Name: fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog at JoVE.com

This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4変換、発現、および精製<ol><li> PAD4の形質転換のために、化学的にコンピテントにPAD4のGST融合を含むのpGEXプラスミドを変換する以下の手順を使用して、タンパク質発現のための大腸菌 （BL21（DE3））細胞。化学的にコンピ（塩化カルシウム）を準備E.大腸菌 （BL21（DE3））細胞を標準的なプロトコルに従って。 <ol><li>氷上で予め調製した化学的にコンピテントなBL21（DE3）細胞を、50μlの融解し、5mlの培養チューブにPAD4遺伝子を含有するpGEXプラスミド1μlを混合する。優しく2分ごとに振とうしながら10分間氷上で混合をインキュベートする。 </li><li>熱は、40秒間42℃の水浴中で混合物を配置することによって細胞にショックを与える。すぐに細胞が回復できるように2分間背中氷上で細胞プラスミド混合物を配置します。混合物に滅菌LBブロス1ミリリットルを加え、1分間氷上に置きます。 </li><li> 1のために250rpmで振盪、37℃で細胞を熱ショックをインキュベートhrで。アンピシリン耐性寒天プレート上に形質転換された細胞のピペット75μlの、15時間、37℃でインキュベートする。 4℃で保存プレート。 </li></ol></li><li> PAD4式。 <ol><li> 1xのアンピシリンを含むLB 5mlにアンピシリン寒​​天プレートと場所からのBL21（DE3）細胞の1コロニーを採取。インキュベーター内の場所、そして37℃でO / Nを振る。 </li><li> 1Xアンピシリン三水和物を含む滅菌LB（MW 403.45グラム/モル）1L中にLB（スターター）の5ミリリットルを転送します。 37℃の振盪インキュベーター内の場所の成長。成長のOD 600を監視します。成長は600 0.3のODに達したときに、インキュベーターを振って16℃に成長を移動します。 </li><li> OD 600が 0.6 に達したら、0.3mMので細胞を誘導する（IPTG、MW 238.30グラム/モル）isopropylthiagalactoside。細胞は16℃で15時間振とうすることができます。 </li><li> 0℃で20分間、4,000×gでの遠心分離により細胞を回収する。 -80℃で上清とストアペレットを捨てる。 </li></ol></li><li> PAD4精製<ol><li>再懸 ​​濁50mMのNaCl（MW 58.44グラム/モル）の緩衝液中で細胞をBL21（DE3）で発現さPAD4を含むペレットを300mMののNaH 2 PO 4（MW 119.98グラム/モル）、10mMのイミダゾール（MW 68.077グラム/モル）、0.1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF、MW 174.94グラム/モル）及び1mMジチオスレイトール（DTT、154.25グラム/モル）でpH = 8.0。 </li><li> 4℃で15分間、超音波処理を介した溶解細胞。以下、超音波処理、0℃で20分間遠心2万×gで細胞溶解物。捨て、上清を保存します。バッチをRTで30分間グルタチオン（GSH）アガロースビーズと上清。 </li><li> GSTビーズ/重力介してカラムから上澄みを排出します。 RTで1×PBS（リン酸緩衝生理食塩水、pH値= 8.0）の4×25 mlのビーズを洗ってください。 </li><li>溶出PAD4 10mLで2回溶出緩衝液を用いて、50mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基、MW 121.14グラム/モル）、10mMグルタチオン（GSH、MW 307.32グラム/モル）でpH = 8.0。 </li><li> 100kのMWカット-Oを使用してPAD4を集中ffの遠心管遠心分離を4℃で20分間4,000×gで。 -80℃でアリコート1.0 mlのマイクロチューブ中の200μlのボリュームへのタンパク質や店舗。 </li></ol></li></ol>バッファ2.準備株価ソリューション<ol><li>塩化ナトリウム（NaCl、MW 58.44グラム/モル）を秤量し、2 M溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。 </li><li>トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基、MW 121.14グラム/モル）秤量し、2M溶液のpH = 8.0を準備します。透明になるまで溶液を混合。 </li><li>塩化カルシウム二水和物（のCaCl 2·2H 2 O、MW 147.01グラム/モル）を秤量し、500mMの溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。 </li><li>トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP、MW 250.19グラム/モル）を秤量し、200mMの溶液を調製する。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。 </li><li>ジチオスレイトール（DTT、MW 154.25グラム/モル）秤量し、1M溶液を調製。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。 </li><li>準備するトリトンX-100の0.5％溶液。 </li><li>エチレンジアミン四酢酸（EDTA、MW 292.24グラム/モル）を秤量し、100mMの溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。 </li><li> Z- Arg- Arg- 7-アミド - 、4-メチルクマリン塩酸塩（ZRcoum、MW 621.69グラム/モル）を秤量し、ジメチルスルホキシド（DMSO）中の10mM溶液を調製する。 </li></ol> 37℃で3 PAD4アッセイ<ol><li> 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの125μMの溶液を調製。この125μMZRcoum溶液は溶液Aになります</li><li> 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、6.25 mMのDTT、および5μMのPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります</li><li> 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、および6.25 mMのDTT（pH値= 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります</li><li> （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。透明になるまで溶液を混合し、-20℃で保存する℃である。これにより、ソリューションD.なります</li><li> 96ウェルプレートを入手して、コントロールのウェル数（無PAD4）を指定し、試験ウェル（+ PAD4）。 </li><li>ピペット160試験ウェルへの溶液Bμlのピペット溶液C160μlの対照ウェルへ。 37℃で15分間インキュベートする。 </li><li>ピペット40のすべてのウェルにA液μlの45分間37℃でインキュベートする。 </li><li>試験ウェルの対照ウェルと半分の半分にのdH 2 Oのピペットを10μl。対照ウェルと試験制御、ピペット37℃で10分間インキュベートするソリューションD.10μlの他の半分。 </li><li> 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。 </li></ol> RTで4 PAD4アッセイ<ol><li> 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoum50μMの溶液を調製。この50μMのZRcoumソリューション、ソリューション、Aになります</li><li> 100 mMのNaをバッファを準備Clを、100mMのトリス、20mMのCaCl 2を 、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100、および8μMPAD4液（pH = 8.0）。これは溶液Bになります</li><li> 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります</li><li> （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これにより、ソリューションD.なります</li><li> 384ウェルプレートを取得せず、コントロールのウエルを指定する（無PAD4）と試験ウェル（+ PAD4）。 </li><li>ピペット試験ウェルとピペット対照ウェルへの溶液Cを25μlにB液25μlの。 PAD4なし/付きバッファは室温で20分間ウェル中でインキュベートすることができます。 </li><li>すべてのウェルに溶液Cのピペットを25μlとRTで45分間インキュベートする。 </li><li>試験ウェルの対照ウェルと半分の半分にのdH 2 Oのピペットを10μl。対照ウェルと試験のコントロールの他の半分に、pipett室温で10分間ソリューションD.インキュベートの電子10μlの。 </li><li> 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。 </li></ol> 37℃およびRTで5 PAD4タイムコースアッセイ<ol><li> 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの125μMの溶液を調製。この125μMZRcoum溶液は溶液Aになります</li><li> 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、6.25 mMのDTT、および5μMのPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります</li><li> （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これは溶液Cになります</li><li> （どのように多くの時間点に依存することになるのウェル＃）2 96ウェルプレートおよびピペットのウェル＃量にB液160μlのを取得します。 </li><li> 37℃で1枚の96ウェルプレートをインキュベートする。 RTで、他の96ウェルプレートをインキュベートする。 </li><li>ピップ両方の96ウェルプレート内のすべてのウェルにエットA液40μlのを、すぐにT = 0分ウェルに溶液Cを10μlピペット。すべてのウェルが急冷されるまで、特定の時点で溶液C10μlの追加を続けます。 </li><li> 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。 </li></ol> RTで6 PAD4阻害アッセイ<ol><li> 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの83μM溶液を調製。この83100μMのZRcoum溶液は溶液Aになります</li><li>のCl - アミジンを秤量（MW 424.8グラム/モル）および100μMストック溶液を準備します。これは溶液Bになります</li><li> 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100、および8μMPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります</li><li> 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100液（pH = 8.0）のバッファを準備します。目ソリューションD.なりますです</li><li> （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これにより、ソリューション、Eになります</li><li> 384ウェルプレートを入手して、コントロールのウェル（なしPAD4）、試験ウェル（+ PAD4）、および阻害ウェル（PAD4 +のCl - アミジン）を指定。 </li><li>ピペット25試験ウェルへの溶液Cμlのピペット対照ウェルへの溶液D25μlの。 PAD4なし/付きバッファは室温で20分間ウェル中でインキュベートすることができます。 </li><li>ピペット10阻害ウェルに溶液BμlのRTEで20分間インキュベートする。 </li><li>すべてのウェルへの溶液Aのピペットを15μlとRTで45分間インキュベートする。 </li><li>ピペットすべてのウェルへの溶液Eを10μl。室温で10分間インキュベートする。 </li><li> 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。 </li></ol> 7.粗細胞溶解物アッセイRTで<ol><li> 50mMトリス、50mMのNaCl、0.1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF、MW 174.94グラム/モル）及び1mMジチオスレイトール（DTT、154.25グラム/モル）、pHを、10mlのPAD4 1 Lの成長から再懸濁細胞を細胞を回収した後= 8.0。 </li><li> 4℃で15分間、超音波処理を介した溶解細胞。遠心0℃で20分間、20,000×gで細胞溶解物。 100kのMWカットオフ遠心チューブを用いて4℃で4,000rpmでの遠心分離により半分の容量に透明な上清を濃縮する。 </li><li> 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの250μMの溶液を調製。この250μMのZRcoum溶液は溶液Aになります</li><li> 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、および2mM TCEP（pH値= 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります</li><li> （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これは溶液Cになります</li><li>黒色の384ウェルプレートデザインを得るコントロールのウェル（無細胞溶解物）と試験ウェル（+細胞溶解物）を食べた。 </li><li>ピペット試験ウェルへのすべてのウェルおよび細胞溶解物の60μlのピペットにB液を100μl。 RTで20分間インキュベートする。 </li><li>すべてのウェルへの溶液Aのピペットを40μlとRTで45分間インキュベートする。 </li><li>ピペットをすべてのウェルに溶液Cを10μl。室温で10分間インキュベートする。 </li><li> 345 nmの励起波長および465nmの発光波長でマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。 </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

哺乳類のタンパク質の大多数は重くリボソームによるタンパク質の合成以下の酵素の作用によって修飾される。これらの翻訳後修飾（PTMは）大幅にタンパク質1-3（他の機能の中で）、サイズ、電荷、構造、オリゴマー化状態を変化させることにより、プロテオームの機能的多様性を増加させることができる。その結果、タンパク質構造の変化は、タンパク質分解、細胞分化、シグナル伝達、遺伝子発現の調節、およびタンパク質 - タンパク質相互作用のような生理学的結果をもたらすことができる。これらの変更は、すべてのヒトタンパク質の大きな割合で普及している一方で、端末はヒストンタンパク質に終了共有結合修飾4の異常に高い数値を受ける。ヒストンタンパク質は、ゲノムDNAの凝縮を容易にする構造タンパク質のファミリーである。非構造化ヒストン尾部の共有結合修飾は、セリエAによって行われ、規制されている、残基（作家）の共有結合的修飾を触媒する同じ変更（消しゴム）を逆転し、変更を区別できる酵素のsはヒストン尾（読者）5-7上に刻印されている。実際には、既知のPTMのほとんどは、メチル化、リン酸化、アセチル化、SUMO化、ユビキチン化、およびシトルリン8を含むヒストンのこの短いセグメント内に観察することができる。 シトルリンは、ペプチジル-シトルリン（ 図1A）符号化された非トン RNAへのプチアルギニンの変換を含む。この側鎖の中和を担うタンパク質は、カルシウム依存性酵素であるその全てがPAD た（p eptide A rginine dの eiminase）タンパク質ファミリーのメンバーである。9,10。現在までに、PADのファミリーの5メンバーは（PAD1、PAD2、PAD3、PAD4、およびPAD6）に記載されている。このファミリーの各メンバーは、個別の細胞タンパク質を標的とするように表示され、またUNIを表示queの組織分布プロファイル。 PAD4は、核局在化配列11を介して核内に局在することが知られているこのタンパク質ファミリーの唯一のメンバーである。したがって、H3（H3R2、H3R17、およびH3R26）及びH4（H4R3）、ヒストンH2Aのアルギニン残基3（H2R3）のN末端 ​​尾部におけるアルギニンの側鎖を含む核標的の数を、deiminateすることが示されている12、 13。 PADアイソザイムのそれぞれが具体的かつ重要な生理学的機能を有するが、PAD4は、罹患および正常細胞の両方におけるヒトのプロセス数におけるその役割にかなり注目されている。最近では、PAD4は、多能性の転写ネットワーク14のメンバであることが示された。両方PAD4の発現レベルおよび活性は、マウスにおける再プログラミングと基底状態の多能性状態の間に上昇することが示された。幹細胞の遺伝子の調節を制御することにより、PAD4は細胞リプログラミング効率の極めて重要な役割を保持することができる。 PAD4も関与している病原体の結合時に、そのシステムのクリアランスを有効に好中球細胞外トラップの形成。 PAD4によるヒストンタンパク質のhypercitrullinationは、このような細菌感染15,16を退ける、細胞外トラップによる病原性細菌のカプセル化のための基材として機能するクロマチンの脱凝縮を誘導する。 さらに、PAD4は、多くのヒト疾患において積極的な役割を果たすことが見出されている。これは、以前にPAD4の異常な発現は、関節リウマチの発症および重症度と関連していることが示されており、アルツハイマー病、パーキンソン病、および多発性硬化症17。実際、抗シトルリン化タンパク質抗体の存在が関節リウマチ18の最も信頼性の決定的な診断および予後バイオマーカーの1つである。同様に、調節不全PAD4活性は最近、卵巣、乳房、肺、などの多くのヒト癌において観察されているD食道癌19-22。 PAD4と癌との関連は、p53腫瘍抑制タンパク質22,23 ELK1癌遺伝子を介して、またはを介して媒介されることが示されており、以前の研究は、PAD4は、新規な抗癌治療のターゲット17,24,25かもしれないことを示唆している。原理研究の証明として、結腸直腸癌細胞株HCT116におけるshRNAを介したPAD4の枯渇は、アポトーシスおよび細胞周期停止26を誘導するために十分であることが判明した。最近開発された不可逆的なPAD4阻害剤は、マウス27の腫瘍塊における七十%削減につながった。かなり著しく、PAD4阻害は非形質転換細胞を温存しながら、癌細胞の選択的殺傷をもたらした標的療法として機能するように見えた。 PAD4の機能をオフにする小分子の使用は、癌細胞を標的とするか、または既存の癌化学療法剤28を補強するための強力な新しい戦略になるかもしれない。残念ながら、PO10トン可逆PAD4阻害剤は、まだ発見されなければならない。共有結合性阻害剤の数は、アルギニン基板27,29,30を模倣し、健康および疾患状態の細胞の両方においてPAD4の役割を理解する上で実用的なツールであることが証明されているクロロ/フルオロイミジンハンドルを使用して開発されている。しかし、これらの分子は、同様の効力を有する活性のPADのすべてを阻害する。したがって、PAD4の活動について報告し、容易なアッセイの必要性は非常に重要です。今日まで、PAD4アッセイは、比色読み出し31に対する反応からのアンモニアの放出をリンクすることが記載されており、蛍光偏光アッセイ32用の蛍光標識chloroamidine基質類似体を利用し、グリオキサール及びシトルリン33との間の酸アシスト反応に依存して、及び夫婦ステップ34を脱消光蛍光にPAD4活動。これらのうち、唯一の共有結合の修飾haloacetamidine戦略は、ハイスループットSCREと互換性があることが証明されている締付プラットフォーム32,35,36。私たちは確実にPAD4の活性を測定する簡便な蛍光ベースのアッセイを記述する。強力な信号対雑音比、分析速度、および測定のロバスト性を表示するアッセイは、真の強力かつ選択的なPAD4阻害剤を発見する可能性がある。

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.amresco-inc.com/&quot;&gt;http://www.amresco-inc.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/&quot;&gt;http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/&quot;&gt;http://www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>All Buffer Salts&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td></tr><tr><td>Protino Glutathione (GSH) agarose&amp;nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Store at 4 &amp;deg;C; http://www.mn-net.com/</td></tr><tr><td>Chloroamidine&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemical&amp;nbsp;</td><td>10599</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td><td></td><td></td><td>Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.tecan.com/&quot;&gt;www.tecan.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.perkinelmer.com/&quot;&gt;http://www.perkinelmer.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

最初に、それはZRcoum 96ウェルプレートフォーマットでPAD4の活性に報告することができることが実証された。ウェルを基板ZRcoumとし、PAD4の存在/非存在下でインキュベートした。 475/15 nmのフィルタ（ 図2A）、 - 37℃で45分間のインキュベーション時間の後、蛍光を340/40で測定した。予想されたように、蛍光レベルはZRcoum（またはシトルリン<stron...

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Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

プロ蛍光基質アナログを経由してPAD4活性の蛍光ベースの監視

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

fluorescence-based-monitoring-pad4-activity-via-pro-fluorescence

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.8K ビュー.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

ビデオ: Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and biochemically verified was opsin, the apoprotein of the photoreceptor rhodopsin. Rhodopsin is a G protein-coupled receptor localized in rod photoreceptor disc membranes of the retina where it is responsible for the perception of light. Rhodopsin&#39;s scramblase activity does not depend on its ligand 11-cis-retinal, i.e., the apoprotein opsin is also active as a scramblase. Although constitutive and regulated phospholipid scrambling play an important role in cell physiology, only a few phospholipid scramblases have been identified so far besides opsin. Here we describe a fluorescence-based assay of opsin&#39;s scramblase activity. Opsin is reconstituted into large unilamellar liposomes composed of phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and a trace quantity of fluorescent NBD-labeled PC (1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine). Scramblase activity is determined by measuring the extent to which NBD-PC molecules located in the inner leaflet of the vesicle are able to access the outer leaflet where their fluorescence is chemically eliminated by a reducing agent that cannot cross the membrane. The methods we describe have general applicability and can be used to identify and characterize scramblase activities of other membrane proteins.

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

リン脂質スクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイ

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

生化学

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

生物学

<meta charset="utf8"></head><body>内皮細胞におけるプロテアーゼ活性化受容体リガンドの研究

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding dyes and imaging instruments that can measure fluorescent emissions from up to 1,536 wells simultaneously. However, these instruments are much more expensive and can be challenging to maintain relative to widely available plate readers that scan wells individually. Described here is an optimized plate reader assay for use with an endothelial cell line (EA.hy926) to measure the protease-activated receptor (PAR)-driven activation of G&#945;q signaling and subsequent calcium mobilization using the calcium-binding dye Fluo-4. This assay has been used to characterize a range of PAR ligands, including the allosteric PAR1-targeting anti-inflammatory "parmodulin" ligands identified in the Dockendorff lab. This protocol obviates the need for an automated liquid handler and permits the medium-throughput screening of PAR ligands in 96-well plates and should be applicable to the study of other receptors that initiate calcium mobilization.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:炎症制御のためのプロテアーゼ活性化受容体を標的とするパルモジュリンの開発

An improved protocol for a calcium mobilization assay with endothelial cells, used to identify ligands of protease-activated receptors (PARs), has been developed. The new protocol reduces total assay time by 90-120 min and yields reproducible concentration-response curves.

プレートリーダーを用いたカルシウム動員アッセイによるプロテアーゼ活性化受容体のモジュレーターの特性評価(英語)

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

プロ蛍光基質アナログを経由してPAD4活性の蛍光ベースの監視

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リン脂質スクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイ

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

プレートリーダーを用いたカルシウム動員アッセイによるプロテアーゼ活性化受容体のモジュレーターの特性評価(英語)

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