This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4 טרנספורמציה, ביטוי, וטיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשינוי PAD4, להפוך את הפלסמיד pGEX מכיל היתוך GST PAD4 לא כימי המוסמך תאי coli (BL21 (DE3)) לביטוי חלבון באמצעות ההליך הבא. הכן (סידן כלורי) כימי המוסמך E. תאי coli (BL21 (DE3)) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי 50 μl של BL21 כימי המוסמך שהוכן קודם לכן (DE3) תאים על קרח ולערבב עם 1 μl של פלסמיד המכיל גן pGEX PAD4 בצינור תרבות 5 מיליליטר. דגירה את התערובת על קרח למשך 10 דקות תוך רעד כל 2 דקות בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Heat Shock התאים על ידי הצבת את התערובת באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 40 שניות. מייד מניח את תערובת התא-פלסמיד חזרה על קרח במשך 2 דקות, כדי לאפשר לתאים להתאושש. הוסף 1 מיליליטר של מרק LB סטרילי לתערובת ומניח על קרח 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חום הלם תאים על 37 מעלות צלזיוס, הרועדת ב 250 סל&quot;ד 1שעות. פיפטה 75 μl של התאים הופכים על צלחת אגר עמידה אמפיצילין ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות. צלחת חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי PAD4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה 1 של BL21 תאים (DE3) מהצלחת אגר אמפיצילין והמקום ב 5 מיליליטר של LB המכיל אמפיצילין 1x. מקום חממה ולנער O / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 מיליליטר של LB (מתנע) ל1 ליטר של LB סטרילי המכיל trihydrate אמפיצילין 1x (MW 403.45 g / mol). צמיחה במקום רועד חממת 37 מעלות צלזיוס. צג OD 600 של הצמיחה. כאשר צמיחה מגיעה OD של 600 0.3, להעביר צמיחה ל- 16 מעלות צלזיוס רועדות חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הגיע OD 600 של 0.6, משרה את התאים עם 0.3 isopropylthiagalactoside מ&quot;מ (IPTG, ז MW 238.30 / mol). אפשר תאים לנער במשך 15 שעות על 16 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב4,000 XG במשך 20 דקות ב 0 מעלות צלזיוס. יוצקים את supernatant וגלול חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור PAD4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות את גלולה המכילה את PAD4 בא לידי ביטוי בBL21 (DE3) תאים במאגר של 50 מ&quot;מ NaCl (MW 58.44 g / mol), 300 מ&quot;מ לאא 2 PO 4 (MW 119.98 g / mol), 10 מ&quot;מ Imidazole (MW 68.077 ז /, 0.1 פלואוריד phenylmethylsulfonyl מ&quot;מ (PMSF, MW 174.94 g / mol) וdithiothreitol 1 מ&quot;מ (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8.0 mol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים באמצעות sonication במשך 15 דקות ב 4 ° C. בעקבות sonication, צנטריפוגה lysate התא ב20,000 XG במשך 20 דקות ב 0 מעלות צלזיוס. יוצקים את ולשמור supernatant. אצווה supernatant עם חרוזים agarose גלוטתיון (GSH) למשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים supernatant מGST חרוזים / טור באמצעות כוח משיכה. לשטוף חרוזים עם 4 x 25 מיליליטר של 1x PBS (בופר פוספט, pH = 8.0) בשעה RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute PAD4 עם 2 x 10 מיליליטר חיץ elution, aminomethane 50 טריס מ&quot;מ (hydroxymethyl) (טריס בסיס, MW 121.14 g / mol), 10 גלוטתיון מ&quot;מ (GSH, ז MW 307.32 / mol), pH = 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז PAD4 באמצעות חיתוך o 100k MWצינורות ff צנטריפוגה ו צנטריפוגות ב XG 4,000 במשך 20 דקות ב 4 ° C. חלבון Aliquot לכרכי μl 200 ב1.0 מיליליטר צינורות microcentrifuge ולאחסן ב -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. פתרונות מניות הכנה לחוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את נתרן כלורי (NaCl, MW 58.44 g / mol) ולהכין פתרון 2 M. מערבבים פתרון עד ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את aminomethane טריס (hydroxymethyl) (טריס בסיס, MW 121.14 g / mol) ולהכין 2 M פתרון, pH = 8.0. מערבבים פתרון עד ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את dihydrate סידן כלורי (CaCl 2 2H 2 O, MW 147.01 g / mol) ולהכין פתרון מ&quot;מ 500. מערבבים פתרון עד ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את phosphine טריס (2-carboxyethyl) (ז TCEP, MW 250.19 / mol) ולהכין פתרון 200 מ&quot;מ. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את dithiothreitol (DTT, MW 154.25 g / mol) ולהכין פתרון 1 M. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכןפתרון 0.5% טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את חומצת ethylenediaminetetraacetic (ז EDTA, MW 292.24 / mol) ולהכין פתרון 100 מ&quot;מ. מערבבים פתרון עד ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את Z- Arg- Arg- 7- amido- 4 methylcoumarin hydrochloride (ז ZRcoum, MW 621.69 / mol) ולהכין פתרון 10 מ&quot;מ בsulfoxide דימתיל (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 Assay על 37 מעלות צלזיוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ- 10 מניות מ&quot;מ ZRcoum, להכין פתרון 125 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון 125 מיקרומטר ZRcoum זה יהיה א הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ של 62.5 מ&quot;מ NaCl, 62.5 מ&quot;מ טריס, 12.5 מ&quot;מ CaCl 2, 6.25 מ&quot;מ DTT, ו -5 PAD4 מיקרומטר (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ של 62.5 מ&quot;מ NaCl, 62.5 מ&quot;מ טריס, 12.5 מ&quot;מ CaCl 2, ו -6.25 מ&quot;מ DTT (pH = 8.0). זה יהיה הפתרון ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ&quot;ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד בהיר ולאחסן ב -20מעלות צלזיוס. זה יהיה הפתרון ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג צלחת 96-היטב ולייעד מספר הבארות לביקורת (לא PAD4) ובארות (+ PAD4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 160 של התמיסה B לבארות ופיפטה μl 160 של הפתרון C לתוך בארות שליטה. דגירה במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 40 μl של פתרון לכל הבארות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של DH 2 O למחצית מבארות השליטה ומחצית מהבארות. למחצית השנייה של בארות שליטה ובקרת מבחן, פיפטה 10 μl של פתרון ד דגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר. </li></ol> 4. PAD4 Assay ב RT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ- 10 מניות מ&quot;מ ZRcoum, להכין פתרון 50 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון ZRcoum 50 מיקרומטר זה יהיה א הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר של 100 מ&quot;מ NaCl, 100 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ TCEP, 0.02%-100 X, ו- 8 PAD4 מיקרומטר טריטון (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר של 100 מ&quot;מ NaCl, 100 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ TCEP, ושל 0.02% טריטון X-100 (pH = 8.0). זה יהיה הפתרון ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ&quot;ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג צלחת 384 גם ולייעד בארות לביקורת (לא PAD4) ובארות (+ PAD4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 25 μl של התמיסה B לבארות ופיפטה 25 μl של הפתרון C לתוך בארות שליטה. לאפשר חיץ עם / בלי PAD4 כדי לדגור בבארות עבור 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 μl פיפטה של ​​הפתרון C לכל בארות דגירה במשך 45 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של DH 2 O למחצית מבארות השליטה ומחצית מהבארות. למחצית השנייה של בארות שליטה ובקרת מבחן, pipettדואר 10 μl של פתרון ד לדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר. </li></ol> 5. מבחני קורס זמן PAD4 על 37 מעלות צלזיוס וRT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ- 10 מניות מ&quot;מ ZRcoum, להכין פתרון 125 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון 125 מיקרומטר ZRcoum זה יהיה א הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ של 62.5 מ&quot;מ NaCl, 62.5 מ&quot;מ טריס, 12.5 מ&quot;מ CaCl 2, 6.25 מ&quot;מ DTT, ו -5 PAD4 מיקרומטר (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ&quot;ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג 2 96-גם צלחות וpipet 160 μl של התמיסה B ל# סכום של בארות (# בארות יהיו תלויים בכמה נקודות זמן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת 96-היטב אחד על 37 מעלות צלזיוס. דגירה את הצלחת גם 96 האחרות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פְּעִיםette 40 μl של פתרון לכל הבארות בשני 96-גם צלחות ומייד פיפטה 10 μl של הפתרון C לתוך בארות t = 0 דקות. להמשיך ולהוסיף 10 μl של הפתרון C בנקודות זמן ספציפי, עד שכל הבארות כבר הרווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר. </li></ol> 6. PAD4 העיכוב Assay ב RT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ- 10 מניות מ&quot;מ ZRcoum, להכין פתרון 83 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון ZRcoum 83 מיקרומטר זה יהיה א הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את CL-amidine (MW 424.8 g / mol) ולהכין פתרון מניות 100 מיקרומטר. זה יהיה פתרון ב &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר של 100 מ&quot;מ NaCl, 100 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ TCEP, 0.02% Triton X-100, וPAD4 8 מיקרומטר (pH = 8.0). זה יהיה הפתרון ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר של 100 מ&quot;מ NaCl, 100 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ TCEP, ושל 0.02% טריטון X-100 (pH = 8.0). ההוא יהיה הפתרון ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ&quot;ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון E. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג צלחת 384 גם ולייעד בארות לביקורת (לא PAD4), בארות (+ PAD4), ובארות עיכוב (PAD4 + CL-amidine). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 25 μl של הפתרון C לבארות ופיפטה 25 μl של הפתרון D לתוך בארות שליטה. לאפשר חיץ עם / בלי PAD4 כדי לדגור בבארות עבור 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של התמיסה B לתוך בארות עיכוב דגירה במשך 20 דקות ב RTE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 μl פיפטה של ​​פתרון לכל בארות דגירה במשך 45 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של פתרון ה &#39;לכל הבארות. לדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר. </li></ol> 7. תא גולמי lysate Assayב RT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קצירת תאים מPAD4 צמיחת L 1, תאים גלולים ב 10 מיליליטר של 50 מ&quot;מ טריס, 50 מ&quot;מ NaCl, 0.1 פלואוריד מ&quot;מ phenylmethylsulfonyl (PMSF, MW 174.94 g / mol) וdithiothreitol 1 מ&quot;מ (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים באמצעות sonication במשך 15 דקות ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate התא ב20,000 XG במשך 20 דקות ב 0 מעלות צלזיוס. להתרכז supernatant ברור למחצית הנפח על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 4,000 4 ° C באמצעות 100k MW צינורות צנטריפוגה חתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ- 10 מניות מ&quot;מ ZRcoum, להכין פתרון 250 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון 250 מיקרומטר ZRcoum זה יהיה א הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר של 100 מ&quot;מ NaCl, 100 מ&quot;מ טריס, 20 מ&quot;מ CaCl 2, ו -2 מ&quot;מ TCEP (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ&quot;ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג צלחת 384 גם שחורה ועיצובאכלתי בארות לביקורת (לא lysate תא) ובארות (+ lysate תא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה של ​​התמיסה B 100 μl לכל הבארות ו -60 μl פיפטה של ​​lysate תא לתוך בארות. דגירה של 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 μl פיפטה של ​​פתרון לכל בארות דגירה במשך 45 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של הפתרון C לכל הבארות. לדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+protein+language+using+proteomics.">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li><li>Sims, R. J., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications.">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).</li><li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+to+study+genes+and+genomes.">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405, 837-846 (2000).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription.">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447, 407-412 (2007).</li><li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+switches+and+modification+cassettes+in+histone+biology+and+beyond.">Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond.</a> Nature. 425, 475-479 (2003).</li><li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications:+lessons+from+professional+pocket+pickers.">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li><li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+protein+modifications+with+interaction+domains.">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403, 41-45 (2000).</li><li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD,+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes:+genes,+features+and+involvement+in+disease.">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).</li><li>Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullination:+a+posttranslational+modification+in+health+and+disease.">Citrullination: a posttranslational modification in health and disease.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).</li><li>Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+of+peptidylarginine+deiminase+V+and+histone+deimination+in+granulocytes.">Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).</li><li>Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+of+histone+H2A+and+H4+at+arginine+3+in+HL-60+granulocytes.">Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes.</a> Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).</li><li>Kearney, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+characterization+of+protein+arginine+deiminase+4:+a+transcriptional+corepressor+implicated+in+the+onset+and+progression+of+rheumatoid+arthritis.">Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis.</a> Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).</li><li>Christophorou, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin.">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).</li><li>Wang, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminases+in+citrullination,+gene+regulation,+health+and+pathogenesis.">Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).</li><li>Trouw, L. A., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+serological+gap:+promising+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+rheumatoid+arthritis.">Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis.</a> Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).</li><li>Chang, X., Fang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PADI4+and+tumourigenesis.">PADI4 and tumourigenesis.</a> Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).</li><li>Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+peptidylarginine+deiminase+type+4+in+ovarian+tumors.">Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors.</a> Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).</li><li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+pathogenic+role+of+PADI4+in+oesophageal+cancer.">Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer.</a> Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+PADI4+cooperates+with+Elk-1+to+activate+c-Fos+expression+in+breast+cancer+cells.">Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li><li>Tanikawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+histone+modification+and+chromatin+structure+by+the+p53-PADI4+pathway.">Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway.</a> Nat. Commun. 3, 676 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest.">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li><li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4+(PAD4):+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential.">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4.">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+peptidylarginine+deiminase+(PAD)+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity.">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li><li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

מספר גדול של חלבונים יונקים הם שונה במידה רבה על ידי הפעולה של אנזימים הבאים הסינתזה של חלבונים על ידי הריבוזום. שינויים אלה לאחר translational (PTMs) יכולים להגדיל באופן משמעותי את המגוון הפונקציונלי של proteome על ידי שינוי הגודל, מטען, מבנה, ומדינת oligomerization (בין תכונות אחרות) של חלבוני 1-3. כתוצאה מכך, השינוי במבנה חלבון יכול להוביל לתוצאות פיסיולוגיות, כגון פירוק חלבונים, התמיינות תאים, איתות, אפנון בביטוי גנים, ואינטראקציות בין חלבונים. בעוד שינויים אלה נפוצים באחוז גדול של כל החלבונים האנושיים, המסוף מסתיים בחלבוני היסטון לעבור מספר גבוה מרגיל של שינויים קוולנטיים 4. חלבוני היסטון הם משפחה של חלבונים מבניים המאפשרים העיבוי של הדנ&quot;א הגנומי. שינויים קוולנטיים של זנבות היסטון לא מובנים מתבצעים ומוסדרים על ידי סרייהשל אנזימים שיכולים לזרז את השינוי קוולנטיים של שאריות (סופרים), להפוך את אותם שינויים (מחקים), ולהבחין בין השינויים שהוטבעו על זנבות היסטון (קוראים) 5-7. למעשה, רוב PTMs הידוע ניתן לצפות בקטע קצר זה של היסטון כולל מתילציה, זירחון, acetylation, sumoylation, ubiquitination, וcitrullination 8. Citrullination כולל ההמרה של peptidyl-ארגינין לRNA t הלא peptidyl-Citrulline המקודד (איור 1 א). החלבונים, אחראים לנטרול שרשרת צד זה, הנם החלק מPAD (עמ &#39;eptide rginine ד eiminase) משפחת חלבונים, אשר כולם אנזימי סידן תלוי. 9,10. עד כה, חמישה בני משפחת PAD תוארו (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, וPAD6). כל אחד ממשפחה זו מופיעה למקד חלבונים תאיים שונים ומציג גם חדפרופילי הפצת רקמת que. PAD4 הוא החבר היחיד של משפחת חלבון זה ידוע להיות מקומי בתוך הגרעין באמצעות רצף לוקליזציה גרעיני 11. בהתאם לכך, זה הוכח deiminate מספר יעדי גרעין, כוללים שרשרות צד ארגינין על זנבות N- מסוף שאריות ארגינין H2A ההיסטונים 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, וH3R26) וH4 (H4R3) 12, 13. בעוד כל אחד מisozymes PAD יש פונקציות פיסיולוגיות ספציפיות וקריטיות, PAD4 קיבל הרבה יותר תשומת לב בשל תפקידה במספר התהליכים האנושיים בשני תאים חולים ובריאים. לאחרונה, PAD4 הוצג להיות חבר ברשת תעתיק pluripotency 14. שני רמות ביטוי PAD4 והפעילות הוצגו להיות גבוהות במצבי pluripotent תכנות מחדש וקרקע מדינה בעכברים. על ידי שליטה על הרגולציה של גנים בתאי גזע, PAD4 עשוי לשמור תפקיד מרכזי ביעילות תכנות מחדש של תאים. PAD4 גם היה מעורב בהיווצרות מלכודות תאי נויטרופילים, שעל הכריכה של פתוגנים לאפשר פינוי המערכת שלהם. Hypercitrullination של חלבוני היסטון ידי PAD4 גורם decondensation של הכרומטין, המשמש כחומר הבסיס לאנקפסולציה של חיידקים פתוגניים במלכודת תאית, ובכך לבלום את זיהומים חיידקיים 15,16. בנוסף, PAD4 כבר נמצא לשחק תפקיד פעיל במספר המחלות בבני אדם. זה הוכח בעבר שביטוי חריג של PAD4 קשור עם תחילת וחומרת דלקת מפרקים שגרונית, מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת נפוצה 17. למעשה, הנוכחות של נוגדני חלבון אנטי-citrullinated היא אחד מהסמנים דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים אמינות והמקיפים ביותר של דלקת מפרקים שגרונית 18. כמו כן, פעילות PAD4 dysregulated לאחרונה נצפתה במספר סוגים של סרטן אנושי כוללים השחלות, שד, ריאות,סרטן הוושט ד 19-22. הקשר בין PAD4 והסרטן הוכח להיות מתווך דרך אונקוגן ELK1 או באמצעות החלבון המדכא גידולי p53 22,23 ועבודה קודמת הציעה כי PAD4 יכול להיות יעד נגד סרטן רומן טיפולי 17,24,25. כהוכחה למחקר עיקרון, הדלדול של PAD4 באמצעות shRNA בשורת תאי סרטן המעי הגס HCT116 התגלה כמספיק לגרימת אפופטוזיס ומחזור תא מעצר 26. מעכב PAD4 בלתי הפיך שפותח לאחרונה הביא להפחתת שבעים אחוז במסת גידול בעכברי 27. די להפליא, עיכוב PAD4 הופיע לפעול כטיפול ממוקד שגרם להריגתם בררני של תאים סרטניים מבלי לפגוע בתאי untransformed. השימוש במולקולות קטנות כדי לכבות את הפונקציה של PAD4 עשויים להיות אסטרטגיה חדשה וחזקה למקד תאים סרטניים או כדי להגדיל chemotherapeutics הסרטן קיים 28. לרוע המזל, ת.ד.מעכב PAD4 הפיך אוהל שעדיין לא התגלה. מספר המעכבים קוולנטיים פותחו באמצעות לורו / ידית imidine fluoro המחקה את מצע ארגינין 27,29,30 והוכיחה להיות כלים מעשיים להבנת תפקידו של PAD4 בשני תאי מצב בריאים וחולים. עם זאת, מולקולות אלה כל הרפידות הפעילים עם עוצמה דומה לעכב. לכן, הצורך בassay קליל שמדווח על הפעילות של PAD4 הוא קריטי. עד כה, PAD4 מבחני תוארו המקשרים השחרור של אמוניה מהתגובה לקריאת colorimetric 31, לנצל אנלוגי מצע chloroamidine שכותרתו fluorescently עבור assay קיטוב הקרינה 32, להסתמך על התגובה בסיוע החומצה בין glyoxal וCitrulline 33, ו כמה פעילות PAD4 לקרינת dequenching צעד 34. מבין אלה, רק אסטרטגית haloacetamidine משנה קוולנטיים הוכיחה להיות תואם עם scre תפוקה גבוההפלטפורמות ening 32,35,36. אנו מתארים assay המבוסס הקרינה קלילה שאמינים מודד את הפעילות של PAD4. Assay, אשר מציג יחס חזק אות לרעש, מהירות של ניתוח, ואת חוסן של מדידה, יש את הפוטנציאל לגלות מעכב PAD4 באמת חזק ובררני.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="716">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:192px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td>
			<td style="width:123px;">Amresco</td>
			<td style="width:135px;">J106-2KG</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:192px;">Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP902-25&#160;</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:192px;">Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technogolies</td>
			<td>15529-019</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:192px;">All Buffer Salts&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:192px;">Protino Glutathione (GSH) agarose&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Machery-Nagel</td>
			<td style="width:135px;">745500.10</td>
			<td style="width:267px;">Store at 4 &#176;C; http://www.mn-net.com/</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Z-&#8203;Arg-&#8203;Arg-&#8203;7-&#8203;amido-&#8203;4-&#8203;methylcoumarin hydrochloride (Zcoum)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C5429</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:192px;">Chloroamidine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Cayman Chemical&#160;</td>
			<td style="width:135px;">10599</td>
			<td style="width:267px;">Store at -20 &#176;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">Tris(2-&#8203;carboxyethyl)&#8203;phosphine hydrochloride (TCEP HCl)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientifc</td>
			<td style="width:135px;">20490</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.piercenet.com/">http://www.piercenet.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:192px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

בתחילה, זה היה הוכיח כי ZRcoum יכול לדווח על הפעילות של PAD4 בפורמט צלחת 96-היטב. ולס הודגרו עם ZRcoum המצע ובנוכחות / ההיעדרות של PAD4. בעקבות תקופת דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, הקרינה נמדדה עם 340/40 - 475/15 ננומטר מסנן (איור 2 א). כצפוי, רמות הקרינה נשארו?...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog at JoVE.com

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

ניטור קרינה מבוססת פעילות PAD4 באמצעות אנלוגי מצע פרו-הקרינה

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

fluorescence-based-monitoring-pad4-activity-via-pro-fluorescence

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.8K Views.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Video: Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

קביעת המישורים המחייבים קרח של חלבונים נגד קיפאון על ידי זיקה למטוס קרח מבוסס פלואורסצנטיות

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Preparing Silica Aerogel Monoliths via a Rapid Supercritical Extraction Method

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The procedure requires 15-20 min of preparation time, during which a liquid precursor mixture is prepared and poured into wells of a metal mold that is placed between the platens of a hydraulic hot press, followed by several hours of processing within the hot press. The precursor solution consists of a 1.0:12.0:3.6:3.5 x 10-3 molar ratio of tetramethylorthosilicate (TMOS):methanol:water:ammonia. In each well of the mold, a porous silica sol-gel matrix forms. As the temperature of the mold and its contents is increased, the pressure within the mold rises. After the temperature/pressure conditions surpass the supercritical point for the solvent within the pores of the matrix (in this case, a methanol/water mixture), the supercritical fluid is released, and monolithic aerogel remains within the wells of the mold. With the mold used in this procedure, cylindrical monoliths of 2.2 cm diameter and 1.9 cm height are produced. Aerogels formed by this rapid method have comparable properties (low bulk and skeletal density, high surface area, mesoporous morphology) to those prepared by other methods that involve either additional reaction steps or solvent extractions (lengthier processes that generate more chemical waste).The rapid supercritical extraction method can also be applied to the fabrication of aerogels based on other precursor recipes.

This article describes a rapid supercritical extraction method for fabricating silica aerogels. By utilizing a confined mold and hydraulic hot press, monolithic aerogels can be made in eight hours or less.

הכנת מונוליתים Aerogel סיליקה באמצעות ראפיד סופר קריטי חילוץ שיטה

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The ...

Real-time Monitoring of Reactions Performed Using Continuous-flow Processing: The Preparation of 3-Acetylcoumarin as an Example

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible to ensure consistent product quality over time using this technique. We here show how to interface a commercially available flow unit with a Raman spectrometer. The Raman flow cell is placed after the back-pressure regulator, meaning that it can be operated at atmospheric pressure. In addition, the fact that the product stream passes through a length of tubing before entering the flow cell means that the material is at RT. It is important that the spectra are acquired under isothermal conditions since Raman signal intensity is temperature dependent. Having assembled the apparatus, we then show how to monitor a chemical reaction, the piperidine-catalyzed synthesis of 3-acetylcoumarin from salicylaldehyde and ethyl acetoacetate being used as an example. The reaction can be performed over a range of flow rates and temperatures, the in-situ monitoring tool being used to optimize conditions simply and easily.

Real-time monitoring allows for fast optimization of reactions performed using continuous-flow processing. Here the preparation of 3-acetylcoumarin is used as an example. The apparatus for performing in-situ Raman monitoring is described, as are the steps required to optimize the reaction.

ניטור בזמן אמת של תגובות בוצעו באמצעות רציפה זרימת עיבוד: הכנת 3-Acetylcoumarin כדוגמא

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is the most studied granzyme in humans and mice and therefore, researchers need specific and reliable tools to study its function and role in pathophysiology. This especially necessitates assays that do not recognize proteases such as caspases or other granzymes that are structurally or functionally related. Here, we apply GzmB&#8217;s preference for cleavage after aspartic acid residues in a colorimetric assay using the peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is the only mammalian serine protease capable of cleaving this substrate. The substrate is cleaved with similar efficiency by human, mouse and rat GzmB, a property not shared by other commercially available peptide substrates, even some that are advertised as being suitable for this purpose. This protocol is demonstrated using unfractionated lysates from activated NK cells or CTL and is also suitable for recombinant proteases generated in a variety of prokaryotic and eukaryotic systems, provided the correct controls are used. This assay is a highly specific method to ascertain the potential pro-apoptotic activity of cytotoxic molecules in mammalian lymphocytes, and of their recombinant counterparts expressed by a variety of methodologies.

We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.

Colorimetric Assay שמודד את הפעילות באופן ספציפי Granzyme B מפרקי חלבונים: הידרוליזה של הבוק-עלא-עלא-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

שיטה למניפולציות מתח פנים של מתכת נוזלית באמצעות חמצון פני שטח והפחתה

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

המדידה בו זמנית HDAC1 ופעילות HDAC6 הלה תאים באמצעות UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Fabrication and Testing of Catalytic Aerogels Prepared Via Rapid Supercritical Extraction

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three preparation methods are described: (a) the incorporation of metal salts into silica or alumina wet gels using an impregnation method; (b) the incorporation of metal salts into alumina wet gels using a co-precursor method; and (c) the addition of metal nanoparticles directly into a silica aerogel precursor mixture. The methods utilize a hydraulic hot press, which allows for rapid (&#60;6 h) supercritical extraction and results in aerogels of low density (0.10 g/mL) and high surface area (200-800 m2/g). While the work presented here focuses on the use of copper salts and copper nanoparticles, the approach can be implemented using other metal salts and nanoparticles. A protocol for testing the three-way catalytic ability of these aerogels for automotive pollution mitigation is also presented. This technique uses custom-built equipment, the Union Catalytic Testbed (UCAT), in which a simulated exhaust mixture is passed over an aerogel sample at a controlled temperature and flow rate. The system is capable of measuring the ability of the catalytic aerogels, under both oxidizing and reducing conditions, to convert CO, NO and unburned hydrocarbons (HCs) to less harmful species (CO2, H2O and N2). Example catalytic results are presented for the aerogels described.

Here we present protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms. Methods for preparing materials using copper salts and copper-containing nanoparticles are featured. Catalytic testing protocols demonstrate the effectiveness of these aerogels for three-way catalysis applications.

ייצור ובדיקה של Aerogels קטליטי להכין אותה באמצעות מיצוי דודי סופר מהיר

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.

סינתזה של המצע מכורך Au Nanowires באמצעות מנגנון הצמיחה הפעילה משטח

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the reaction is commonly performed using chlorinated or amide solvent systems, which are hazardous to human health and the environment. Our methodology utilizes acetonitrile as a greener and less hazardous solvent system. This protocol exhibits rates and yields that are comparable to traditional solvent systems and employs an extraction and wash sequence that eliminates the need for the purification of the ester product via column chromatography. This general method can be used to couple a variety of carboxylic acids with 1&#176; and 2&#176; aliphatic alcohols, benzylic and allylic alcohols, and phenols to obtain pure esters in high yields. The goal of the protocol detailed here is to provide a greener alternative to a common esterification reaction, which could serve useful for ester synthesis in both academic and industrial applications.

A modified Steglich esterification reaction was used to synthesize a small library of ester derivatives with primary and secondary alcohols. The methodology uses a non-halogenated and greener solvent, acetonitrile, and enables product isolation in high yields without the need for chromatographic purification.

סינתזה של אסטרים ויה Esterification Steglich ירוק יותר ב- Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...