This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4 טרנספורמציה, ביטוי, וטיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשינוי PAD4, להפוך את הפלסמיד pGEX מכיל היתוך GST PAD4 לא כימי המוסמך תאי coli (BL21 (DE3)) לביטוי חלבון באמצעות ההליך הבא. הכן (סידן כלורי) כימי המוסמך E. תאי coli (BL21 (DE3)) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי 50 μl של BL21 כימי המוסמך שהוכן קודם לכן (DE3) תאים על קרח ולערבב עם 1 μl של פלסמיד המכיל גן pGEX PAD4 בצינור תרבות 5 מיליליטר. דגירה את התערובת על קרח למשך 10 דקות תוך רעד כל 2 דקות בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Heat Shock התאים על ידי הצבת את התערובת באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 40 שניות. מייד מניח את תערובת התא-פלסמיד חזרה על קרח במשך 2 דקות, כדי לאפשר לתאים להתאושש. הוסף 1 מיליליטר של מרק LB סטרילי לתערובת ומניח על קרח 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חום הלם תאים על 37 מעלות צלזיוס, הרועדת ב 250 סל&quot;ד 1שעות. פיפטה 75 μl של התאים הופכים על צלחת אגר עמידה אמפיצילין ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות. צלחת חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי PAD4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה 1 של BL21 תאים (DE3) מהצלחת אגר אמפיצילין והמקום ב 5 מיליליטר של LB המכיל אמפיצילין 1x. מקום חממה ולנער O / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 מיליליטר של LB (מתנע) ל1 ליטר של LB סטרילי המכיל trihydrate אמפיצילין 1x (MW 403.45 g / mol). צמיחה במקום רועד חממת 37 מעלות צלזיוס. צג OD 600 של הצמיחה. כאשר צמיחה מגיעה OD של 600 0.3, להעביר צמיחה ל- 16 מעלות צלזיוס רועדות חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הגיע OD 600 של 0.6, משרה את התאים עם 0.3 isopropylthiagalactoside מ&quot;מ (IPTG, ז MW 238.30 / mol). אפשר תאים לנער במשך 15 שעות על 16 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב4,000 XG במשך 20 דקות ב 0 מעלות צלזיוס. יוצקים את supernatant וגלול חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור PAD4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות את גלולה המכילה את PAD4 בא לידי ביטוי בBL21 (DE3) תאים במאגר של 50 מ&quot;מ NaCl (MW 58.44 g / mol), 300 מ&quot;מ לאא 2 PO 4 (MW 119.98 g / mol), 10 מ&quot;מ Imidazole (MW 68.077 ז /, 0.1 פלואוריד phenylmethylsulfonyl מ&quot;מ (PMSF, MW 174.94 g / mol) וdithiothreitol 1 מ&quot;מ (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8.0 mol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים באמצעות sonication במשך 15 דקות ב 4 ° C. בעקבות sonication, צנטריפוגה lysate התא ב20,000 XG במשך 20 דקות ב 0 מעלות צלזיוס. יוצקים את ולשמור supernatant. אצווה supernatant עם חרוזים agarose גלוטתיון (GSH) למשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים supernatant מGST חרוזים / טור באמצעות כוח משיכה. לשטוף חרוזים עם 4 x 25 מיליליטר של 1x PBS (בופר פוספט, pH = 8.0) בשעה RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute PAD4 עם 2 x 10 מיליליטר חיץ elution, aminomethane 50 טריס מ&quot;מ (hydroxymethyl) (טריס בסיס, MW 121.14 g / mol), 10 גלוטתיון מ&quot;מ (GSH, ז MW 307.32 / mol), pH = 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז PAD4 באמצעות חיתוך o 100k MWצינורות ff צנטריפוגה ו צנטריפוגות ב XG 4,000 במשך 20 דקות ב 4 ° C. חלבון Aliquot לכרכי μl 200 ב1.0 מיליליטר צינורות microcentrifuge ולאחסן ב -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. פתרונות מניות הכנה לחוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את נתרן כלורי (NaCl, MW 58.44 g / mol) ולהכין פתרון 2 M. מערבבים פתרון עד ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את aminomethane טריס (hydroxymethyl) (טריס בסיס, MW 121.14 g / mol) ולהכין 2 M פתרון, pH = 8.0. מערבבים פתרון עד ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את dihydrate סידן כלורי (CaCl 2 2H 2 O, MW 147.01 g / mol) ולהכין פתרון מ&quot;מ 500. מערבבים פתרון עד ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את phosphine טריס (2-carboxyethyl) (ז TCEP, MW 250.19 / mol) ולהכין פתרון 200 מ&quot;מ. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את dithiothreitol (DTT, MW 154.25 g / mol) ולהכין פתרון 1 M. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכןפתרון 0.5% טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את חומצת ethylenediaminetetraacetic (ז EDTA, MW 292.24 / mol) ולהכין פתרון 100 מ&quot;מ. מערבבים פתרון עד ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את Z- Arg- Arg- 7- amido- 4 methylcoumarin hydrochloride (ז ZRcoum, MW 621.69 / mol) ולהכין פתרון 10 מ&quot;מ בsulfoxide דימתיל (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 Assay על 37 מעלות צלזיוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ- 10 מניות מ&quot;מ ZRcoum, להכין פתרון 125 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון 125 מיקרומטר ZRcoum זה יהיה א הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ של 62.5 מ&quot;מ NaCl, 62.5 מ&quot;מ טריס, 12.5 מ&quot;מ CaCl 2, 6.25 מ&quot;מ DTT, ו -5 PAD4 מיקרומטר (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ של 62.5 מ&quot;מ NaCl, 62.5 מ&quot;מ טריס, 12.5 מ&quot;מ CaCl 2, ו -6.25 מ&quot;מ DTT (pH = 8.0). זה יהיה הפתרון ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ&quot;ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד בהיר ולאחסן ב -20מעלות צלזיוס. זה יהיה הפתרון ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג צלחת 96-היטב ולייעד מספר הבארות לביקורת (לא PAD4) ובארות (+ PAD4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 160 של התמיסה B לבארות ופיפטה μl 160 של הפתרון C לתוך בארות שליטה. דגירה במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 40 μl של פתרון לכל הבארות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של DH 2 O למחצית מבארות השליטה ומחצית מהבארות. למחצית השנייה של בארות שליטה ובקרת מבחן, פיפטה 10 μl של פתרון ד דגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר. </li></ol> 4. PAD4 Assay ב RT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ- 10 מניות מ&quot;מ ZRcoum, להכין פתרון 50 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון ZRcoum 50 מיקרומטר זה יהיה א הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר של 100 מ&quot;מ NaCl, 100 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ TCEP, 0.02%-100 X, ו- 8 PAD4 מיקרומטר טריטון (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר של 100 מ&quot;מ NaCl, 100 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ TCEP, ושל 0.02% טריטון X-100 (pH = 8.0). זה יהיה הפתרון ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ&quot;ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג צלחת 384 גם ולייעד בארות לביקורת (לא PAD4) ובארות (+ PAD4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 25 μl של התמיסה B לבארות ופיפטה 25 μl של הפתרון C לתוך בארות שליטה. לאפשר חיץ עם / בלי PAD4 כדי לדגור בבארות עבור 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 μl פיפטה של ​​הפתרון C לכל בארות דגירה במשך 45 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של DH 2 O למחצית מבארות השליטה ומחצית מהבארות. למחצית השנייה של בארות שליטה ובקרת מבחן, pipettדואר 10 μl של פתרון ד לדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר. </li></ol> 5. מבחני קורס זמן PAD4 על 37 מעלות צלזיוס וRT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ- 10 מניות מ&quot;מ ZRcoum, להכין פתרון 125 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון 125 מיקרומטר ZRcoum זה יהיה א הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ של 62.5 מ&quot;מ NaCl, 62.5 מ&quot;מ טריס, 12.5 מ&quot;מ CaCl 2, 6.25 מ&quot;מ DTT, ו -5 PAD4 מיקרומטר (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ&quot;ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג 2 96-גם צלחות וpipet 160 μl של התמיסה B ל# סכום של בארות (# בארות יהיו תלויים בכמה נקודות זמן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת 96-היטב אחד על 37 מעלות צלזיוס. דגירה את הצלחת גם 96 האחרות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פְּעִיםette 40 μl של פתרון לכל הבארות בשני 96-גם צלחות ומייד פיפטה 10 μl של הפתרון C לתוך בארות t = 0 דקות. להמשיך ולהוסיף 10 μl של הפתרון C בנקודות זמן ספציפי, עד שכל הבארות כבר הרווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר. </li></ol> 6. PAD4 העיכוב Assay ב RT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ- 10 מניות מ&quot;מ ZRcoum, להכין פתרון 83 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון ZRcoum 83 מיקרומטר זה יהיה א הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את CL-amidine (MW 424.8 g / mol) ולהכין פתרון מניות 100 מיקרומטר. זה יהיה פתרון ב &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר של 100 מ&quot;מ NaCl, 100 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ TCEP, 0.02% Triton X-100, וPAD4 8 מיקרומטר (pH = 8.0). זה יהיה הפתרון ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר של 100 מ&quot;מ NaCl, 100 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ TCEP, ושל 0.02% טריטון X-100 (pH = 8.0). ההוא יהיה הפתרון ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ&quot;ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון E. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג צלחת 384 גם ולייעד בארות לביקורת (לא PAD4), בארות (+ PAD4), ובארות עיכוב (PAD4 + CL-amidine). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 25 μl של הפתרון C לבארות ופיפטה 25 μl של הפתרון D לתוך בארות שליטה. לאפשר חיץ עם / בלי PAD4 כדי לדגור בבארות עבור 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של התמיסה B לתוך בארות עיכוב דגירה במשך 20 דקות ב RTE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 μl פיפטה של ​​פתרון לכל בארות דגירה במשך 45 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של פתרון ה &#39;לכל הבארות. לדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר. </li></ol> 7. תא גולמי lysate Assayב RT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קצירת תאים מPAD4 צמיחת L 1, תאים גלולים ב 10 מיליליטר של 50 מ&quot;מ טריס, 50 מ&quot;מ NaCl, 0.1 פלואוריד מ&quot;מ phenylmethylsulfonyl (PMSF, MW 174.94 g / mol) וdithiothreitol 1 מ&quot;מ (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים באמצעות sonication במשך 15 דקות ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate התא ב20,000 XG במשך 20 דקות ב 0 מעלות צלזיוס. להתרכז supernatant ברור למחצית הנפח על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 4,000 4 ° C באמצעות 100k MW צינורות צנטריפוגה חתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ- 10 מניות מ&quot;מ ZRcoum, להכין פתרון 250 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון 250 מיקרומטר ZRcoum זה יהיה א הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר של 100 מ&quot;מ NaCl, 100 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ CaCl 2, ו -2 מ&quot;מ TCEP (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ&quot;ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג צלחת 384 גם שחורה ועיצובאכלתי בארות לביקורת (לא lysate תא) ובארות (+ lysate תא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה של ​​התמיסה B 100 μl לכל הבארות ו -60 μl פיפטה של ​​lysate תא לתוך בארות. דגירה של 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 μl פיפטה של ​​פתרון לכל בארות דגירה במשך 45 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של הפתרון C לכל הבארות. לדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+protein+language+using+proteomics.">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li><li>Sims, R. J., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications.">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).</li><li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+to+study+genes+and+genomes.">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405, 837-846 (2000).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription.">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447, 407-412 (2007).</li><li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+switches+and+modification+cassettes+in+histone+biology+and+beyond.">Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond.</a> Nature. 425, 475-479 (2003).</li><li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications:+lessons+from+professional+pocket+pickers.">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li><li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+protein+modifications+with+interaction+domains.">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403, 41-45 (2000).</li><li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD,+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes:+genes,+features+and+involvement+in+disease.">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).</li><li>Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullination:+a+posttranslational+modification+in+health+and+disease.">Citrullination: a posttranslational modification in health and disease.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).</li><li>Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+of+peptidylarginine+deiminase+V+and+histone+deimination+in+granulocytes.">Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).</li><li>Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+of+histone+H2A+and+H4+at+arginine+3+in+HL-60+granulocytes.">Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes.</a> Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).</li><li>Kearney, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+characterization+of+protein+arginine+deiminase+4:+a+transcriptional+corepressor+implicated+in+the+onset+and+progression+of+rheumatoid+arthritis.">Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis.</a> Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).</li><li>Christophorou, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin.">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).</li><li>Wang, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminases+in+citrullination,+gene+regulation,+health+and+pathogenesis.">Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).</li><li>Trouw, L. A., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+serological+gap:+promising+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+rheumatoid+arthritis.">Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis.</a> Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).</li><li>Chang, X., Fang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PADI4+and+tumourigenesis.">PADI4 and tumourigenesis.</a> Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).</li><li>Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+peptidylarginine+deiminase+type+4+in+ovarian+tumors.">Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors.</a> Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).</li><li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+pathogenic+role+of+PADI4+in+oesophageal+cancer.">Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer.</a> Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+PADI4+cooperates+with+Elk-1+to+activate+c-Fos+expression+in+breast+cancer+cells.">Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li><li>Tanikawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+histone+modification+and+chromatin+structure+by+the+p53-PADI4+pathway.">Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway.</a> Nat. Commun. 3, 676 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest.">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li><li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4+(PAD4):+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential.">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4.">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+peptidylarginine+deiminase+(PAD)+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity.">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li><li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

מספר גדול של חלבונים יונקים הם שונה במידה רבה על ידי הפעולה של אנזימים הבאים הסינתזה של חלבונים על ידי הריבוזום. שינויים אלה לאחר translational (PTMs) יכולים להגדיל באופן משמעותי את המגוון הפונקציונלי של proteome על ידי שינוי הגודל, מטען, מבנה, ומדינת oligomerization (בין תכונות אחרות) של חלבוני 1-3. כתוצאה מכך, השינוי במבנה חלבון יכול להוביל לתוצאות פיסיולוגיות, כגון פירוק חלבונים, התמיינות תאים, איתות, אפנון בביטוי גנים, ואינטראקציות בין חלבונים. בעוד שינויים אלה נפוצים באחוז גדול של כל החלבונים האנושיים, המסוף מסתיים בחלבוני היסטון לעבור מספר גבוה מרגיל של שינויים קוולנטיים 4. חלבוני היסטון הם משפחה של חלבונים מבניים המאפשרים העיבוי של הדנ&quot;א הגנומי. שינויים קוולנטיים של זנבות היסטון לא מובנים מתבצעים ומוסדרים על ידי סרייהשל אנזימים שיכולים לזרז את השינוי קוולנטיים של שאריות (סופרים), להפוך את אותם שינויים (מחקים), ולהבחין בין השינויים שהוטבעו על זנבות היסטון (קוראים) 5-7. למעשה, רוב PTMs הידוע ניתן לצפות בקטע קצר זה של היסטון כולל מתילציה, זירחון, acetylation, sumoylation, ubiquitination, וcitrullination 8. Citrullination כולל ההמרה של peptidyl-ארגינין לRNA t הלא peptidyl-Citrulline המקודד (איור 1 א). החלבונים, אחראים לנטרול שרשרת צד זה, הנם החלק מPAD (עמ &#39;eptide rginine ד eiminase) משפחת חלבונים, אשר כולם אנזימי סידן תלוי. 9,10. עד כה, חמישה בני משפחת PAD תוארו (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, וPAD6). כל אחד ממשפחה זו מופיעה למקד חלבונים תאיים שונים ומציג גם חדפרופילי הפצת רקמת que. PAD4 הוא החבר היחיד של משפחת חלבון זה ידוע להיות מקומי בתוך הגרעין באמצעות רצף לוקליזציה גרעיני 11. בהתאם לכך, זה הוכח deiminate מספר יעדי גרעין, כוללים שרשרות צד ארגינין על זנבות N- מסוף שאריות ארגינין H2A ההיסטונים 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, וH3R26) וH4 (H4R3) 12, 13. בעוד כל אחד מisozymes PAD יש פונקציות פיסיולוגיות ספציפיות וקריטיות, PAD4 קיבל הרבה יותר תשומת לב בשל תפקידה במספר התהליכים האנושיים בשני תאים חולים ובריאים. לאחרונה, PAD4 הוצג להיות חבר ברשת תעתיק pluripotency 14. שני רמות ביטוי PAD4 והפעילות הוצגו להיות גבוהות במצבי pluripotent תכנות מחדש וקרקע מדינה בעכברים. על ידי שליטה על הרגולציה של גנים בתאי גזע, PAD4 עשוי לשמור תפקיד מרכזי ביעילות תכנות מחדש של תאים. PAD4 גם היה מעורב בהיווצרות מלכודות תאי נויטרופילים, שעל הכריכה של פתוגנים לאפשר פינוי המערכת שלהם. Hypercitrullination של חלבוני היסטון ידי PAD4 גורם decondensation של הכרומטין, המשמש כחומר הבסיס לאנקפסולציה של חיידקים פתוגניים במלכודת תאית, ובכך לבלום את זיהומים חיידקיים 15,16. בנוסף, PAD4 כבר נמצא לשחק תפקיד פעיל במספר המחלות בבני אדם. זה הוכח בעבר שביטוי חריג של PAD4 קשור עם תחילת וחומרת דלקת מפרקים שגרונית, מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת נפוצה 17. למעשה, הנוכחות של נוגדני חלבון אנטי-citrullinated היא אחד מהסמנים דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים אמינות והמקיפים ביותר של דלקת מפרקים שגרונית 18. כמו כן, פעילות PAD4 dysregulated לאחרונה נצפתה במספר סוגים של סרטן אנושי כוללים השחלות, שד, ריאות,סרטן הוושט ד 19-22. הקשר בין PAD4 והסרטן הוכח להיות מתווך דרך אונקוגן ELK1 או באמצעות החלבון המדכא גידולי p53 22,23 ועבודה קודמת הציעה כי PAD4 יכול להיות יעד נגד סרטן רומן טיפולי 17,24,25. כהוכחה למחקר עיקרון, הדלדול של PAD4 באמצעות shRNA בשורת תאי סרטן המעי הגס HCT116 התגלה כמספיק לגרימת אפופטוזיס ומחזור תא מעצר 26. מעכב PAD4 בלתי הפיך שפותח לאחרונה הביא להפחתת שבעים אחוז במסת גידול בעכברי 27. די להפליא, עיכוב PAD4 הופיע לפעול כטיפול ממוקד שגרם להריגתם בררני של תאים סרטניים מבלי לפגוע בתאי untransformed. השימוש במולקולות קטנות כדי לכבות את הפונקציה של PAD4 עשויים להיות אסטרטגיה חדשה וחזקה למקד תאים סרטניים או כדי להגדיל chemotherapeutics הסרטן קיים 28. לרוע המזל, ת.ד.מעכב PAD4 הפיך אוהל שעדיין לא התגלה. מספר המעכבים קוולנטיים פותחו באמצעות לורו / ידית imidine fluoro המחקה את מצע ארגינין 27,29,30 והוכיחה להיות כלים מעשיים להבנת תפקידו של PAD4 בשני תאי מצב בריאים וחולים. עם זאת, מולקולות אלה כל הרפידות הפעילים עם עוצמה דומה לעכב. לכן, הצורך בassay קליל שמדווח על הפעילות של PAD4 הוא קריטי. עד כה, PAD4 מבחני תוארו המקשרים השחרור של אמוניה מהתגובה לקריאת colorimetric 31, לנצל אנלוגי מצע chloroamidine שכותרתו fluorescently עבור assay קיטוב הקרינה 32, להסתמך על התגובה בסיוע החומצה בין glyoxal וCitrulline 33, ו כמה פעילות PAD4 לקרינת dequenching צעד 34. מבין אלה, רק אסטרטגית haloacetamidine משנה קוולנטיים הוכיחה להיות תואם עם scre תפוקה גבוההפלטפורמות ening 32,35,36. אנו מתארים assay המבוסס הקרינה קלילה שאמינים מודד את הפעילות של PAD4. Assay, אשר מציג יחס חזק אות לרעש, מהירות של ניתוח, ואת חוסן של מדידה, יש את הפוטנציאל לגלות מעכב PAD4 באמת חזק ובררני.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.amresco-inc.com/&quot;&gt;http://www.amresco-inc.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/&quot;&gt;http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/&quot;&gt;http://www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>All Buffer Salts&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td></tr><tr><td>Protino Glutathione (GSH) agarose&amp;nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Store at 4 &amp;deg;C; http://www.mn-net.com/</td></tr><tr><td>Chloroamidine&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemical&amp;nbsp;</td><td>10599</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td><td></td><td></td><td>Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.tecan.com/&quot;&gt;www.tecan.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.perkinelmer.com/&quot;&gt;http://www.perkinelmer.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

בתחילה, זה היה הוכיח כי ZRcoum יכול לדווח על הפעילות של PAD4 בפורמט צלחת 96-היטב. ולס הודגרו עם ZRcoum המצע ובנוכחות / ההיעדרות של PAD4. בעקבות תקופת דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, הקרינה נמדדה עם 340/40 - 475/15 ננומטר מסנן (איור 2 א). כצפוי, רמות הקרינה נשארו?...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog at JoVE.com

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

ניטור קרינה מבוססת פעילות PAD4 באמצעות אנלוגי מצע פרו-הקרינה

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

fluorescence-based-monitoring-pad4-activity-via-pro-fluorescence

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.9K Views.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Video: Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Bioengineering

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Biochemistry

ניתוח cAMP עם cADDis: סינון חד-תאי עד בתפוקה גבוהה

Real-Time cAMP Dynamics in Live Cells Using the Fluorescent cAMP Difference Detector In Situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is created from a circularly permuted fluorescent protein linked to the hinge region of Epac2. This creates a single fluorophore biosensor that displays either increased or decreased fluorescence upon binding of cAMP. The biosensor exists in red and green upward versions, as well as green downward versions, and several red and green versions targeted to subcellular locations. To illustrate the effectiveness of the biosensor, the green downward version, which decreases in fluorescence upon cAMP binding, was used. Two protocols using this sensor are demonstrated: one utilizing a 96-well plate reading spectrophotometer&#160;compatible with high-throughput screening and another utilizing single-cell imaging on a fluorescent microscope. On the plate reader, HEK-293 cells cultured in 96-well plates were stimulated with 10 &#181;M forskolin or 10 nM isoproterenol, which induced rapid and large decreases in fluorescence in the green downward version. The biosensor was used to measure cAMP levels in individual human airway smooth muscle (HASM) cells monitored under a fluorescent microscope. The green downward biosensor displayed similar responses to populations of cells when stimulated with forskolin or isoproterenol. This single-cell assay allows visualization of the biosensor location at 20x and 40x magnification. Thus, this cAMP biosensor is sensitive and flexible, allowing real-time measurement of cAMP in both immortalized and primary cells, and with single cells or populations of cells. These attributes make cADDis a valuable tool for studying cAMP signaling dynamics in living cells.

מחבר זרקור: קידום זיהוי cAMP בזמן אמת בתאים באמצעות cADDis Biosensor

The protocol presented in this study illustrates the effectiveness of the cAMP Difference Detector In Situ in measuring cAMP through two methods. One method utilizes a 96-well plate reading spectrophotometer with HEK-293 cells. The other method demonstrates individual HASM cells under a fluorescent microscope.

דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Biology

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

ניטור קרינה מבוססת פעילות PAD4 באמצעות אנלוגי מצע פרו-הקרינה

Summary

Explore More Videos

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר