This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4 Transformation, Expression und Reinigung <ol><li> Für PAD4 Transformation, verwandeln den pGEX-Plasmid, das PAD4 GST-Fusions in chemisch kompetente E. Coli (BL21 (DE3)) Zellen zur Proteinexpression unter Verwendung des folgenden Verfahrens. Bereiten chemisch kompetente (Calciumchlorid) E. Coli (BL21 (DE3) Zellen) nach Standardprotokollen. <ol><li> Tau 50 &amp; mgr; l eines zuvor hergestellten chemisch kompetente BL21 (DE3) Zellen auf Eis und mit 1 &amp; mgr; l der Plasmid pGEX enthält PAD4 Gens in einer 5 ml-Kulturröhrchen gemischt. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 10 min unter leichtem Schütteln alle 2 min. </li><li> Hitzeschock der Zellen, indem die Mischung in einem 42 ° C Wasserbad für 40 sec. Unmittelbar danach ist die Zell-Plasmid-Gemisch wieder auf Eis für 2 min, damit die Zellen sich zu erholen. 1 ml steriles LB-Medium zu der Mischung und auf Eis für 1 min. </li><li> Inkubiere die Zellen einem Hitzeschock bei 37 ° C, unter Schütteln bei 250 rpm für 1hr. Je 75 ul der transformierten Zellen auf einer Ampicillin-resistenten Agarplatte und bei 37 ° C für 15 Stunden. Store Platte bei 4 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Expression. <ol><li> Wählen 1 Kolonie von BL21 (DE3) Zellen aus dem Ampicillin-Agar-Platte und in 5 ml LB aus 1x Ampicillin. Platz in Inkubator und schütteln O / N bei 37 ° C. </li><li> Übertragen Sie die 5 ml LB (Starter) in 1 l sterilem LB aus 1x Ampicillintrihydrat (MW 403,45 g / mol). Ort Wachstum in einem 37 ° C Schüttelinkubator. Überwachen Sie die OD 600 des Wachstums. Wenn das Wachstum einer OD 600 von 0,3 erreicht, bewegen Wachstum in 16 ° C Schüttelinkubator. </li><li> Bei Erreichen einer OD 600 von 0,6 induziert, die Zellen mit 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Sodass die Zellen 15 h bei 16 ° C geschüttelt. </li><li> Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 xg für 20 min bei 0 ° C. Überstand abgießen und speichern Pellet bei -80 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Reinigung <ol><li> Re-suspendieren des Pellets, welches das exprimierte PAD4 in BL21 (DE3) Zellen in einem Puffer von 50 mM NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM Imidazol (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) und 1 mM Dithiothreitol (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung für 15 min bei 4 ° C. Folgende Beschallung, zentrifugieren Zelllysat bei 20000 × g für 20 min bei 0 ° C. Abgießen und den Überstand. Batch der Überstand mit Glutathion (GSH) Agaroseperlen für 30 min bei RT. </li><li> Ablassen Stand von GST Perlen / Kolonne über die Schwerkraft. Mit 4 x 25 ml 1x PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH = 8,0) bei RT Waschen Perlen. </li><li> Eluieren PAD4 mit 2 x 10 ml Elutionspuffer, 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM Glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Konzentrieren PAD4 mit 100k MW cut-off Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 4.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Aliquot Protein in 200 ul Volumen in 1,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereiten Lizenzlösungen für Puffer <ol><li> Abwiegen Natriumchlorid (NaCl, MW 58,44 g / mol) und bereiten eine 2 M Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-Base, MW 121,14 g / mol) und bereiten eine 2 M Lösung, pH = 8,0. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Calciumchloriddihydrat (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) und bereiten eine 500 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP, MW 250,19 g / mol) und bereiten eine 200 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. </li><li> Abwiegen Dithiothreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) und bereiten eine 1 M Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. </li><li> Vorbereiteneine 0,5% ige Lösung von Triton X-100. </li><li> Abwiegen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, MW 292,24 g / mol) und bereiten eine 100 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Z- Arg- Arg- 7- amido- 4- methylcoumarin Hydrochlorid (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) und bereiten eine 10 mM Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 Assay bei 37 ° C <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 125 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 125 um ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT und 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, und 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20° C. Dies wird Lösung D. sein </li><li> Besorgen Sie sich eine 96-Well-Platte und Benennung einer Anzahl von Vertiefungen für die Kontrollen (kein PAD4) und Aufschlussbohrungen (+ PAD4). </li><li> Pipette 160 ul der Lösung B in Testbrunnen und Pipette 160 ul Lösung C in Kontrollvertiefungen. Inkubation für 15 min bei 37 ° C. </li><li> Pipette 40 ul der Lösung A in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 45 min. </li><li> Je 10 ul dH 2 O, die Hälfte der Kontrollvertiefungen und die Hälfte der Testschächte. Auf die andere Hälfte der Kontrollvertiefungen und Testkontrollen Pipette 10 ul Lösung D. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 4. PAD4 Assay bei RT <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 50 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 50 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 und 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP und 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung D. sein </li><li> Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte und benennen Vertiefungen für Kontrollen (kein PAD4) und Aufschlussbohrungen (+ PAD4). </li><li> Je 25 ul der Lösung B in Testbrunnen und Pipette 25 ul Lösung C in Kontrollvertiefungen. Ermöglichen Puffer mit / ohne PAD4 in Vertiefungen für 20 min bei RT inkubiert. </li><li> Je 25 ul der Lösung C in alle Vertiefungen und Inkubation für 45 min bei RT. </li><li> Je 10 ul dH 2 O, die Hälfte der Kontrollvertiefungen und die Hälfte der Testschächte. Um die andere Hälfte der Kontrollvertiefungen und Testkontrollen, pipettE 10 ul Lösung D. Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 5. PAD4 Zeitverlauf Assays bei 37 ° C und RT <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 125 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 125 um ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT und 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung C liegen </li><li> Wobei 2 Platten mit 96 Vertiefungen und einer Pipette 160 ul der Lösung B in # Menge von Vertiefungen (# Vertiefungen wird, wie viele Zeitpunkten abhängen). </li><li> Inkubieren einer 96-Well-Platte bei 37 ° C. Inkubieren Sie die anderen 96-Well-Platte bei RT. </li><li> Pipette 40 ul der Lösung A in alle Vertiefungen in beiden 96-Well-Platten und sofort Pipette 10 ul Lösung C in die t = 0 min Brunnen. Fügen Sie weitere 10 ul Lösung C zu bestimmten Zeitpunkten, bis alle Vertiefungen wurden abgeschreckt. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 6. PAD4 Inhibitionsassay bei RT <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 83 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 83 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Abwiegen Cl-Amidin (MW 424,8 g / mol) und bereiten eine 100 uM Stammlösung. Dies wird Lösung B sein </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 und 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP und 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Thist wird Lösung D. sein </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung E. sein </li><li> Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte und benennen Vertiefungen für Kontrollen (kein PAD4), Testbohrungen (+ PAD4) und Hemmung Brunnen (PAD4 + Cl-Amidin). </li><li> Je 25 ul der Lösung C in die Testbohrungen und Pipette 25 ul Lösung D in Kontrollvertiefungen. Ermöglichen Puffer mit / ohne PAD4 in Vertiefungen für 20 min bei RT inkubiert. </li><li> Je 10 ul der Lösung B in Hemmung Vertiefungen pipettieren und für 20 min bei RTE. </li><li> Pipette 15 ul Lösung A in alle Vertiefungen und Inkubation für 45 min bei RT. </li><li> Je 10 ul Lösung E in alle Vertiefungen. Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 7. Rohzelllysat Assaybei RT <ol><li> Nach Ernten der Zellen aus PAD4 1 L Wachstum, Zellen in 10 ml 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) und 1 mM Dithiothreitol (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung für 15 min bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Zelllysat bei 20.000 × g für 20 min bei 0 ° C. Konzentrieren des klaren Überstandes auf das halbe Volumen durch Zentrifugation bei 4.000 rpm bei 4 ° C unter Verwendung von 100K MW cut-off-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 250 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 250 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2 und 2 mM TCEP (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung C liegen </li><li> Besorgen Sie sich einen schwarzen 384-Well-Platte und Designaß Vertiefungen für Kontrollen (kein Zelllysat) und Aufschlussbohrungen (+ Zelllysat). </li><li> Je 100 ul der Lösung B in alle Vertiefungen und Pipetten 60 ul Zelllysat in Testbohrungen. Inkubation für 20 min bei RT. </li><li> Pipette 40 ul der Lösung A in jede Vertiefung und Inkubation für 45 min bei RT. </li><li> Je 10 ul der Lösung C in alle Vertiefungen. Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Besorgen Sie sich eine Fluoreszenz Lesen auf multimodale Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

Eine Vielzahl von Säugetier-Proteine ​​sind stark durch die Wirkung von Enzymen nach der Biosynthese von Proteinen durch das Ribosom modifiziert. Diese post-translationale Modifikationen (PTM) kann die Funktionsvielfalt des Proteoms stark erhöhen, indem Sie die Größe, Ladung, Struktur und Oligomerisierungszustand (neben weiteren Funktionen) von Proteinen 1-3. Als Ergebnis kann die Änderung in der Proteinstruktur zu physiologischen Folgen, wie Protein-Abbau, Zelldifferenzierung, die Signalisierung, die Modulation der Genexpression und Protein-Protein-Wechselwirkungen führen. Obwohl diese Modifikationen sind weit verbreitet in einer großen Prozentsatz aller menschlichen Proteine, die Anschlußenden von Histonen eine ungewöhnlich hohe Anzahl von kovalenten Modifikationen 4 unterzogen. Histon-Proteine ​​sind eine Familie von Strukturproteinen, die die Kondensation von genomischer DNA erleichtern. Kovalente Modifikationen der unstrukturierten Histone werden durch eine Serie durchgeführt und geregelts von Enzymen, die die kovalente Modifikation von Rückständen (Schriftsteller) katalysieren können, kehren Sie die gleichen Modifikationen (Radiergummis) und unterscheiden zwischen den Veränderungen, die auf die Histon-Enden (Leser) 5-7 druckt. Tatsächlich sind die meisten der bekannten PTMs kann innerhalb dieses kurzen Segment des Histon einschließlich Methylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, sumoylation, Ubiquitinierung und Citrullinierung 8 beobachtet werden. Citrullinierung beinhaltet die Umwandlung von Peptidyl-Arginin in den nicht t-RNA kodiert Peptidyl-Citrullin (1A). Die Proteine, für diese Seitenketten Neutralisierung verantwortlich sind Mitglieder der PAD (p eptide eine rginine d eiminase) Proteinfamilie, die alle calciumabhängigen Enzymen. 9,10. Bisher fünf Mitglieder der PAD-Familie beschrieben (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 und PAD6). Jedes Mitglied dieser Familie scheint deutliche zelluläre Zielproteine ​​und zeigt auch unique Gewebeverteilungsprofile. PAD4 ist das einzige Mitglied dieser Proteinfamilie bekannt, innerhalb des Kerns über eine Kernlokalisierungssequenz 11 lokalisiert werden. Dementsprechend wurde gezeigt, um eine Anzahl von Kern Ziele, einschließlich Arginin-Seitenketten an den N-Termini von Histonen H2A Argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 und H3R26) und H4 (H4R3) 12 deiminate, 13. Während jede der PAD-Isoenzyme haben spezielle und kritische physiologische Funktionen hat PAD4 erheblich mehr Aufmerksamkeit aufgrund seiner Rolle bei einer Anzahl von menschlichen Prozesse sowohl in kranken und gesunden Zellen erhalten. Vor kurzem wurde gezeigt, PAD4 Mitglied der Pluripotenz Transkriptionsnetzwerk 14 ist. Beide PAD4 Expressionsniveaus und Aktivität wurde gezeigt, dass während der Umprogrammierung und Grundzustands pluripotenten Zustände bei Mäusen erhöht werden. Durch die Steuerung der Regulierung der Stammzellen Genen kann PAD4 eine zentrale Rolle in der zellulären Anpassung Effizienz beizubehalten. PAD4 wurde auch in den in Verbindung gebrachtBildung von neutrophilen Extracellular Traps, die bei der Bindung von Krankheitserregern ermöglichen ihr System-Clearance. Die hypercitrullination von Histon-Proteinen durch PAD4 induziert Dekondensation des Chromatins, die als Basismaterial für die Verkapselung von pathogenen Bakterien, die durch die extrazelluläre Falle dient, wodurch die Abwehr von bakteriellen Infektionen 15,16. Zusätzlich PAD4 wurde gefunden, daß eine aktive Rolle bei einer Reihe von Krankheiten beim Menschen spielen. Es wurde zuvor gezeigt, dass aberrante Expression PAD4 wird mit dem Beginn und die Schwere von rheumatoider Arthritis, Alzheimer, Parkinson-Krankheit und Multiple Sklerose 17. In der Tat ist die Anwesenheit von Anti-Protein-Antikörper citrullinated ist einer der verlässlichsten und definitive diagnostische und prognostische Biomarker von rheumatoider Arthritis 18. Ebenso hat dysreguliert PAD4 Aktivität kürzlich in einer Reihe von menschlichen Krebsarten, einschließlich Eierstock-, Brust-, Lungen-, einer beobachtetd Speiseröhrenkrebs 19-22. Die Verbindung zwischen PAD4 und Krebs wurde gezeigt, dass durch die ELK1 Onkogen oder über das p53-Tumorsuppressor-Protein 22,23 vermittelt werden und frühere Arbeiten vorgeschlagen, PAD4 konnte eine neuartige Anti-Krebs therapeutisches Ziel 17,24,25 sein. Als Beweis des Prinzips Studie wurde die Erschöpfung der PAD4 über shRNA in kolorektalen Krebszelllinie HCT116 ergab ausreichend zur Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest 26 zu sein. Eine kürzlich entwickelte irreversible PAD4 Inhibitor zu einer siebzig Prozent Reduktion der Tumormasse bei Mäusen 27. Bemerkenswerterweise erschien PAD4 Hemmung als zielgerichtete Therapie, die in selektiven Abtötung von Krebszellen führte unter Schonung nicht transformierten Zellen wirken. Die Verwendung von kleinen Molekülen zum Ausschalten der Funktion PAD4 könnte sich als eine leistungsfähige neue Strategie gezielt Krebszellen oder an bestehende Krebschemotherapeutika 28 erweitern können. Leider ist ein poZelt reversible PAD4 Inhibitor wurde noch entdeckt zu werden. Eine Reihe von kovalenten Inhibitoren mit der Chlor / Fluor imidine Griff, die Arginin Substrat 27,29,30 nachahmt und haben sich als praktische Instrumente für das Verständnis der Rolle der PAD4 sowohl bei gesunden und kranken Zustand Zellen entwickelt. Allerdings sind diese Moleküle inhibieren alle aktiven Pads mit ähnlicher Potenz. Daher ist die Notwendigkeit für einen einfachen Test, der auf die Aktivität des PAD4 berichtet entscheidend. Bisher wurden PAD4 Assays beschrieben worden, die die Freisetzung von Ammoniak aus der Reaktion auf einen kolorimetrischen Anzeige 31 zu verbinden, verwenden einen fluoreszierend markierten Substrates chloroamidine analog zur Fluoreszenzpolarisationsassay 32, sich auf die Säure-katalysierten Reaktion zwischen Glyoxal und Citrullin 33 und Koppeln der PAD4 Aktivität zu einer Fluoreszenz Dequenching Schritt 34. Davon sind nur die kovalente Modifizierungs haloacetamidine Strategie hat sich mit High-Throughput SCRE kompatibel zu seinkung Plattformen 32,35,36. Wir beschreiben eine einfache fluoreszenzbasierten Assays, die die Aktivität PAD4 misst zuverlässig. Der Assay, der ein starkes Signal-zu-Rauschverhältnis, die Geschwindigkeit der Analyse und Robustheit der Messung zeigt, hat das Potential, ein wirklich wirksamer und selektiver Inhibitor PAD4 entdecken.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.amresco-inc.com/&quot;&gt;http://www.amresco-inc.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/&quot;&gt;http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/&quot;&gt;http://www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>All Buffer Salts&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td></tr><tr><td>Protino Glutathione (GSH) agarose&amp;nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Store at 4 &amp;deg;C; http://www.mn-net.com/</td></tr><tr><td>Chloroamidine&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemical&amp;nbsp;</td><td>10599</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td><td></td><td></td><td>Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.tecan.com/&quot;&gt;www.tecan.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.perkinelmer.com/&quot;&gt;http://www.perkinelmer.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

Ursprünglich wurde gezeigt, dass ZRcoum kann auf die Aktivität des PAD4 in einer 96-Well-Plattenformat melden. Vertiefungen wurden mit dem Substrat ZRcoum und in der Gegenwart / Abwesenheit von PAD4 inkubiert. 475/15 nm-Filter (2A) - Nach einer Inkubationszeit von 45 min bei 37 ° C wurde die Fluoreszenz mit einem 340/40 gemessen. Wie erwartet, werden die Fluoreszenzniveaus niedrig blieb als Fluorophor innerhalb ZRcoum (oder der citrullinated ...

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Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

fluorescence-based-monitoring-pad4-activity-via-pro-fluorescence

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.9K Aufrufe.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Serie: Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Forschung

Biotechnik

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Biochemie

cAMP-Analyse mit cADDis: Einzelzell- bis Hochdurchsatz-Screening

Real-Time cAMP Dynamics in Live Cells Using the Fluorescent cAMP Difference Detector In Situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is created from a circularly permuted fluorescent protein linked to the hinge region of Epac2. This creates a single fluorophore biosensor that displays either increased or decreased fluorescence upon binding of cAMP. The biosensor exists in red and green upward versions, as well as green downward versions, and several red and green versions targeted to subcellular locations. To illustrate the effectiveness of the biosensor, the green downward version, which decreases in fluorescence upon cAMP binding, was used. Two protocols using this sensor are demonstrated: one utilizing a 96-well plate reading spectrophotometer&#160;compatible with high-throughput screening and another utilizing single-cell imaging on a fluorescent microscope. On the plate reader, HEK-293 cells cultured in 96-well plates were stimulated with 10 &#181;M forskolin or 10 nM isoproterenol, which induced rapid and large decreases in fluorescence in the green downward version. The biosensor was used to measure cAMP levels in individual human airway smooth muscle (HASM) cells monitored under a fluorescent microscope. The green downward biosensor displayed similar responses to populations of cells when stimulated with forskolin or isoproterenol. This single-cell assay allows visualization of the biosensor location at 20x and 40x magnification. Thus, this cAMP biosensor is sensitive and flexible, allowing real-time measurement of cAMP in both immortalized and primary cells, and with single cells or populations of cells. These attributes make cADDis a valuable tool for studying cAMP signaling dynamics in living cells.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Echtzeit-cAMP-Detektion in Zellen mit dem cADDis-Biosensor

The protocol presented in this study illustrates the effectiveness of the cAMP Difference Detector In Situ in measuring cAMP through two methods. One method utilizes a 96-well plate reading spectrophotometer with HEK-293 cells. The other method demonstrates individual HASM cells under a fluorescent microscope.

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Biologie

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Zusammenfassung

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Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

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Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel