטה לכמת חלקיקים זיהומיות של norovirus העכברי (MNV), שהוא היחיד שיעילות norovirus משכפל בתרבות תא. Assay פלאק מנצל הכמיהות של MNV למקרופאגים Murine ויכול להיות מותאם לשימוש עם דגימות ביולוגיות או סביבתיות המכילות MNV.

Assay רובד לnorovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.5K Views.  University of Michigan, Ann Arbor. כאן אנו מתארים שיטה לכמת חלקיקים זיהומיות של norovirus העכברי (MNV), שהוא היחיד שיעילות norovirus משכפל בתרבות תא. Assay פלאק מנצל הכמיהות של MNV למקרופאגים Murine ויכול להיות מותאם לשימוש עם דגימות ביולוגיות או סביבתיות המכילות MNV.

Video: Plaque Assay for Murine Norovirus

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Environment

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus Murine זיהומיות

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

מבחני עבור קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

כימות האדם Norovirus וירוס כריכת כריכה של חיידקים קומנדסאל באמצעות זרימה Cy, לנסות

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

פלאק אסאי: שיטה לקביעת טיטר ויראלי כיחידות יוצרות פלאק (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Microbiology

An Assay to Quantify the Binding of Human Norovirus VLPs to Intestinal Bacteria

Source: Madrigal, J. L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61048">Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates an assay for quantifying human norovirus virus-like particles (VLPs) binding to human intestinal bacteria. The bacterial suspensions are mixed with the VLPs and incubated to allow the formation of VLP-bacteria complexes. The complexes are then labeled with fluorophore-tagged VLP-specific antibodies, followed by flow cytometry-based visualization and quantification to identify the percentage of VLP-bound bacteria.

בדיקה לכימות הקשר של VLPs נורו-וירוס אנושי לחיידקי מעיים

1. VLP-bacteria Attachment Assay
CAUTION: Human norovirus VLPs are a biosafety level (BSL)-2 hazard, and all work involving VLPs should be performed in a ...