This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4 Transformation, Expression und Reinigung <ol><li> Für PAD4 Transformation, verwandeln den pGEX-Plasmid, das PAD4 GST-Fusions in chemisch kompetente E. Coli (BL21 (DE3)) Zellen zur Proteinexpression unter Verwendung des folgenden Verfahrens. Bereiten chemisch kompetente (Calciumchlorid) E. Coli (BL21 (DE3) Zellen) nach Standardprotokollen. <ol><li> Tau 50 &amp; mgr; l eines zuvor hergestellten chemisch kompetente BL21 (DE3) Zellen auf Eis und mit 1 &amp; mgr; l der Plasmid pGEX enthält PAD4 Gens in einer 5 ml-Kulturröhrchen gemischt. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 10 min unter leichtem Schütteln alle 2 min. </li><li> Hitzeschock der Zellen, indem die Mischung in einem 42 ° C Wasserbad für 40 sec. Unmittelbar danach ist die Zell-Plasmid-Gemisch wieder auf Eis für 2 min, damit die Zellen sich zu erholen. 1 ml steriles LB-Medium zu der Mischung und auf Eis für 1 min. </li><li> Inkubiere die Zellen einem Hitzeschock bei 37 ° C, unter Schütteln bei 250 rpm für 1hr. Je 75 ul der transformierten Zellen auf einer Ampicillin-resistenten Agarplatte und bei 37 ° C für 15 Stunden. Store Platte bei 4 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Expression. <ol><li> Wählen 1 Kolonie von BL21 (DE3) Zellen aus dem Ampicillin-Agar-Platte und in 5 ml LB aus 1x Ampicillin. Platz in Inkubator und schütteln O / N bei 37 ° C. </li><li> Übertragen Sie die 5 ml LB (Starter) in 1 l sterilem LB aus 1x Ampicillintrihydrat (MW 403,45 g / mol). Ort Wachstum in einem 37 ° C Schüttelinkubator. Überwachen Sie die OD 600 des Wachstums. Wenn das Wachstum einer OD 600 von 0,3 erreicht, bewegen Wachstum in 16 ° C Schüttelinkubator. </li><li> Bei Erreichen einer OD 600 von 0,6 induziert, die Zellen mit 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Sodass die Zellen 15 h bei 16 ° C geschüttelt. </li><li> Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 xg für 20 min bei 0 ° C. Überstand abgießen und speichern Pellet bei -80 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Reinigung <ol><li> Re-suspendieren des Pellets, welches das exprimierte PAD4 in BL21 (DE3) Zellen in einem Puffer von 50 mM NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM Imidazol (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) und 1 mM Dithiothreitol (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung für 15 min bei 4 ° C. Folgende Beschallung, zentrifugieren Zelllysat bei 20000 × g für 20 min bei 0 ° C. Abgießen und den Überstand. Batch der Überstand mit Glutathion (GSH) Agaroseperlen für 30 min bei RT. </li><li> Ablassen Stand von GST Perlen / Kolonne über die Schwerkraft. Mit 4 x 25 ml 1x PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH = 8,0) bei RT Waschen Perlen. </li><li> Eluieren PAD4 mit 2 x 10 ml Elutionspuffer, 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM Glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Konzentrieren PAD4 mit 100k MW cut-off Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 4.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Aliquot Protein in 200 ul Volumen in 1,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereiten Lizenzlösungen für Puffer <ol><li> Abwiegen Natriumchlorid (NaCl, MW 58,44 g / mol) und bereiten eine 2 M Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-Base, MW 121,14 g / mol) und bereiten eine 2 M Lösung, pH = 8,0. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Calciumchloriddihydrat (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) und bereiten eine 500 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP, MW 250,19 g / mol) und bereiten eine 200 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. </li><li> Abwiegen Dithiothreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) und bereiten eine 1 M Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. </li><li> Vorbereiteneine 0,5% ige Lösung von Triton X-100. </li><li> Abwiegen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, MW 292,24 g / mol) und bereiten eine 100 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar. </li><li> Abwiegen Z- Arg- Arg- 7- amido- 4- methylcoumarin Hydrochlorid (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) und bereiten eine 10 mM Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 Assay bei 37 ° C <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 125 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 125 um ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT und 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, und 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20° C. Dies wird Lösung D. sein </li><li> Besorgen Sie sich eine 96-Well-Platte und Benennung einer Anzahl von Vertiefungen für die Kontrollen (kein PAD4) und Aufschlussbohrungen (+ PAD4). </li><li> Pipette 160 ul der Lösung B in Testbrunnen und Pipette 160 ul Lösung C in Kontrollvertiefungen. Inkubation für 15 min bei 37 ° C. </li><li> Pipette 40 ul der Lösung A in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 45 min. </li><li> Je 10 ul dH 2 O, die Hälfte der Kontrollvertiefungen und die Hälfte der Testschächte. Auf die andere Hälfte der Kontrollvertiefungen und Testkontrollen Pipette 10 ul Lösung D. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 4. PAD4 Assay bei RT <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 50 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 50 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 und 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP und 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung D. sein </li><li> Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte und benennen Vertiefungen für Kontrollen (kein PAD4) und Aufschlussbohrungen (+ PAD4). </li><li> Je 25 ul der Lösung B in Testbrunnen und Pipette 25 ul Lösung C in Kontrollvertiefungen. Ermöglichen Puffer mit / ohne PAD4 in Vertiefungen für 20 min bei RT inkubiert. </li><li> Je 25 ul der Lösung C in alle Vertiefungen und Inkubation für 45 min bei RT. </li><li> Je 10 ul dH 2 O, die Hälfte der Kontrollvertiefungen und die Hälfte der Testschächte. Um die andere Hälfte der Kontrollvertiefungen und Testkontrollen, pipettE 10 ul Lösung D. Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 5. PAD4 Zeitverlauf Assays bei 37 ° C und RT <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 125 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 125 um ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT und 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung C liegen </li><li> Wobei 2 Platten mit 96 Vertiefungen und einer Pipette 160 ul der Lösung B in # Menge von Vertiefungen (# Vertiefungen wird, wie viele Zeitpunkten abhängen). </li><li> Inkubieren einer 96-Well-Platte bei 37 ° C. Inkubieren Sie die anderen 96-Well-Platte bei RT. </li><li> Pipette 40 ul der Lösung A in alle Vertiefungen in beiden 96-Well-Platten und sofort Pipette 10 ul Lösung C in die t = 0 min Brunnen. Fügen Sie weitere 10 ul Lösung C zu bestimmten Zeitpunkten, bis alle Vertiefungen wurden abgeschreckt. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 6. PAD4 Inhibitionsassay bei RT <ol><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 83 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 83 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Abwiegen Cl-Amidin (MW 424,8 g / mol) und bereiten eine 100 uM Stammlösung. Dies wird Lösung B sein </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 und 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP und 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Thist wird Lösung D. sein </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung E. sein </li><li> Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte und benennen Vertiefungen für Kontrollen (kein PAD4), Testbohrungen (+ PAD4) und Hemmung Brunnen (PAD4 + Cl-Amidin). </li><li> Je 25 ul der Lösung C in die Testbohrungen und Pipette 25 ul Lösung D in Kontrollvertiefungen. Ermöglichen Puffer mit / ohne PAD4 in Vertiefungen für 20 min bei RT inkubiert. </li><li> Je 10 ul der Lösung B in Hemmung Vertiefungen pipettieren und für 20 min bei RTE. </li><li> Pipette 15 ul Lösung A in alle Vertiefungen und Inkubation für 45 min bei RT. </li><li> Je 10 ul Lösung E in alle Vertiefungen. Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol> 7. Rohzelllysat Assaybei RT <ol><li> Nach Ernten der Zellen aus PAD4 1 L Wachstum, Zellen in 10 ml 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) und 1 mM Dithiothreitol (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung für 15 min bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Zelllysat bei 20.000 × g für 20 min bei 0 ° C. Konzentrieren des klaren Überstandes auf das halbe Volumen durch Zentrifugation bei 4.000 rpm bei 4 ° C unter Verwendung von 100K MW cut-off-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 250 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 250 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein </li><li> Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2 und 2 mM TCEP (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein </li><li> Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung C liegen </li><li> Besorgen Sie sich einen schwarzen 384-Well-Platte und Designaß Vertiefungen für Kontrollen (kein Zelllysat) und Aufschlussbohrungen (+ Zelllysat). </li><li> Je 100 ul der Lösung B in alle Vertiefungen und Pipetten 60 ul Zelllysat in Testbohrungen. Inkubation für 20 min bei RT. </li><li> Pipette 40 ul der Lösung A in jede Vertiefung und Inkubation für 45 min bei RT. </li><li> Je 10 ul der Lösung C in alle Vertiefungen. Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Besorgen Sie sich eine Fluoreszenz Lesen auf multimodale Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

Eine Vielzahl von Säugetier-Proteine ​​sind stark durch die Wirkung von Enzymen nach der Biosynthese von Proteinen durch das Ribosom modifiziert. Diese post-translationale Modifikationen (PTM) kann die Funktionsvielfalt des Proteoms stark erhöhen, indem Sie die Größe, Ladung, Struktur und Oligomerisierungszustand (neben weiteren Funktionen) von Proteinen 1-3. Als Ergebnis kann die Änderung in der Proteinstruktur zu physiologischen Folgen, wie Protein-Abbau, Zelldifferenzierung, die Signalisierung, die Modulation der Genexpression und Protein-Protein-Wechselwirkungen führen. Obwohl diese Modifikationen sind weit verbreitet in einer großen Prozentsatz aller menschlichen Proteine, die Anschlußenden von Histonen eine ungewöhnlich hohe Anzahl von kovalenten Modifikationen 4 unterzogen. Histon-Proteine ​​sind eine Familie von Strukturproteinen, die die Kondensation von genomischer DNA erleichtern. Kovalente Modifikationen der unstrukturierten Histone werden durch eine Serie durchgeführt und geregelts von Enzymen, die die kovalente Modifikation von Rückständen (Schriftsteller) katalysieren können, kehren Sie die gleichen Modifikationen (Radiergummis) und unterscheiden zwischen den Veränderungen, die auf die Histon-Enden (Leser) 5-7 druckt. Tatsächlich sind die meisten der bekannten PTMs kann innerhalb dieses kurzen Segment des Histon einschließlich Methylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, sumoylation, Ubiquitinierung und Citrullinierung 8 beobachtet werden. Citrullinierung beinhaltet die Umwandlung von Peptidyl-Arginin in den nicht t-RNA kodiert Peptidyl-Citrullin (1A). Die Proteine, für diese Seitenketten Neutralisierung verantwortlich sind Mitglieder der PAD (p eptide eine rginine d eiminase) Proteinfamilie, die alle calciumabhängigen Enzymen. 9,10. Bisher fünf Mitglieder der PAD-Familie beschrieben (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 und PAD6). Jedes Mitglied dieser Familie scheint deutliche zelluläre Zielproteine ​​und zeigt auch unique Gewebeverteilungsprofile. PAD4 ist das einzige Mitglied dieser Proteinfamilie bekannt, innerhalb des Kerns über eine Kernlokalisierungssequenz 11 lokalisiert werden. Dementsprechend wurde gezeigt, um eine Anzahl von Kern Ziele, einschließlich Arginin-Seitenketten an den N-Termini von Histonen H2A Argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 und H3R26) und H4 (H4R3) 12 deiminate, 13. Während jede der PAD-Isoenzyme haben spezielle und kritische physiologische Funktionen hat PAD4 erheblich mehr Aufmerksamkeit aufgrund seiner Rolle bei einer Anzahl von menschlichen Prozesse sowohl in kranken und gesunden Zellen erhalten. Vor kurzem wurde gezeigt, PAD4 Mitglied der Pluripotenz Transkriptionsnetzwerk 14 ist. Beide PAD4 Expressionsniveaus und Aktivität wurde gezeigt, dass während der Umprogrammierung und Grundzustands pluripotenten Zustände bei Mäusen erhöht werden. Durch die Steuerung der Regulierung der Stammzellen Genen kann PAD4 eine zentrale Rolle in der zellulären Anpassung Effizienz beizubehalten. PAD4 wurde auch in den in Verbindung gebrachtBildung von neutrophilen Extracellular Traps, die bei der Bindung von Krankheitserregern ermöglichen ihr System-Clearance. Die hypercitrullination von Histon-Proteinen durch PAD4 induziert Dekondensation des Chromatins, die als Basismaterial für die Verkapselung von pathogenen Bakterien, die durch die extrazelluläre Falle dient, wodurch die Abwehr von bakteriellen Infektionen 15,16. Zusätzlich PAD4 wurde gefunden, daß eine aktive Rolle bei einer Reihe von Krankheiten beim Menschen spielen. Es wurde zuvor gezeigt, dass aberrante Expression PAD4 wird mit dem Beginn und die Schwere von rheumatoider Arthritis, Alzheimer, Parkinson-Krankheit und Multiple Sklerose 17. In der Tat ist die Anwesenheit von Anti-Protein-Antikörper citrullinated ist einer der verlässlichsten und definitive diagnostische und prognostische Biomarker von rheumatoider Arthritis 18. Ebenso hat dysreguliert PAD4 Aktivität kürzlich in einer Reihe von menschlichen Krebsarten, einschließlich Eierstock-, Brust-, Lungen-, einer beobachtetd Speiseröhrenkrebs 19-22. Die Verbindung zwischen PAD4 und Krebs wurde gezeigt, dass durch die ELK1 Onkogen oder über das p53-Tumorsuppressor-Protein 22,23 vermittelt werden und frühere Arbeiten vorgeschlagen, PAD4 konnte eine neuartige Anti-Krebs therapeutisches Ziel 17,24,25 sein. Als Beweis des Prinzips Studie wurde die Erschöpfung der PAD4 über shRNA in kolorektalen Krebszelllinie HCT116 ergab ausreichend zur Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest 26 zu sein. Eine kürzlich entwickelte irreversible PAD4 Inhibitor zu einer siebzig Prozent Reduktion der Tumormasse bei Mäusen 27. Bemerkenswerterweise erschien PAD4 Hemmung als zielgerichtete Therapie, die in selektiven Abtötung von Krebszellen führte unter Schonung nicht transformierten Zellen wirken. Die Verwendung von kleinen Molekülen zum Ausschalten der Funktion PAD4 könnte sich als eine leistungsfähige neue Strategie gezielt Krebszellen oder an bestehende Krebschemotherapeutika 28 erweitern können. Leider ist ein poZelt reversible PAD4 Inhibitor wurde noch entdeckt zu werden. Eine Reihe von kovalenten Inhibitoren mit der Chlor / Fluor imidine Griff, die Arginin Substrat 27,29,30 nachahmt und haben sich als praktische Instrumente für das Verständnis der Rolle der PAD4 sowohl bei gesunden und kranken Zustand Zellen entwickelt. Allerdings sind diese Moleküle inhibieren alle aktiven Pads mit ähnlicher Potenz. Daher ist die Notwendigkeit für einen einfachen Test, der auf die Aktivität des PAD4 berichtet entscheidend. Bisher wurden PAD4 Assays beschrieben worden, die die Freisetzung von Ammoniak aus der Reaktion auf einen kolorimetrischen Anzeige 31 zu verbinden, verwenden einen fluoreszierend markierten Substrates chloroamidine analog zur Fluoreszenzpolarisationsassay 32, sich auf die Säure-katalysierten Reaktion zwischen Glyoxal und Citrullin 33 und Koppeln der PAD4 Aktivität zu einer Fluoreszenz Dequenching Schritt 34. Davon sind nur die kovalente Modifizierungs haloacetamidine Strategie hat sich mit High-Throughput SCRE kompatibel zu seinkung Plattformen 32,35,36. Wir beschreiben eine einfache fluoreszenzbasierten Assays, die die Aktivität PAD4 misst zuverlässig. Der Assay, der ein starkes Signal-zu-Rauschverhältnis, die Geschwindigkeit der Analyse und Robustheit der Messung zeigt, hat das Potential, ein wirklich wirksamer und selektiver Inhibitor PAD4 entdecken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="716">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:192px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td>
			<td style="width:123px;">Amresco</td>
			<td style="width:135px;">J106-2KG</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:192px;">Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP902-25&#160;</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:192px;">Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technogolies</td>
			<td>15529-019</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:192px;">All Buffer Salts&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:192px;">Protino Glutathione (GSH) agarose&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Machery-Nagel</td>
			<td style="width:135px;">745500.10</td>
			<td style="width:267px;">Store at 4 &#176;C; http://www.mn-net.com/</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Z-&#8203;Arg-&#8203;Arg-&#8203;7-&#8203;amido-&#8203;4-&#8203;methylcoumarin hydrochloride (Zcoum)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C5429</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:192px;">Chloroamidine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Cayman Chemical&#160;</td>
			<td style="width:135px;">10599</td>
			<td style="width:267px;">Store at -20 &#176;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">Tris(2-&#8203;carboxyethyl)&#8203;phosphine hydrochloride (TCEP HCl)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientifc</td>
			<td style="width:135px;">20490</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.piercenet.com/">http://www.piercenet.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:192px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

Ursprünglich wurde gezeigt, dass ZRcoum kann auf die Aktivität des PAD4 in einer 96-Well-Plattenformat melden. Vertiefungen wurden mit dem Substrat ZRcoum und in der Gegenwart / Abwesenheit von PAD4 inkubiert. 475/15 nm-Filter (2A) - Nach einer Inkubationszeit von 45 min bei 37 ° C wurde die Fluoreszenz mit einem 340/40 gemessen. Wie erwartet, werden die Fluoreszenzniveaus niedrig blieb als Fluorophor innerhalb ZRcoum (oder der citrullinated ...

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Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.8K Aufrufe.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Serie: Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Forschung

Chemie

Preparing Silica Aerogel Monoliths via a Rapid Supercritical Extraction Method

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The procedure requires 15-20 min of preparation time, during which a liquid precursor mixture is prepared and poured into wells of a metal mold that is placed between the platens of a hydraulic hot press, followed by several hours of processing within the hot press. The precursor solution consists of a 1.0:12.0:3.6:3.5 x 10-3 molar ratio of tetramethylorthosilicate (TMOS):methanol:water:ammonia. In each well of the mold, a porous silica sol-gel matrix forms. As the temperature of the mold and its contents is increased, the pressure within the mold rises. After the temperature/pressure conditions surpass the supercritical point for the solvent within the pores of the matrix (in this case, a methanol/water mixture), the supercritical fluid is released, and monolithic aerogel remains within the wells of the mold. With the mold used in this procedure, cylindrical monoliths of 2.2 cm diameter and 1.9 cm height are produced. Aerogels formed by this rapid method have comparable properties (low bulk and skeletal density, high surface area, mesoporous morphology) to those prepared by other methods that involve either additional reaction steps or solvent extractions (lengthier processes that generate more chemical waste).The rapid supercritical extraction method can also be applied to the fabrication of aerogels based on other precursor recipes.

This article describes a rapid supercritical extraction method for fabricating silica aerogels. By utilizing a confined mold and hydraulic hot press, monolithic aerogels can be made in eight hours or less.

Vorbereiten Silica Aerogel Monolithen über eine schnelle Überkritische Extraktion-Methode

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The ...

Real-time Monitoring of Reactions Performed Using Continuous-flow Processing: The Preparation of 3-Acetylcoumarin as an Example

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible to ensure consistent product quality over time using this technique. We here show how to interface a commercially available flow unit with a Raman spectrometer. The Raman flow cell is placed after the back-pressure regulator, meaning that it can be operated at atmospheric pressure. In addition, the fact that the product stream passes through a length of tubing before entering the flow cell means that the material is at RT. It is important that the spectra are acquired under isothermal conditions since Raman signal intensity is temperature dependent. Having assembled the apparatus, we then show how to monitor a chemical reaction, the piperidine-catalyzed synthesis of 3-acetylcoumarin from salicylaldehyde and ethyl acetoacetate being used as an example. The reaction can be performed over a range of flow rates and temperatures, the in-situ monitoring tool being used to optimize conditions simply and easily.

Real-time monitoring allows for fast optimization of reactions performed using continuous-flow processing. Here the preparation of 3-acetylcoumarin is used as an example. The apparatus for performing in-situ Raman monitoring is described, as are the steps required to optimize the reaction.

Echtzeit-Überwachung von Reaktionen durchgeführt mit Continuous-Flow-Verarbeitung: Die Herstellung von 3-Acetylcoumarin als Beispiel

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is the most studied granzyme in humans and mice and therefore, researchers need specific and reliable tools to study its function and role in pathophysiology. This especially necessitates assays that do not recognize proteases such as caspases or other granzymes that are structurally or functionally related. Here, we apply GzmB&#8217;s preference for cleavage after aspartic acid residues in a colorimetric assay using the peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is the only mammalian serine protease capable of cleaving this substrate. The substrate is cleaved with similar efficiency by human, mouse and rat GzmB, a property not shared by other commercially available peptide substrates, even some that are advertised as being suitable for this purpose. This protocol is demonstrated using unfractionated lysates from activated NK cells or CTL and is also suitable for recombinant proteases generated in a variety of prokaryotic and eukaryotic systems, provided the correct controls are used. This assay is a highly specific method to ascertain the potential pro-apoptotic activity of cytotoxic molecules in mammalian lymphocytes, and of their recombinant counterparts expressed by a variety of methodologies.

We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.

Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

Eine Methode, die Oberflächenspannung eines Liquid Metal manipulieren via Oberfläche Oxidation und Reduktion

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

Gleichzeitige Messung von HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit in HeLa-Zellen mit UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Fabrication and Testing of Catalytic Aerogels Prepared Via Rapid Supercritical Extraction

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three preparation methods are described: (a) the incorporation of metal salts into silica or alumina wet gels using an impregnation method; (b) the incorporation of metal salts into alumina wet gels using a co-precursor method; and (c) the addition of metal nanoparticles directly into a silica aerogel precursor mixture. The methods utilize a hydraulic hot press, which allows for rapid (&#60;6 h) supercritical extraction and results in aerogels of low density (0.10 g/mL) and high surface area (200-800 m2/g). While the work presented here focuses on the use of copper salts and copper nanoparticles, the approach can be implemented using other metal salts and nanoparticles. A protocol for testing the three-way catalytic ability of these aerogels for automotive pollution mitigation is also presented. This technique uses custom-built equipment, the Union Catalytic Testbed (UCAT), in which a simulated exhaust mixture is passed over an aerogel sample at a controlled temperature and flow rate. The system is capable of measuring the ability of the catalytic aerogels, under both oxidizing and reducing conditions, to convert CO, NO and unburned hydrocarbons (HCs) to less harmful species (CO2, H2O and N2). Example catalytic results are presented for the aerogels described.

Here we present protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms. Methods for preparing materials using copper salts and copper-containing nanoparticles are featured. Catalytic testing protocols demonstrate the effectiveness of these aerogels for three-way catalysis applications.

Herstellung und Prüfung von katalytischen Aerogelen über schnelle überkritische Extraktion vorbereitet

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.

Synthese von Substrat-gebundenen Au Nanodrähten über eine aktive Oberfläche Wachstumsmechanismus

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the reaction is commonly performed using chlorinated or amide solvent systems, which are hazardous to human health and the environment. Our methodology utilizes acetonitrile as a greener and less hazardous solvent system. This protocol exhibits rates and yields that are comparable to traditional solvent systems and employs an extraction and wash sequence that eliminates the need for the purification of the ester product via column chromatography. This general method can be used to couple a variety of carboxylic acids with 1&#176; and 2&#176; aliphatic alcohols, benzylic and allylic alcohols, and phenols to obtain pure esters in high yields. The goal of the protocol detailed here is to provide a greener alternative to a common esterification reaction, which could serve useful for ester synthesis in both academic and industrial applications.

A modified Steglich esterification reaction was used to synthesize a small library of ester derivatives with primary and secondary alcohols. The methodology uses a non-halogenated and greener solvent, acetonitrile, and enables product isolation in high yields without the need for chromatographic purification.

Synthese von Estern über ein grüner Steglich-Veresterung in Acetonitril

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

NMR-based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...