This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4変換、発現、および精製<ol><li> PAD4の形質転換のために、化学的にコンピテントにPAD4のGST融合を含むのpGEXプラスミドを変換する以下の手順を使用して、タンパク質発現のための大腸菌 （BL21（DE3））細胞。化学的にコンピ（塩化カルシウム）を準備E.大腸菌 （BL21（DE3））細胞を標準的なプロトコルに従って。 <ol><li>氷上で予め調製した化学的にコンピテントなBL21（DE3）細胞を、50μlの融解し、5mlの培養チューブにPAD4遺伝子を含有するpGEXプラスミド1μlを混合する。優しく2分ごとに振とうしながら10分間氷上で混合をインキュベートする。 </li><li>熱は、40秒間42℃の水浴中で混合物を配置することによって細胞にショックを与える。すぐに細胞が回復できるように2分間背中氷上で細胞プラスミド混合物を配置します。混合物に滅菌LBブロス1ミリリットルを加え、1分間氷上に置きます。 </li><li> 1のために250rpmで振盪、37℃で細胞を熱ショックをインキュベートhrで。アンピシリン耐性寒天プレート上に形質転換された細胞のピペット75μlの、15時間、37℃でインキュベートする。 4℃で保存プレート。 </li></ol></li><li> PAD4式。 <ol><li> 1xのアンピシリンを含むLB 5mlにアンピシリン寒​​天プレートと場所からのBL21（DE3）細胞の1コロニーを採取。インキュベーター内の場所、そして37℃でO / Nを振る。 </li><li> 1Xアンピシリン三水和物を含む滅菌LB（MW 403.45グラム/モル）1L中にLB（スターター）の5ミリリットルを転送します。 37℃の振盪インキュベーター内の場所の成長。成長のOD 600を監視します。成長は600 0.3のODに達したときに、インキュベーターを振って16℃に成長を移動します。 </li><li> OD 600が 0.6 に達したら、0.3mMので細胞を誘導する（IPTG、MW 238.30グラム/モル）isopropylthiagalactoside。細胞は16℃で15時間振とうすることができます。 </li><li> 0℃で20分間、4,000×gでの遠心分離により細胞を回収する。 -80℃で上清とストアペレットを捨てる。 </li></ol></li><li> PAD4精製<ol><li>再懸 ​​濁50mMのNaCl（MW 58.44グラム/モル）の緩衝液中で細胞をBL21（DE3）で発現さPAD4を含むペレットを300mMののNaH 2 PO 4（MW 119.98グラム/モル）、10mMのイミダゾール（MW 68.077グラム/モル）、0.1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF、MW 174.94グラム/モル）及び1mMジチオスレイトール（DTT、154.25グラム/モル）でpH = 8.0。 </li><li> 4℃で15分間、超音波処理を介した溶解細胞。以下、超音波処理、0℃で20分間遠心2万×gで細胞溶解物。捨て、上清を保存します。バッチをRTで30分間グルタチオン（GSH）アガロースビーズと上清。 </li><li> GSTビーズ/重力介してカラムから上澄みを排出します。 RTで1×PBS（リン酸緩衝生理食塩水、pH値= 8.0）の4×25 mlのビーズを洗ってください。 </li><li>溶出PAD4 10mLで2回溶出緩衝液を用いて、50mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基、MW 121.14グラム/モル）、10mMグルタチオン（GSH、MW 307.32グラム/モル）でpH = 8.0。 </li><li> 100kのMWカット-Oを使用してPAD4を集中ffの遠心管遠心分離を4℃で20分間4,000×gで。 -80℃でアリコート1.0 mlのマイクロチューブ中の200μlのボリュームへのタンパク質や店舗。 </li></ol></li></ol>バッファ2.準備株価ソリューション<ol><li>塩化ナトリウム（NaCl、MW 58.44グラム/モル）を秤量し、2 M溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。 </li><li>トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基、MW 121.14グラム/モル）秤量し、2M溶液のpH = 8.0を準備します。透明になるまで溶液を混合。 </li><li>塩化カルシウム二水和物（のCaCl 2·2H 2 O、MW 147.01グラム/モル）を秤量し、500mMの溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。 </li><li>トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP、MW 250.19グラム/モル）を秤量し、200mMの溶液を調製する。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。 </li><li>ジチオスレイトール（DTT、MW 154.25グラム/モル）秤量し、1M溶液を調製。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。 </li><li>準備するトリトンX-100の0.5％溶液。 </li><li>エチレンジアミン四酢酸（EDTA、MW 292.24グラム/モル）を秤量し、100mMの溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。 </li><li> Z- Arg- Arg- 7-アミド - 、4-メチルクマリン塩酸塩（ZRcoum、MW 621.69グラム/モル）を秤量し、ジメチルスルホキシド（DMSO）中の10mM溶液を調製する。 </li></ol> 37℃で3 PAD4アッセイ<ol><li> 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの125μMの溶液を調製。この125μMZRcoum溶液は溶液Aになります</li><li> 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、6.25 mMのDTT、および5μMのPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります</li><li> 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、および6.25 mMのDTT（pH値= 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります</li><li> （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。透明になるまで溶液を混合し、-20℃で保存する℃である。これにより、ソリューションD.なります</li><li> 96ウェルプレートを入手して、コントロールのウェル数（無PAD4）を指定し、試験ウェル（+ PAD4）。 </li><li>ピペット160試験ウェルへの溶液Bμlのピペット溶液C160μlの対照ウェルへ。 37℃で15分間インキュベートする。 </li><li>ピペット40のすべてのウェルにA液μlの45分間37℃でインキュベートする。 </li><li>試験ウェルの対照ウェルと半分の半分にのdH 2 Oのピペットを10μl。対照ウェルと試験制御、ピペット37℃で10分間インキュベートするソリューションD.10μlの他の半分。 </li><li> 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。 </li></ol> RTで4 PAD4アッセイ<ol><li> 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoum50μMの溶液を調製。この50μMのZRcoumソリューション、ソリューション、Aになります</li><li> 100 mMのNaをバッファを準備Clを、100mMのトリス、20mMのCaCl 2を 、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100、および8μMPAD4液（pH = 8.0）。これは溶液Bになります</li><li> 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります</li><li> （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これにより、ソリューションD.なります</li><li> 384ウェルプレートを取得せず、コントロールのウエルを指定する（無PAD4）と試験ウェル（+ PAD4）。 </li><li>ピペット試験ウェルとピペット対照ウェルへの溶液Cを25μlにB液25μlの。 PAD4なし/付きバッファは室温で20分間ウェル中でインキュベートすることができます。 </li><li>すべてのウェルに溶液Cのピペットを25μlとRTで45分間インキュベートする。 </li><li>試験ウェルの対照ウェルと半分の半分にのdH 2 Oのピペットを10μl。対照ウェルと試験のコントロールの他の半分に、pipett室温で10分間ソリューションD.インキュベートの電子10μlの。 </li><li> 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。 </li></ol> 37℃およびRTで5 PAD4タイムコースアッセイ<ol><li> 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの125μMの溶液を調製。この125μMZRcoum溶液は溶液Aになります</li><li> 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、6.25 mMのDTT、および5μMのPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります</li><li> （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これは溶液Cになります</li><li> （どのように多くの時間点に依存することになるのウェル＃）2 96ウェルプレートおよびピペットのウェル＃量にB液160μlのを取得します。 </li><li> 37℃で1枚の96ウェルプレートをインキュベートする。 RTで、他の96ウェルプレートをインキュベートする。 </li><li>ピップ両方の96ウェルプレート内のすべてのウェルにエットA液40μlのを、すぐにT = 0分ウェルに溶液Cを10μlピペット。すべてのウェルが急冷されるまで、特定の時点で溶液C10μlの追加を続けます。 </li><li> 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。 </li></ol> RTで6 PAD4阻害アッセイ<ol><li> 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの83μM溶液を調製。この83100μMのZRcoum溶液は溶液Aになります</li><li>のCl - アミジンを秤量（MW 424.8グラム/モル）および100μMストック溶液を準備します。これは溶液Bになります</li><li> 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100、および8μMPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります</li><li> 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100液（pH = 8.0）のバッファを準備します。目ソリューションD.なりますです</li><li> （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これにより、ソリューション、Eになります</li><li> 384ウェルプレートを入手して、コントロールのウェル（なしPAD4）、試験ウェル（+ PAD4）、および阻害ウェル（PAD4 +のCl - アミジン）を指定。 </li><li>ピペット25試験ウェルへの溶液Cμlのピペット対照ウェルへの溶液D25μlの。 PAD4なし/付きバッファは室温で20分間ウェル中でインキュベートすることができます。 </li><li>ピペット10阻害ウェルに溶液BμlのRTEで20分間インキュベートする。 </li><li>すべてのウェルへの溶液Aのピペットを15μlとRTで45分間インキュベートする。 </li><li>ピペットすべてのウェルへの溶液Eを10μl。室温で10分間インキュベートする。 </li><li> 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。 </li></ol> 7.粗細胞溶解物アッセイRTで<ol><li> 50mMトリス、50mMのNaCl、0.1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF、MW 174.94グラム/モル）及び1mMジチオスレイトール（DTT、154.25グラム/モル）、pHを、10mlのPAD4 1 Lの成長から再懸濁細胞を細胞を回収した後= 8.0。 </li><li> 4℃で15分間、超音波処理を介した溶解細胞。遠心0℃で20分間、20,000×gで細胞溶解物。 100kのMWカットオフ遠心チューブを用いて4℃で4,000rpmでの遠心分離により半分の容量に透明な上清を濃縮する。 </li><li> 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの250μMの溶液を調製。この250μMのZRcoum溶液は溶液Aになります</li><li> 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、および2mM TCEP（pH値= 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります</li><li> （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これは溶液Cになります</li><li>黒色の384ウェルプレートデザインを得るコントロールのウェル（無細胞溶解物）と試験ウェル（+細胞溶解物）を食べた。 </li><li>ピペット試験ウェルへのすべてのウェルおよび細胞溶解物の60μlのピペットにB液を100μl。 RTで20分間インキュベートする。 </li><li>すべてのウェルへの溶液Aのピペットを40μlとRTで45分間インキュベートする。 </li><li>ピペットをすべてのウェルに溶液Cを10μl。室温で10分間インキュベートする。 </li><li> 345 nmの励起波長および465nmの発光波長でマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。 </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

哺乳類のタンパク質の大多数は重くリボソームによるタンパク質の合成以下の酵素の作用によって修飾される。これらの翻訳後修飾（PTMは）大幅にタンパク質1-3（他の機能の中で）、サイズ、電荷、構造、オリゴマー化状態を変化させることにより、プロテオームの機能的多様性を増加させることができる。その結果、タンパク質構造の変化は、タンパク質分解、細胞分化、シグナル伝達、遺伝子発現の調節、およびタンパク質 - タンパク質相互作用のような生理学的結果をもたらすことができる。これらの変更は、すべてのヒトタンパク質の大きな割合で普及している一方で、端末はヒストンタンパク質に終了共有結合修飾4の異常に高い数値を受ける。ヒストンタンパク質は、ゲノムDNAの凝縮を容易にする構造タンパク質のファミリーである。非構造化ヒストン尾部の共有結合修飾は、セリエAによって行われ、規制されている、残基（作家）の共有結合的修飾を触媒する同じ変更（消しゴム）を逆転し、変更を区別できる酵素のsはヒストン尾（読者）5-7上に刻印されている。実際には、既知のPTMのほとんどは、メチル化、リン酸化、アセチル化、SUMO化、ユビキチン化、およびシトルリン8を含むヒストンのこの短いセグメント内に観察することができる。 シトルリンは、ペプチジル-シトルリン（ 図1A）符号化された非トン RNAへのプチアルギニンの変換を含む。この側鎖の中和を担うタンパク質は、カルシウム依存性酵素であるその全てがPAD た（p eptide A rginine dの eiminase）タンパク質ファミリーのメンバーである。9,10。現在までに、PADのファミリーの5メンバーは（PAD1、PAD2、PAD3、PAD4、およびPAD6）に記載されている。このファミリーの各メンバーは、個別の細胞タンパク質を標的とするように表示され、またUNIを表示queの組織分布プロファイル。 PAD4は、核局在化配列11を介して核内に局在することが知られているこのタンパク質ファミリーの唯一のメンバーである。したがって、H3（H3R2、H3R17、およびH3R26）及びH4（H4R3）、ヒストンH2Aのアルギニン残基3（H2R3）のN末端 ​​尾部におけるアルギニンの側鎖を含む核標的の数を、deiminateすることが示されている12、 13。 PADアイソザイムのそれぞれが具体的かつ重要な生理学的機能を有するが、PAD4は、罹患および正常細胞の両方におけるヒトのプロセス数におけるその役割にかなり注目されている。最近では、PAD4は、多能性の転写ネットワーク14のメンバであることが示された。両方PAD4の発現レベルおよび活性は、マウスにおける再プログラミングと基底状態の多能性状態の間に上昇することが示された。幹細胞の遺伝子の調節を制御することにより、PAD4は細胞リプログラミング効率の極めて重要な役割を保持することができる。 PAD4も関与している病原体の結合時に、そのシステムのクリアランスを有効に好中球細胞外トラップの形成。 PAD4によるヒストンタンパク質のhypercitrullinationは、このような細菌感染15,16を退ける、細胞外トラップによる病原性細菌のカプセル化のための基材として機能するクロマチンの脱凝縮を誘導する。 さらに、PAD4は、多くのヒト疾患において積極的な役割を果たすことが見出されている。これは、以前にPAD4の異常な発現は、関節リウマチの発症および重症度と関連していることが示されており、アルツハイマー病、パーキンソン病、および多発性硬化症17。実際、抗シトルリン化タンパク質抗体の存在が関節リウマチ18の最も信頼性の決定的な診断および予後バイオマーカーの1つである。同様に、調節不全PAD4活性は最近、卵巣、乳房、肺、などの多くのヒト癌において観察されているD食道癌19-22。 PAD4と癌との関連は、p53腫瘍抑制タンパク質22,23 ELK1癌遺伝子を介して、またはを介して媒介されることが示されており、以前の研究は、PAD4は、新規な抗癌治療のターゲット17,24,25かもしれないことを示唆している。原理研究の証明として、結腸直腸癌細胞株HCT116におけるshRNAを介したPAD4の枯渇は、アポトーシスおよび細胞周期停止26を誘導するために十分であることが判明した。最近開発された不可逆的なPAD4阻害剤は、マウス27の腫瘍塊における七十%削減につながった。かなり著しく、PAD4阻害は非形質転換細胞を温存しながら、癌細胞の選択的殺傷をもたらした標的療法として機能するように見えた。 PAD4の機能をオフにする小分子の使用は、癌細胞を標的とするか、または既存の癌化学療法剤28を補強するための強力な新しい戦略になるかもしれない。残念ながら、PO10トン可逆PAD4阻害剤は、まだ発見されなければならない。共有結合性阻害剤の数は、アルギニン基板27,29,30を模倣し、健康および疾患状態の細胞の両方においてPAD4の役割を理解する上で実用的なツールであることが証明されているクロロ/フルオロイミジンハンドルを使用して開発されている。しかし、これらの分子は、同様の効力を有する活性のPADのすべてを阻害する。したがって、PAD4の活動について報告し、容易なアッセイの必要性は非常に重要です。今日まで、PAD4アッセイは、比色読み出し31に対する反応からのアンモニアの放出をリンクすることが記載されており、蛍光偏光アッセイ32用の蛍光標識chloroamidine基質類似体を利用し、グリオキサール及びシトルリン33との間の酸アシスト反応に依存して、及び夫婦ステップ34を脱消光蛍光にPAD4活動。これらのうち、唯一の共有結合の修飾haloacetamidine戦略は、ハイスループットSCREと互換性があることが証明されている締付プラットフォーム32,35,36。私たちは確実にPAD4の活性を測定する簡便な蛍光ベースのアッセイを記述する。強力な信号対雑音比、分析速度、および測定のロバスト性を表示するアッセイは、真の強力かつ選択的なPAD4阻害剤を発見する可能性がある。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="716">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:192px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td>
			<td style="width:123px;">Amresco</td>
			<td style="width:135px;">J106-2KG</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:192px;">Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP902-25&#160;</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:192px;">Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technogolies</td>
			<td>15529-019</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:192px;">All Buffer Salts&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:192px;">Protino Glutathione (GSH) agarose&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Machery-Nagel</td>
			<td style="width:135px;">745500.10</td>
			<td style="width:267px;">Store at 4 &#176;C; http://www.mn-net.com/</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Z-&#8203;Arg-&#8203;Arg-&#8203;7-&#8203;amido-&#8203;4-&#8203;methylcoumarin hydrochloride (Zcoum)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C5429</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:192px;">Chloroamidine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Cayman Chemical&#160;</td>
			<td style="width:135px;">10599</td>
			<td style="width:267px;">Store at -20 &#176;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">Tris(2-&#8203;carboxyethyl)&#8203;phosphine hydrochloride (TCEP HCl)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientifc</td>
			<td style="width:135px;">20490</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.piercenet.com/">http://www.piercenet.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:192px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

最初に、それはZRcoum 96ウェルプレートフォーマットでPAD4の活性に報告することができることが実証された。ウェルを基板ZRcoumとし、PAD4の存在/非存在下でインキュベートした。 475/15 nmのフィルタ（ 図2A）、 - 37℃で45分間のインキュベーション時間の後、蛍光を340/40で測定した。予想されたように、蛍光レベルはZRcoum（またはシトルリン<stron...

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Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

プロ蛍光基質アナログを経由してPAD4活性の蛍光ベースの監視

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.8K ビュー.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

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Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

蛍光ベースの氷面アフィニティーによる不凍タンパク質の氷結合平面の決定

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

化学

Preparing Silica Aerogel Monoliths via a Rapid Supercritical Extraction Method

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The procedure requires 15-20 min of preparation time, during which a liquid precursor mixture is prepared and poured into wells of a metal mold that is placed between the platens of a hydraulic hot press, followed by several hours of processing within the hot press. The precursor solution consists of a 1.0:12.0:3.6:3.5 x 10-3 molar ratio of tetramethylorthosilicate (TMOS):methanol:water:ammonia. In each well of the mold, a porous silica sol-gel matrix forms. As the temperature of the mold and its contents is increased, the pressure within the mold rises. After the temperature/pressure conditions surpass the supercritical point for the solvent within the pores of the matrix (in this case, a methanol/water mixture), the supercritical fluid is released, and monolithic aerogel remains within the wells of the mold. With the mold used in this procedure, cylindrical monoliths of 2.2 cm diameter and 1.9 cm height are produced. Aerogels formed by this rapid method have comparable properties (low bulk and skeletal density, high surface area, mesoporous morphology) to those prepared by other methods that involve either additional reaction steps or solvent extractions (lengthier processes that generate more chemical waste).The rapid supercritical extraction method can also be applied to the fabrication of aerogels based on other precursor recipes.

This article describes a rapid supercritical extraction method for fabricating silica aerogels. By utilizing a confined mold and hydraulic hot press, monolithic aerogels can be made in eight hours or less.

急速な超臨界抽出方法によるシリカエアロゲルモノリスを準備

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The ...

Real-time Monitoring of Reactions Performed Using Continuous-flow Processing: The Preparation of 3-Acetylcoumarin as an Example

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible to ensure consistent product quality over time using this technique. We here show how to interface a commercially available flow unit with a Raman spectrometer. The Raman flow cell is placed after the back-pressure regulator, meaning that it can be operated at atmospheric pressure. In addition, the fact that the product stream passes through a length of tubing before entering the flow cell means that the material is at RT. It is important that the spectra are acquired under isothermal conditions since Raman signal intensity is temperature dependent. Having assembled the apparatus, we then show how to monitor a chemical reaction, the piperidine-catalyzed synthesis of 3-acetylcoumarin from salicylaldehyde and ethyl acetoacetate being used as an example. The reaction can be performed over a range of flow rates and temperatures, the in-situ monitoring tool being used to optimize conditions simply and easily.

Real-time monitoring allows for fast optimization of reactions performed using continuous-flow processing. Here the preparation of 3-acetylcoumarin is used as an example. The apparatus for performing in-situ Raman monitoring is described, as are the steps required to optimize the reaction.

連続フロー処理を​​使用して行われる反応のリアルタイムモニタリング：例として3- Acetylcoumarinの調製

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

HDAC1 と HDAC6 hela 細胞活性の同時測定セルを用いたクロマト MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Fabrication and Testing of Catalytic Aerogels Prepared Via Rapid Supercritical Extraction

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three preparation methods are described: (a) the incorporation of metal salts into silica or alumina wet gels using an impregnation method; (b) the incorporation of metal salts into alumina wet gels using a co-precursor method; and (c) the addition of metal nanoparticles directly into a silica aerogel precursor mixture. The methods utilize a hydraulic hot press, which allows for rapid (&#60;6 h) supercritical extraction and results in aerogels of low density (0.10 g/mL) and high surface area (200-800 m2/g). While the work presented here focuses on the use of copper salts and copper nanoparticles, the approach can be implemented using other metal salts and nanoparticles. A protocol for testing the three-way catalytic ability of these aerogels for automotive pollution mitigation is also presented. This technique uses custom-built equipment, the Union Catalytic Testbed (UCAT), in which a simulated exhaust mixture is passed over an aerogel sample at a controlled temperature and flow rate. The system is capable of measuring the ability of the catalytic aerogels, under both oxidizing and reducing conditions, to convert CO, NO and unburned hydrocarbons (HCs) to less harmful species (CO2, H2O and N2). Example catalytic results are presented for the aerogels described.

Here we present protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms. Methods for preparing materials using copper salts and copper-containing nanoparticles are featured. Catalytic testing protocols demonstrate the effectiveness of these aerogels for three-way catalysis applications.

急速な超臨界抽出法によって作製した触媒のエアロゲルの作製と試験

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.

アクティブな表面の成長メカニズムを介して基質結合 Au ナノワイヤの作製

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the reaction is commonly performed using chlorinated or amide solvent systems, which are hazardous to human health and the environment. Our methodology utilizes acetonitrile as a greener and less hazardous solvent system. This protocol exhibits rates and yields that are comparable to traditional solvent systems and employs an extraction and wash sequence that eliminates the need for the purification of the ester product via column chromatography. This general method can be used to couple a variety of carboxylic acids with 1&#176; and 2&#176; aliphatic alcohols, benzylic and allylic alcohols, and phenols to obtain pure esters in high yields. The goal of the protocol detailed here is to provide a greener alternative to a common esterification reaction, which could serve useful for ester synthesis in both academic and industrial applications.

A modified Steglich esterification reaction was used to synthesize a small library of ester derivatives with primary and secondary alcohols. The methodology uses a non-halogenated and greener solvent, acetonitrile, and enables product isolation in high yields without the need for chromatographic purification.

アセトニ トリル中で環境に優しい転移エステルを介してエステルの合成

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

化合物阻害、IC50値、アーティフィファクト活性、ヌクレオシドリボヒドロラーゼの全細胞活性を決定するためのNMRベース活性アッセイ

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, metal-binding interactions, and conformational shape. Coupling ESI with ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) provides an instrumental technique that allows for simultaneous measurement of a peptide&#8217;s mass-to-charge (m/z) and collision cross section (CCS) that relate to its stoichiometry, protonation state, and conformational shape. The overall charge of a peptide complex is controlled by the protonation of 1) the peptide&#8217;s acidic and basic sites and 2) the oxidation state of the metal ion(s). Therefore, the overall charge state of a complex is a function of the pH of the solution that affects the peptides metal ion binding affinity. For ESI-IM-MS analyses, peptide and metal ions solutions are prepared from aqueous-only solutions, with the pH adjusted with dilute aqueous acetic acid or ammonium hydroxide. This allows for pH dependence and metal ion selectivity to be determined for a specific peptide. Furthermore, the m/z and CCS of a peptide complex can be used with B3LYP/LanL2DZ molecular modeling to discern binding sites of the metal ion coordination and tertiary structure of the complex. The results show how ESI-IM-MS can characterize the selective chelating performance of a set of alternative methanobactin peptides and compare them to the copper-binding peptide methanobactin.

Ion mobility-mass spectrometry and molecular modeling techniques can characterize the selective metal chelating performance of designed metal-binding peptides and the copper-binding peptide methanobactin. Developing new classes of metal chelating peptides will help lead to therapeutics for diseases associated with metal ion misbalance.

金属イオン認識の構造とメカニズムを決定するイオン移動質量分析技術と金属結合オリゴペプチドの酸化還元活性

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Facile Synthesis of Colloidal Lead Halide Perovskite Nanoplatelets via Ligand-Assisted Reprecipitation

In this work, we demonstrate a facile method for colloidal lead halide perovskite nanoplatelet synthesis (Chemical formula: L2[ABX3]n-1BX4, L: butylammonium and octylammonium, A: methylammonium or formamidinium, B: lead, X: bromide and iodide, n: number of [BX6]4- octahedral layers in the direction of nanoplatelet thickness) via ligand-assisted reprecipitation. Individual perovskite precursor solutions are prepared by dissolving each nanoplatelet constituent salt in N,N-dimethylformamide (DMF), which is a polar organic solvent, and then mixing in specific ratios for targeted nanoplatelet thickness and composition. Once the mixed precursor solution is dropped into nonpolar toluene, the abrupt change in the solubility induces the instantaneous crystallization of nanoplatelets with surface-bound alkylammonium halide ligands providing colloidal stability. Photoluminescence and absorption spectra reveal emissive and strongly quantum-confined features. X-ray diffraction and transmission electron microscopy confirm the two-dimensional structure of the nanoplatelets. Furthermore, we demonstrate that the band gap of perovskite nanoplatelets can be continuously tuned in the visible range by varying the stoichiometry of the halide ion(s). Lastly, we demonstrate the flexibility of the ligand-assisted reprecipitation method by introducing multiple species as surface-capping ligands. This methodology represents a simple procedure for preparing dispersions of emissive 2D colloidal semiconductors.

This work demonstrates facile room-temperature synthesis of colloidal quantum-confined lead halide perovskite nanoplatelets by ligand-assisted reprecipitation method. Synthesized nanoplatelets show spectrally narrow optical features and continuous spectral tunability throughout the visible range by varying the composition and thicknesses.