This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4 transformation, expression et la purification <ol><li> Pour PAD4 Transformation, transformer le plasmide pGEX contenant PAD4 TPS fusion dans E. chimiquement compétent Coli (BL21 (DE3)), les cellules pour l&#39;expression de protéine en utilisant la procédure suivante. Préparer chimiquement compétente (chlorure de calcium) E. Coli (BL21 (DE3)), les cellules selon les protocoles standards. <ol><li> 50 ul de dégel préalablement préparée chimiquement compétente BL21 (DE3), les cellules sur de la glace et mélanger avec 1 ul du plasmide pGEX PAD4 contenant le gène dans un tube de culture de 5 ml. Incuber le mélange sur de la glace pendant 10 min en agitant doucement toutes les 2 min. </li><li> Choc thermique des cellules en plaçant le mélange dans un bain d&#39;eau à 42 ° pendant 40 secondes. Placer immédiatement le mélange cellulaire plasmide retour sur la glace pendant 2 min pour permettre aux cellules de se rétablir. Ajouter 1 ml de bouillon LB stérile pour le mélange et le placer sur de la glace pendant 1 min. </li><li> Incuber la chaleur cellules choqué à 37 ° C, en agitant à 250 rpm pendant 1h. Introduire à la pipette 75 ul de cellules transformées sur une plaque de gélose à l&#39;ampicilline et résistant à incuber à 37 ° C pendant 15 heures. plaque de magasin à 4 ° C. </li></ol></li><li> Expression PAD4. <ol><li> Choisissez une colonie de BL21 (DE3) de la plaque de gélose à l&#39;ampicilline et le lieu dans 5 ml de LB contenant de l&#39;ampicilline 1x. Lieu dans l&#39;incubateur et secouer O / N à 37 ° C. </li><li> Transférer les 5 ml de LB (entrée) dans 1 L de milieu LB stérile contenant 1x trihydrate d&#39;ampicilline (MW 403,45 g / mol). Lieu croissance dans un incubateur à agitation à 37 ° C. Surveiller la DO 600 de la croissance. Lorsque la croissance atteint une DO 600 de 0,3, se déplacer en croissance de 16 ° C en secouant incubateur. </li><li> Après avoir atteint une DO 600 de 0,6, induire les cellules avec isopropylthiagalactoside 0,3 mM (IPTG, MW 238,30 g / mol). Permettent aux cellules de secouer pendant 15 heures à 16 ° C. </li><li> cellules de récolte par centrifugation à 4000 g pendant 20 min à 0 ° C. Verser le surnageant et magasin culot à -80 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Purification <ol><li> Remettre en suspension le culot contenant la PAD4 exprimée dans BL21 (DE3), les cellules dans un tampon de 50 mM de NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM de NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM d&#39;imidazole (68,077 MW g / mol), 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF, MW 174,94 g / mol) et mM de dithiothréitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0 1. </li><li> Lyser les cellules par traitement aux ultrasons pendant 15 min à 4 ° C. Suite à la sonification, centrifuger le lysat cellulaire à 20 000 x g pendant 20 min à 0 ° C. Décanter et conserver le surnageant. Lot le surnageant avec le glutathion (GSH), des billes d&#39;agarose pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Égoutter surnageant de la TPS perles / colonne par gravité. Laver les billes avec 4 x 25 ml de 1 x PBS (solution saline tamponnée au phosphate, pH = 8,0) à la température ambiante. </li><li> Eluer PAD4 avec 2 x 10 ml de tampon d&#39;élution, 50 mM de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM de glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Concentrez PAD4 utilisant 100k MW coupe-otubes à centrifuger ff et centrifuger à 4000 g pendant 20 min à 4 ° C. protéines aliquote dans 200 volumes ul dans 1,0 ml microtubes et conserver à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des solutions d&#39;achat d&#39;actions pour tampons <ol><li> Peser le chlorure de sodium (NaCl, MW 58,44 g / mol) et préparer une solution à 2 m. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris base, MW 121.14 g / mol) et préparer une solution 2 M, pH = 8,0. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser le chlorure de calcium dihydraté (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) et de préparer une solution 500 mM. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser Tris (2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE, MW 250.19 g / mol) et préparer une solution de 200 mM. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. </li><li> Peser dithiothréitol (DTT, MW 154.25 g / mol) et préparer une solution à 1 M. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. </li><li> Préparerune solution à 0,5% de Triton X-100. </li><li> Peser acide éthylène (EDTA, MW 292,24 g / mol) et préparer une solution à 100 mM. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser Z- Arg Arg 7- amido 4- méthylcoumarine chlorhydrate (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) et de préparer une solution à 10 mM dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 test à 37 ° C <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 125 uM de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution 125 uM ZRcoum sera la solution A. </li><li> Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, et 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2 et 6,25 mM de DTT (pH = 8,0). Ce sera la solution C. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et stocker à -20° C. Ce sera la solution D. </li><li> Obtenir une plaque de 96 puits et de désigner un certain nombre de puits pour les contrôles (pas PAD4) et les puits d&#39;essai (+ de pAD4). </li><li> Pipette 160 ul de solution B dans les puits d&#39;essai et pipette 160 ul de la solution C dans les puits de contrôle. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. </li><li> Introduire à la pipette 40 ul de la solution A dans tous les puits et incuber à 37 ° C pendant 45 min. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de dH 2 O à la moitié des puits de contrôle et la moitié des puits d&#39;essai. Pour l&#39;autre moitié des puits de contrôle et des commandes de test, la pipette 10 ul de la solution D. incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 4. PAD4 test à température ambiante <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution à 50 uM de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution de ZRcoum 50 uM sera la solution A. </li><li> Préparer un tampon de 100 mM NaCl, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, et 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, et 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Ce sera la solution C. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution D. </li><li> Obtenir une plaque de 384 puits et désigner puits pour les contrôles (pas pAD4) et les puits d&#39;essai (+ de pAD4). </li><li> Pipette 25 ul de solution B dans les puits d&#39;essai et pipette 25 ul de la solution C dans les puits de contrôle. Autoriser tampon avec / sans PAD4 à incuber dans les puits pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 25 ul de la solution C dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de dH 2 O à la moitié des puits de contrôle et la moitié des puits d&#39;essai. Pour l&#39;autre moitié des puits de contrôle et des commandes de test, pipette 10 ul de solution D. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 5. pAD4 Temps cours dosages à 37 ° C et la température ambiante <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 125 uM de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution 125 uM ZRcoum sera la solution A. </li><li> Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, et 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution C. </li><li> Obtenir 2 plaques à 96 puits et pipette 160 ul de solution B dans # montant de puits (nombre de puits dépendra du nombre de points de temps). </li><li> Incuber une plaque de 96 puits à 37 ° C. Incuber la plaque 96 autre bien à température ambiante. </li><li> Topette 40 pi de la solution A dans tous les puits dans les plaques à 96 puits et immédiatement pipette 10 ul de la solution dans les puits C t = 0 min. Continuer l&#39;ajout de 10 ul de la solution C à des points de temps spécifiques jusqu&#39;à ce que tous les puits ont été trempés. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 6. PAD4 test d&#39;inhibition à la température ambiante <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 83 M de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution de ZRcoum 83 uM sera la solution A. </li><li> Peser Cl-amidine (MW 424,8 g / mol) et préparer une solution stock de 100 pm. Ce sera la solution B. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, et 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution C. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, et 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Thest sera la solution D. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution E. </li><li> Obtenir une plaque de 384 puits et désigner puits pour les contrôles (pas pAD4), puits d&#39;essai (+ pAD4), et les puits d&#39;inhibition (PAD4 + Cl-amidine). </li><li> Pipette 25 ul de la solution C dans les puits d&#39;essai et pipette 25 ul de la solution D dans les puits de contrôle. Autoriser tampon avec / sans PAD4 à incuber dans les puits pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Pipette de 10 pi de solution B dans les puits d&#39;inhibition et incuber pendant 20 min à RTE. </li><li> Introduire à la pipette 15 ul de la solution A dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de la solution E à tous les puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 7. cellulaire brut lysat Assayà la température ambiante <ol><li> Après la récolte des cellules à partir de PAD4 croissance de 1 L, remettre les cellules dans 10 ml de Tris 50 mM, NaCl 50 mM, 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF, MW 174,94 g / mol) et 1 mM de dithiothréitol (DTT, 154,25 g / mol), le pH = 8,0. </li><li> Lyser les cellules par traitement aux ultrasons pendant 15 min à 4 ° C. Centrifuger le lysat cellulaire à 20 000 x g pendant 20 min à 0 ° C. Concentrer le surnageant clair à la moitié du volume par centrifugation à 4000 rpm à 4 ° C en utilisant 100k MW tubes à centrifuger coupure. </li><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution de 250 M de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution 250 uM ZRcoum sera la solution A. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, CaCl2 20 mM, et 2 mM de TCEP (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution C. </li><li> Obtenir une plaque et la conception de 384 puits noirmangé puits de contrôle (pas de lysat cellulaire) et des puits de test (+ lysat cellulaire). </li><li> Introduire à la pipette 100 ul de solution B dans tous les puits et la pipette 60 ul de lysat de cellules dans des puits d&#39;essai. Incuber pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 40 ul de la solution A dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de la solution C à tous les puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur le lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol>

<ol>
	<li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+protein+language+using+proteomics.">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li><li>Sims, R. J., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications.">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).</li><li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+to+study+genes+and+genomes.">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405, 837-846 (2000).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription.">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447, 407-412 (2007).</li><li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+switches+and+modification+cassettes+in+histone+biology+and+beyond.">Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond.</a> Nature. 425, 475-479 (2003).</li><li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications:+lessons+from+professional+pocket+pickers.">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li><li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+protein+modifications+with+interaction+domains.">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403, 41-45 (2000).</li><li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD,+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes:+genes,+features+and+involvement+in+disease.">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).</li><li>Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullination:+a+posttranslational+modification+in+health+and+disease.">Citrullination: a posttranslational modification in health and disease.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).</li><li>Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+of+peptidylarginine+deiminase+V+and+histone+deimination+in+granulocytes.">Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).</li><li>Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+of+histone+H2A+and+H4+at+arginine+3+in+HL-60+granulocytes.">Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes.</a> Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).</li><li>Kearney, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+characterization+of+protein+arginine+deiminase+4:+a+transcriptional+corepressor+implicated+in+the+onset+and+progression+of+rheumatoid+arthritis.">Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis.</a> Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).</li><li>Christophorou, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin.">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).</li><li>Wang, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminases+in+citrullination,+gene+regulation,+health+and+pathogenesis.">Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).</li><li>Trouw, L. A., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+serological+gap:+promising+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+rheumatoid+arthritis.">Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis.</a> Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).</li><li>Chang, X., Fang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PADI4+and+tumourigenesis.">PADI4 and tumourigenesis.</a> Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).</li><li>Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+peptidylarginine+deiminase+type+4+in+ovarian+tumors.">Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors.</a> Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).</li><li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+pathogenic+role+of+PADI4+in+oesophageal+cancer.">Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer.</a> Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+PADI4+cooperates+with+Elk-1+to+activate+c-Fos+expression+in+breast+cancer+cells.">Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li><li>Tanikawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+histone+modification+and+chromatin+structure+by+the+p53-PADI4+pathway.">Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway.</a> Nat. Commun. 3, 676 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest.">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li><li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4+(PAD4):+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential.">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4.">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+peptidylarginine+deiminase+(PAD)+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity.">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li><li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

Un grand nombre de protéines de mammifères sont fortement modifiées par l&#39;action d&#39;enzymes suivant la biosynthèse des protéines par le ribosome. Ces modifications post-traductionnelles (MPT) peuvent augmenter considérablement la diversité fonctionnelle du protéome en changeant la taille, la charge, la structure et l&#39;état d&#39;oligomérisation (entre autres fonctions) de protéines 1-3. En conséquence, le changement de structure de la protéine peut avoir des conséquences physiologiques, tels que la dégradation des protéines, la différenciation cellulaire, la signalisation, la modulation de l&#39;expression génique, et les interactions protéine-protéine. Bien que ces modifications sont répandues dans un grand pourcentage de toutes les protéines humaines, le terminal se termine sur des protéines histones subissent un nombre anormalement élevé de modifications covalentes 4. protéines histones sont une famille de protéines de structure qui facilitent la condensation de l&#39;ADN génomique. Des modifications covalentes des queues d&#39;histones non structurées sont effectuées et réglées par une séries d&#39;enzymes capables de catalyser la modification covalente de résidus (écrivains), inverser les mêmes modifications (gommes à effacer), et la distinction entre les changements étant imprimé sur les queues d&#39;histones (lecteurs) 5-7. En fait, la plupart des PTM connus peut être observé dans ce court segment de l&#39;histone y compris la méthylation, phosphorylation, acétylation, sumoylation, ubiquitination, et citrullination 8. Citrullination implique la conversion de peptidyl-arginine de l&#39;ARN t non codé peptidyl-citrulline (figure 1A). Les protéines, responsables de cette neutralisation de la chaîne latérale, sont membres de la PAD (p eptide un d eiminase rginine) famille de protéines, qui sont des enzymes dépendant du calcium. 9,10. À ce jour, cinq membres de la famille de PAD ont été décrits (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, et PAD6). Chaque membre de cette famille semble cibler des protéines cellulaires distincts et affiche également uniprofils de distribution tissulaire Qué. PAD4 est le seul membre de cette famille de protéines connues pour être localisée dans le noyau par l&#39;intermédiaire d&#39;une séquence de localisation nucléaire 11. En conséquence, il a été démontré que deiminate un certain nombre de cibles nucléaires, y compris les chaînes latérales d&#39;arginine sur les queues N-terminales des histones H2A arginine résidu 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, et H3R26) et H4 (H4R3) 12, 13. Bien que chacune des isoenzymes de la PAD ont des fonctions physiologiques spécifiques et critiques, PAD4 a reçu beaucoup plus d&#39;attention en raison de son rôle dans un certain nombre de processus humains à la fois les cellules saines et malades. Récemment, PAD4 a été montré pour être un membre du réseau de la transcription de la pluripotence 14. Les deux niveaux d&#39;expression et de l&#39;activité pAD4 ont été montrés à être élevé lors de la reprogrammation et l&#39;Etat-sol Etats pluripotentes chez la souris. En contrôlant la régulation des gènes de cellules souches, PAD4 peut conserver un rôle central dans l&#39;efficacité de la reprogrammation cellulaire. PAD4 a également été impliquée dans laformation de pièges extracellulaires neutrophiles, qui lors de la liaison des agents pathogènes permettre leur dégagement du système. Le hypercitrullination de protéines histones par PAD4 induit la décondensation de la chromatine, qui sert de matériau de base pour l&#39;encapsulation de bactéries pathogènes par le piège extracellulaires, ainsi éloigner les infections bactériennes 15,16. En outre, PAD4 a été trouvé à jouer un rôle actif dans un certain nombre de maladies humaines. Il a été précédemment montré que l&#39;expression aberrante de PAD4 est associé à l&#39;apparition et la gravité de la polyarthrite rhumatoïde, la maladie d&#39;Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques et 17. En fait, la présence d&#39;anticorps anti-protéine est une citrullinés des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques fiables et les plus définitives de la polyarthrite rhumatoïde 18. De même, l&#39;activité dérégulée PAD4 a récemment été observé dans un certain nombre de cancers humains, y compris de l&#39;ovaire, du sein, du poumon, und cancers de l&#39;œsophage 19-22. Le lien entre PAD4 et le cancer a été montré être médiée par l&#39;oncogène ELK1 ou via la p53 protéine suppresseur de tumeur et 22,23 travaux antérieurs ont suggéré que PAD4 pourrait être un anti-cancer cible thérapeutique 17,24,25. En tant que preuve de principe étude, l&#39;épuisement des PAD4 via shRNA dans la lignée de cellules de cancer colorectal HCT116 a été révélée être suffisante pour induire l&#39;apoptose et arrêt du cycle cellulaire 26. Inhibiteur irréversible de PAD4 récemment développé a conduit à une réduction de soixante-dix pour cent de la masse tumorale chez les souris 27. Tout à fait remarquable, PAD4 inhibition semble agir comme une thérapie ciblée qui conduit à une destruction sélective des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules non transformées. L&#39;utilisation de petites molécules pour désactiver la fonction de PAD4 peut se révéler être une nouvelle stratégie efficace pour cibler les cellules cancéreuses ou d&#39;augmenter les agents chimiothérapeutiques contre le cancer 28 existantes. Malheureusement, un poinhibiteur de PAD4 réversible de la tente n&#39;a pas encore été découvert. Un certain nombre d&#39;inhibiteurs covalents ont été développés en utilisant la chloro / poignée de imidine fluoro qui imite le substrat arginine 27,29,30 et se sont révélés être des outils pratiques pour comprendre le rôle de PAD4 dans les cellules de l&#39;État sains et malades. Cependant, ces molécules inhibent tous les DPA actifs avec une activité similaire. Par conséquent, la nécessité d&#39;un dosage facile que les rapports sur l&#39;activité de PAD4 est crucial. À ce jour, pAD4 essais ont été décrits qui pointent le rejet de l&#39;ammoniac à partir de la réaction à une lecture colorimétrique 31, utiliser un analogue de substrat de chloroamidine marqué par fluorescence pour l&#39;analyse de polarisation de fluorescence 32, compter sur la réaction acide-assistée entre glyoxal et citrulline 33, et coupler l&#39;activité PAD4 à une fluorescence étape 34 dequenching. Parmi ceux-ci, seul le modificateur de stratégie haloacetamidine covalente est avéré être compatible avec scre à haut débitplates-formes Ening 32,35,36. Nous décrivons un test basé sur la fluorescence facile qui mesure de façon fiable l&#39;activité de PAD4. L&#39;essai, qui présente un fort rapport signal-sur-bruit, la vitesse d&#39;analyse, et la robustesse de la mesure, est susceptible de découvrir un inhibiteur de PAD4 vraiment puissant et sélectif.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="716">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:192px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td>
			<td style="width:123px;">Amresco</td>
			<td style="width:135px;">J106-2KG</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:192px;">Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP902-25&#160;</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:192px;">Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technogolies</td>
			<td>15529-019</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:192px;">All Buffer Salts&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:192px;">Protino Glutathione (GSH) agarose&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Machery-Nagel</td>
			<td style="width:135px;">745500.10</td>
			<td style="width:267px;">Store at 4 &#176;C; http://www.mn-net.com/</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Z-&#8203;Arg-&#8203;Arg-&#8203;7-&#8203;amido-&#8203;4-&#8203;methylcoumarin hydrochloride (Zcoum)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C5429</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:192px;">Chloroamidine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Cayman Chemical&#160;</td>
			<td style="width:135px;">10599</td>
			<td style="width:267px;">Store at -20 &#176;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">Tris(2-&#8203;carboxyethyl)&#8203;phosphine hydrochloride (TCEP HCl)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientifc</td>
			<td style="width:135px;">20490</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.piercenet.com/">http://www.piercenet.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:192px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

Dans un premier temps, il a été démontré que ZRcoum peut rendre compte de l&#39;activité de PAD4 dans un format de plaque à 96 puits. Les puits ont été incubés avec la ZRcoum de substrat et en présence / absence de PAD4. Après une période d&#39;incubation de 45 min à 37 ° C, la fluorescence a été mesurée avec un 340/40-475/15 nm filtre (figure 2A). Comme prévu, les niveaux de fluorescence sont restés faibles comme le fluorophore dans ZRcoum</s...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog at JoVE.com

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Suivi par fluorescence de PAD4 activité via un analogue de substrat Pro-fluorescence

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

fluorescence-based-monitoring-pad4-activity-via-pro-fluorescence

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.8K vues.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.