This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4 변환, 발현, 및 정제 <ol><li> PAD4 변환의 경우, 화학적으로 유능한 E. PAD4의 GST 융합을 포함하는 플라스미드를 pGEX 변환 다음 절차를 사용하여 단백질 발현 대장균 (BL21 (DE3)) 세포. 화학적 유능한 (염화 칼슘)를 준비 E. 표준 프로토콜에 따라 대장균 (BL21 (DE3)) 세포. <ol><li> 미리 제조 한 화학적 유능한 BL21 (DE3) 세포를 얼음에 50㎕의 해동 및 5 ㎖의 배양 관에 PAD4 유전자를 포함하는 플라스미드를 pGEX 1 μL와 혼합한다. 부드럽게 매 2 분 흔들어 섞으면 서 10 분 동안 얼음 혼합물을 품어. </li><li> 열은 40 초 동안 42 ° C의 물을 용기에 혼합물을 배치하여 셀을 충격. 즉시 세포가 복구 할 수 있도록 2 분 동안 다시 얼음에 세포 플라스미드 혼합물을 배치합니다. 혼합물에 멸균 된 LB 액체 배지 1 ㎖를 추가하고 1 분 동안 얼음에 배치합니다. </li><li> 1 250 rpm으로 흔들어, 37 ° C에서 세포 충격 열을 품어시간. 피펫 (75) 암피실린 내성 한천 접시에 형질 전환 세포의 μL, 15 시간 동안 37 ° C에서 품어. 4 ℃에서 보관 판. </li></ol></li><li> PAD4 식입니다. <ol><li> 1x를 앰피 실린을 함유하는 LB 5 ml의 암피실린 한천 플레이트와 장소에서 BL21 (DE3) 세포의 콜로니 하나를 선택. 인큐베이터에 넣어 37 ℃에서 O / N를 흔들. </li><li> 1x를 암피실린 수화물을 함유하는 멸균 LB (MW 403.45 g / mol)를 1 L로 LB (스타터)의 5 ml의 전송. 37 ° C 진탕 배양기에 넣어 성장. 성장의 OD (600)를 모니터링합니다. 성장 (600) 0.3의 OD에 도달하면, 인큐베이터을 흔들어 16 ° C로 성장 이동합니다. </li><li> OD 0.6 600 0.3 밀리미터 isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238.30 g / mol)을 가진 세포를 유도 도달하면. 세포가 16 ℃에서 15 시간 동안 흔들 수 있습니다. </li><li> 0 ° C에서 20 분 동안 4,000 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. -80 ° C에서 상등액 및 저장 펠렛을 붓고. </li></ol></li><li> PAD4 정화 <ol><li> 다시 일시의 50 mM의 NaCl (MW 58.44 g / 몰)의 버퍼에 세포를 BL21 (DE3)에서 발현 PAD4 함유 펠렛을 300 mM의의 NaH 2 PO 4 (MW 119.98 g / mol)을 10 mM의 이미 다졸 (MW 68.077 g / 몰), 0.1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF, MW 174.94 g / mol) 및 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT, 154.25 g / 몰)의 pH = 8.0. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 초음파 처리를 통해를 Lyse은 세포. 초음파 처리 후, 0 ° C에서 20 분 동안 20,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리. 붓고 및 상층 액을 저장합니다. 일괄 RT에서 30 분 동안 글루타치온 (GSH), 아가 로스 비드와 상청. </li><li> 중력을 통해 GST 비즈 / 열에서 상층 액을 배출합니다. 실온에서 1X PBS (인산염 완충 식염수, pH는 8.0)의 4 × 25 ml로 구슬을 씻으십시오. </li><li> 용출 PAD4 2 × 10 ml의 용출 버퍼와, 50 mM의 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스 자료, MW 121.14 g / mol)을 10 mM의 글루타치온 (GSH, MW 307.32 g / 몰), pH가 8.0. </li><li> 10 만 MW 컷-O를 사용하여 PAD4을 집중FF 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 4 ° C에서 20 분 동안 4,000 XG에. -80 ° C에서 나누어지는 1.0 ml의 마이크로 원심 튜브에 200 μL의 볼륨으로 단백질 및 저장. </li></ol></li></ol> 버퍼 2. 준비 원액 <ol><li> 염화나트륨 (NaCl을, MW 58.44 g / 몰) 칭량하고 2 M 용액을 제조 하였다. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스 자료, MW 121.14 g / 몰) 밖으로 달아 = 8.0 2 M 용액의 pH를 준비합니다. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 염화칼슘 이수화 물 (CaCl2를 2H 2 O, MW 147.01 g / 몰) 칭량하고 500 mM의 용액을 조제. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP, MW 250.19 g / 몰) 칭량하고 200 mM의 용액을 조제. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 디티 오 트레이 톨 (DTT, MW 154.25 g / 몰) 밖으로 무게와 1 M 용액을 제조. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 준비트리톤 X-100의 0.5 % 용액. </li><li> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, MW 292.24 g / 몰) 칭량하고 100 mM의 용액을 조제. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 염산염 (ZRcoum, MW 621.69 g / mol)의 methylcoumarin Z- Arg- Arg- 7- amido- 4-을 달아 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 10 mM의 용액을 조제. </li></ol> 37 ° C에서 3 PAD4 분석 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 125 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 125 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 CaCl2를, 6.25 mM의 DTT의 버퍼, 5 μM의 PAD4 (PH = 8.0)를 준비합니다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 염화칼슘 2, 6.25 mM의 DTT (PH = 8.0)의 버퍼를 준비합니다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. 명확 때까지 솔루션을 혼합하고 -20 ℃에 저장° C. 이 솔루션 D.됩니다 </li><li> 96 웰 플레이트를 확보하고 컨트롤 우물의 수 (NO PAD4) 및 테스트 우물 (+ PAD4)를 지정합니다. </li><li> 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 C의 160 μL에 솔루션 B의 160 μL. 37 ° C에서 15 분 동안 품어. </li><li> 피펫 (40) 모든 우물에 솔루션의 μL와 45 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 테스트 우물의 제어 우물의 절반과 절반 dH보다 2 O의 피펫 10 μL. 대조군 웰 및 테스트 제어, 피펫 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션 D. 용액 10 μL의 다른 절반. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> RT 4. PAD4 분석 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 50 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 50 μM의 ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 나 버퍼를 준비CL, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100, 8 μM의 PAD4 (pH가 = 8.0). 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100 (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 D.됩니다 </li><li> 384 웰 플레이트를 취득 및 제어 (NO PAD4) 및 테스트 우물 (+ PAD4)에 대한 우물을 지정합니다. </li><li> 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 C의 25 μL에 솔루션 B의 25 μL. 실온에서 20 분 동안 우물에서 부화 PAD4 / 없음 버퍼를 허용합니다. </li><li> 모든 우물에 솔루션 C의 피펫 25 μL와 실온에서 45 분 동안 품어. </li><li> 테스트 우물의 제어 우물의 절반과 절반 dH보다 2 O의 피펫 10 μL. 대조군 웰 및 테스트 제어의 다른 절반에 pipett실온에서 10 분 동안 솔루션 D. 품어의 전자 10 μL. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> 37 ° C 및 실온에서 5 PAD4 시간 코스 분석 실험 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 125 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 125 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 CaCl2를, 6.25 mM의 DTT의 버퍼, 5 μM의 PAD4 (PH = 8.0)를 준비합니다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> (얼마나 많은 시점에 따라 달라집니다 우물 #)이 96 웰 플레이트 및 피펫 우물 # 금액에 솔루션 B의 160 μl를 얻습니다. </li><li> 37 ° C에서 한 96 웰 플레이트를 품어. RT에서 다른 96 웰 플레이트를 품어. </li><li> 삐악 삐악 울다ette 즉시 (40) 모두 96 웰 플레이트의 모든 우물에 솔루션의 μL과는 t = 0 분 우물에 솔루션 C의 10 μl를 피펫. 모든 우물이 침묵 할 때까지 특정 시점에서 솔루션 C의 10 μl를 계속 추가합니다. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> 실온에서 6 PAD4 저해 분석 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 83 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 83 μM의 ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 된 C1-아미 딘 (MW 424.8 g / 몰) 칭량하고 100 μM 스톡 용액을 준비한다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100의 완충액, 8 μM의 PAD4 (하여 pH = 8.0)을 준비한다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100 (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 목솔루션 D. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 E. 될 것입니다 </li><li> 384 웰 플레이트를 확보하고 컨트롤 우물 (NO PAD4), 시험 우물 (+ PAD4) 및 억제 우물 (PAD4 + CL-아미 딘)을 지정합니다. </li><li> 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 D의 25 μL에 솔루션 C의 25 μL. 실온에서 20 분 동안 우물에서 부화 PAD4 / 없음 버퍼를 허용합니다. </li><li> 억제의 우물에 솔루션 B의 피펫 10 μL 및 RTE에서 20 분 동안 품어. </li><li> 모든 우물에 솔루션의 피펫 15 μL와 실온에서 45 분 동안 품어. </li><li> 피펫 모든 우물에 솔루션 E의 10 μL. 10 분 동안 RT에서 인큐베이션. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> 7. 원유 세포 용 해물 분석RT에서 <ol><li> 50 mM 트리스, 50 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF, MW 174.94 g / mol) 및 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT, 154.25 g / mol)을, pH를 10 ㎖의 PAD4 1 L 성장에서 재현 탁 된 세포를 세포를 수확 한 후 = 8.0. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 초음파 처리를 통해를 Lyse은 세포. 0 ° C에서 20 분 동안 20,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리기. 10 만 MW 차단 원심 분리기 튜브를 사용하여 4 ° C에서 4,000 rpm으로 원심 분리하여 절반 볼륨에 맑은 상층 액을 집중한다. </li><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 250 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 250 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> 블랙 384 웰 플레이트 및 설계를 얻컨트롤 (NO 세포 용 해물) 및 테스트 우물 (+ 세포 용 해물)에 대한 우물을 먹었다. </li><li> 피펫 시험의 우물에 모든 우물과 세포 용 해물의 피펫 60 μL에 B 액 100 ㎕. 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 모든 우물에 솔루션의 피펫 40 μL와 실온에서 45 분 동안 품어. </li><li> 피펫 모든 우물에 솔루션 C의 10 μL. 10 분 동안 RT에서 인큐베이션. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol>

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Commun. 3, 676 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest.">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li><li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4+(PAD4):+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential.">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4.">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+peptidylarginine+deiminase+(PAD)+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity.">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li><li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

포유 동물 단백질의 다수 무겁게 리보솜에 의한 단백질의 생합성 다음 효소의 작용에 의해 변성된다. 이러한 번역 후 변형 (PTMS)는 크게 단백질 1-3 (다른 기능 사이)의 크기, 전하, 구조 및 올리고머 상태를 변경하여 프로테옴의 기능적 다양성을 증가시킬 수있다. 그 결과, 단백질 구조의 변화는 단백질 분해, 세포 분화, 시그널링, 유전자 발현의 조절, 및 단백질 - 단백질 상호 작용과 같은 생리 학적 결과로 이어질 수있다. 이러한 수정은 인간의 모든 단백질의 큰 비율에 널리 퍼져 있지만 히스톤 단백질이 공유 수정 4의 비정상적으로 높은 숫자를 받아야에 터미널이 종료됩니다. 히스톤 단백질은 게놈 DNA의 응축을 촉진 구조 단백질의 패밀리이다. 구조화되지 않은 히스톤 꼬리의 공유 수정 세리 의해 수행 및 규제, 잔류 (작가)의 공유 변형을 촉진 같은 수정 (지우개), 역 및 변경을 구별 할 수 효소의 S는 히스톤 꼬리 (독자) 5-7에 각인된다. 실제로, 공지 PTMS 대부분 메틸화, 인산화, 아세틸, sumoylation, 유비퀴틴 및 citrullination 8 포함한 히스톤이 짧은 세그먼트 내에서 관찰 할 수있다. Citrullination는 비 t의 RNA 부호화 펩 티딜 - 시트룰린 (도 1a)에 펩 티딜 - 아르기닌의 변환을 수반한다. 이 측쇄 중화에 책임 단백질, PAD의 구성원 칼슘 의존적 효소이다 모두. 9,10이 단백질 군 (p는 rginine d를 eiminase eptide)를. 현재까지, 패드 가족의 다섯 멤버는 (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 및 PAD6)를 설명 하였다. 이 가족의 각 구성원은 별개의 세포 단백질을 대상으로 나타나고 또한 유니 표시가야 조직 분포 프로필. PAD4 핵 지역화 시퀀스 (11)를 통해 핵 내에서 지역화 된 것으로 알려진이 단백질 가족의 유일한 구성원입니다. 따라서,이 히스톤의 H2A 아르기닌 잔기 (3)의 N 말단 꼬리에서 아르기닌 측쇄 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 및 H3R26) 및 H4 (H4R3) (12)를 포함하여 핵 대상 번호를 deiminate 것으로 밝혀졌다, 13. PAD 동위 효소의 각 특정 중요한 생리 기능을 가지고 있지만, PAD4 인해 병에 걸린와 건강한 세포 모두에서 인간의 프로세스의 수의 역할에 훨씬 더 많은 관심을 받고있다. 최근 PAD4가 능성 전사 네트워크 (14)의 구성원이 될 것으로 나타났다. 두 PAD4 발현 수준과 활성 마우스에서 리 프로그래밍 및 접지 상태 능성 상태 동안 상승되는 것으로 도시 하였다. 줄기 세포 유전자의 조절을 제어함으로써, PAD4 세포 리 프로그래밍 효율의 중추적 인 역할을 유지할 수있다. PAD4도에 연루되었는지에 병원균의 결합 호중구 세포 트랩의 형성은 자신의 시스템 정리를 할 수 있습니다. PAD4 의한 히스톤 단백질의 hypercitrullination 따라서 세균 감염 15,16 떨어져 병동, 트랩에 의한 세포 외 병원균의 캡슐화 용 기재로서 기능 염색질의 decondensation을 유도한다. 또한 PAD4 인간 질병의 수가 활성 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 것은 이미 PAD4의 비정상적 발현은 류마티스 관절염의 발병과 중증도와 연관되어 있음을 보여왔다, 알쯔하이머, ​​파킨슨 병 및 다발성 경화증 17. 실제로, 안티 - 시트룰린 단백질 항체의 존재는 류마티스 관절염 (18)의 가장 안전하고 확실한 진단 및 예후 바이오 마커이다. 마찬가지로, 조절 곤란 PAD4 활성은 최근 난소, 유방, 폐, 포함한 인간 암의 다수 관찰되었다D 식도암 19-22. PAD4과 암 사이의 링크는 p53 종양 억제 단백질 22, 23 ELK1 종양 유전자를 통해 또는 통해 매개되는 것으로 나타났다 이전 작업은 PAD4가 새로운 항암 치료 표적 17,24,25이 될 수 있다고 제안했다. 원리 연구의 증거로, 대장 암 세포주 HCT116에 shRNA를 통해 PAD4의 고갈은 세포 사멸과 세포주기 정지 (26)을 유도하기에 충분한 것으로 밝혀졌다. 최근에 개발 돌이킬 수 PAD4 억제제 쥐 27 종양 질량의 70 % 감소되었다. 아주 현저하게, PAD4 억제는 변형되지 않은 세포를 살려주는 동안 암 세포를 선택적으로 죽이는 결과 표적 치료의 역할을 한 것으로 보입니다. PAD4의 기능을 해제하는 작은 분자의 사용은 암 세포를 대상으로 또는 기존의 암 화학 요법 (28)을 증가시키기 위해 강력하고 새로운 전략으로 증명할 수 있습니다. 불행하게도, 포십t 가역 PAD4 억제제는 아직 발견해야합니다. 공유 억제제의 수는 아르기닌 기판 27,29,30 모방 건강 및 질병 상태 모두에서 세포 PAD4의 역할을 이해하는데 실질적인 도구적일 수 클로로 / 플루오 imidine 핸들을 사용하여 개발되어왔다. 그러나, 이들 분자는 유사한 효능을 가진 활성 패드 모두 억제한다. 따라서 PAD4의 활성에 대해보고 용이 한 분석에 대한 필요성이 매우 중요하다. 현재까지 PAD4 분석법 비색 판독 31 반응으로부터 암모니아의 방출을 연결하는 설명되었지만, 형광 편광 분석법 (32) 형광 표지 chloroamidine 기질 유사체를 이용하는 글리 옥살과 시트룰린 (33) 사이의 산 - 보조 반응에 의존하고, 몇 단계 34 dequenching 형광에 PAD4 활동. 이들 중에서, 단지 공유 개질제 haloacetamidine 전략은 높은 처리량 scre와 호환되도록 입증개로 인한 플랫폼 32,35,36. 우리는 확실 PAD4의 활성을 측정 손쉬운 형광 계 분석을 설명한다. 강한 신호 대 잡음비, 분석 속도 및 측정의 견고성을 표시 분석은, 진정으로 강력하고 선택 PAD4 억제제를 발견 할 가능성이있다.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.amresco-inc.com/&quot;&gt;http://www.amresco-inc.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/&quot;&gt;http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/&quot;&gt;http://www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>All Buffer Salts&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td></tr><tr><td>Protino Glutathione (GSH) agarose&amp;nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Store at 4 &amp;deg;C; http://www.mn-net.com/</td></tr><tr><td>Chloroamidine&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemical&amp;nbsp;</td><td>10599</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td><td></td><td></td><td>Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.tecan.com/&quot;&gt;www.tecan.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.perkinelmer.com/&quot;&gt;http://www.perkinelmer.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

처음에, 그것은 ZRcoum는 96- 웰 플레이트 형식으로 PAD4의 활성에보고 할 수 있음을 입증 하였다. 웰은 상기 기판과 함께 ZRcoum PAD4의 존재 / 부재 하에서 배양 하였다. 15분의 475 nm의 필터 (도 2A) - 37 ° C에서 45 분의 인큐베이션 기간 후, 형광 40분의 340로 측정 하였다. 예상 한 바와 같이, 형광 레벨은 ZRcoum (또는 시트룰린 ZRcoum) 내의 형광 ?...

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Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

프로 형광 기판 아날로그를 통해 PAD4 활동의 형광 기반의 모니터링

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.9K 조회수.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

비디오: Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

연구

생체공학

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

생화학

cADDis를 사용한 cAMP 분석: 단일 세포에서 고처리량 스크리닝

Real-Time cAMP Dynamics in Live Cells Using the Fluorescent cAMP Difference Detector In Situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is created from a circularly permuted fluorescent protein linked to the hinge region of Epac2. This creates a single fluorophore biosensor that displays either increased or decreased fluorescence upon binding of cAMP. The biosensor exists in red and green upward versions, as well as green downward versions, and several red and green versions targeted to subcellular locations. To illustrate the effectiveness of the biosensor, the green downward version, which decreases in fluorescence upon cAMP binding, was used. Two protocols using this sensor are demonstrated: one utilizing a 96-well plate reading spectrophotometer&#160;compatible with high-throughput screening and another utilizing single-cell imaging on a fluorescent microscope. On the plate reader, HEK-293 cells cultured in 96-well plates were stimulated with 10 &#181;M forskolin or 10 nM isoproterenol, which induced rapid and large decreases in fluorescence in the green downward version. The biosensor was used to measure cAMP levels in individual human airway smooth muscle (HASM) cells monitored under a fluorescent microscope. The green downward biosensor displayed similar responses to populations of cells when stimulated with forskolin or isoproterenol. This single-cell assay allows visualization of the biosensor location at 20x and 40x magnification. Thus, this cAMP biosensor is sensitive and flexible, allowing real-time measurement of cAMP in both immortalized and primary cells, and with single cells or populations of cells. These attributes make cADDis a valuable tool for studying cAMP signaling dynamics in living cells.

저자 스포트라이트: Advancing Real-Time cAMP Detection in Cells Using cADDis Biosensor (cADDis 바이오센서를 사용한 세포의 실시간 cAMP 검출 발전)

The protocol presented in this study illustrates the effectiveness of the cAMP Difference Detector In Situ in measuring cAMP through two methods. One method utilizes a 96-well plate reading spectrophotometer with HEK-293 cells. The other method demonstrates individual HASM cells under a fluorescent microscope.

In Situ Fluorescent cAMP Difference Detector를 사용한 살아있는 세포의 실시간 cAMP 역학

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

생물학

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

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Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

프로 형광 기판 아날로그를 통해 PAD4 활동의 형광 기반의 모니터링

요약

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In Situ Fluorescent cAMP Difference Detector를 사용한 살아있는 세포의 실시간 cAMP 역학

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