Authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול לביצוע ניסויים בבעלי חיים, את הרציונל ומטרות של המחקר, הוגשו ואושר על ידי אוניברסיטת קליפורניה המוסדית הטיפול בבעלי חיים בדרום וועדת שימוש. הפרוטוקול להקמת תרבויות עיקריות מדגימות esophagectomy אדם דה-מזוהים אושר על ידי האוניברסיטה של ​​דרום קליפורניה Institutional Review Board. 1. השג עכבר או וושט אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג עכבר וושט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר ישן 8-12 יום עם 2% ממנת יתר נשימתית isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את החיה למטה עם בטן כלפי מעלה ולהרטיב את פני השטח הגחון עם אתנול 70%. עם מלקחיים, לתפוס ולהרים את העור הקדמי לפתיחת השופכה עם מלקחיים. השתמש במספריים כירורגית ישר סטנדרטיים לחתוך לאורך קו האמצע הגחון מפתיחת השופכה לסנטר. היזהר לחתוך רק את העור. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך משופכת פתיחה כלפי מטה עד הברך בשני הצדדים של החיה, ויצר במהופך &quot;Y&quot;. לעשות חתך נוסף בשני הצדדים של החיה לאורך כלוב הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף בזהירות את העור בשני הצדדים, את של הצפק הבסיס והצלעות, ולהניח לצדדים. לבחון את כלוב הצלעות מעל חלל בית החזה ואת הצפק שמעל חלל הבטן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הצפק עם מלקחיים ולחתוך אותו לכלוב צלעות והסרעפת, מצביע כלפי מעלה מספריים כדי למנוע נזק לתכולת בטן. בעדינות להרים את האונה השמאלית של הכבד, לחשוף את הבטן הבסיסית, צומת הוושט-קיבה וחלק הבטן של הוושט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כירורגית autoclaved לחתוך את עצם החזה וצלעות לאורך קו האמצע עד חגורת צוואר הרחם. מספריים נקודה כלפי מעלה כדי למנוע נזק לתכולת בית החזה. באופן מלא לחשוף את התוכןחלל בית חזה על ידי משיכת כלוב הצלעות לצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את הלב ושני האונות של הריאות. ספוג בדם עודף עם Q-טיפים. הוושט החזי אחורי צר, גמיש צינור משקר לקנה הנשימה והקדמי לחולית בית החזה. הערה: הוושט יכול להיות קשה לזהות בילודים עכבריים. לוקליזציה של צומת הוושט-קיבה גורמת זיהוי הוושט פשוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בזהירות את הוושט מהקיבה, לנתח כלי דם, השומן מסביב ולפדר עד מוצא הוושט בחלל צוואר הרחם כל הדרך. מספריים כירורגיות עם קצה קהה עבודה הטובה ביותר למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות כל אורכו של הוושט והמקום בפתרון &#39;הנקס המאוזן מלח (HBSS) לעיבוד נוסף שיפורט להלן. הסר חלק מהקיבה למטרות נטייה אם תרצה בכך. הערה: בשל גודל רקמה קטן, הפרדת propria muscularis מהשריריםהוא הרירית אינה ברת השגה בושט ילוד עכברי וכל הוושט הוא נתון לעיבוד מתואר להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג וושט אדם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות כריתת הוושט (בדרך כלל 5 סנטימטר או פחות) עם HBSS ולהסיר את כל רקמה, שומן, כלי דם או חיבור מצורפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות חלק של הדגימה ומניח בפורמלין לבדיקה היסטולוגית עתיד אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הרירית שנותרה מpropria muscularis הבסיסי על ידי נתיחה חדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך רירית לרסיסי סנטימטר משנה ובכפוף לפרוטוקול המתואר להלן. הערה: כריתות וושט אדם יכולה להיות מאוחסנת בPBS עד 6 שעות לפני העיבוד המתואר להלן. המקור של דגימות esophagectomy יכתיב גודל דגימה ויהיה תלוי במעבדה. </li></ol></li></ol> 2. תאים בודד Murine ואדם הוושט סטרומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי סטרומה הוושט fעכברי rom ורקמה אנושית על ידי שילוב של מערכת עיכול מכאנית והאנזימטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן מכאני על ידי לעכל קוצץ את הרקמה עם מספריים ושטיפות מרובות עם HBSS. אנזימי עיכול על ידי דוגרים הרקמה עם 300 U / ml XI collagenase ו 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר dispase במשך 25 דקות (רקמה עכברית) או לתקופה של עד 6 שעות (רקמה אנושית). ודא שמכשירים המשמשים למתייפייף כבר autoclaved ומעוקר. הערה: Collagenases הם אנזימים המפרקים את הקולגן, חלבון מטריצה ​​תאי אחראי על החזקת רקמות בעלי חיים יחד. יש Collagenase XI פעילות collagenase גבוה וזכה להצלחה בפרוטוקול בידוד זה. Dispase היא אנזים חיידקים עם פעילות ניתוק proteolytic קלה ששומר פעילות קרום תא, והוא משמש בשילוב עם collagenase כאנזים המשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שברי רירית המתקבלים מעכבר או רקמה אנושית ב1.7 מיליליטר מיקרו צנטריפוגות או 5 צינורות מיליליטר בהתאמה, המכילים HBSS. רקמת בשר טחון נוסףל2-3 חתיכות מ&quot;מ באמצעות מספריים עם רוחב קצה פתוח שיתאים לתוך צינורות המתאימים. לאפשר מספיק זמן כדי לאפשר לברים ברירית הוושט למשקעים התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט למזוג HBSS, נזהר שלא לבטל את הרקמה בטעות. החלף עם HBSS הטרי הבא על ידי טלטול עדין. לחלופין, להסיר את HBSS עם טפטפת מיליליטר 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רקמות באופן זה בסך הכל 8 פעמים עם רעד עדין בין שוטף מאפשר זמן לברי הוושט למשקעים בין כל שטיפה. הערה: רקמה אנושית תדרוש יותר מיותרת שרקמת עכבר ילוד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמה עכברית עם 300 XI collagenase ו 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר dispase במשך 25 דקות על שייקר נדנדה להגדיר במהירות איטית בטמפרטורת חדר U / ml. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמה אנושית עם 300 collagenase U / ml XI ו 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר dispase עד 6 שעות, על שייקר נדנדה להגדיר במהירות איטית בטמפרטורת חדר. הערה: זמינות של esopha אדםגאס הוא משתנה. רירית הוושט אדם הודגרו עם אנזימים לתקופה של עד 6 שעות בתוצאות דור מוצלח של תרבויות עיקריות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עיכול אנזימטי, רקמת בשר טחון נוסף עם מספריים וצנטריפוגות ב XG 200 עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant. העבר את הכדור, בהיקף של השעיה תא מעורבת לצינור 5 מ&quot;ל ולשטוף 5 פעמים בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 2% סורביטול לחסל תאים ופסולת nonviable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע ב6-גם צלחות ותרבות בDMEM עם סרום 10% שור עוברי (FBS), 10 מ&quot;ג / מיליליטר אינסולין, 10 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין, ו -2 ng / ml גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) . מסנן אבק (0.22 מיקרומטר) את כל המרכיבים מלבד EGF אשר ניתן להוסיף לאחר סינון. להפיץ תאים המתקבלים מדגימות כריתה אנושיות בין 6 צלחות היטב מרובות, תלוי בגודל הכריתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע בארות הן 80% ומחוברות, תאים חסיד מעבר לT25 צנצנותינו0.05% טריפסין / חומצת ing ethylenediaminetetraacetic (EDTA). לנטרל עם תקשורת וספין ב 400 x גרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעבר 6 גם בבקבוק T25, תאי מעבר בביחס 1: 1. ניתן passaged צלוחיות ומחוברות T25 של 1: 2 או 1: 3 יחס. למעבר מבקבוק T25 לבקבוק T75, להשתמש ביחס של 1: 1. תקשורת שינוי כל 2-3 ימים, ללא קשר לספינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ב 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% humidified CO 2 ותרבות בתקשורת myofibroblast שתוארה לעיל. הערה: תאי אפיתל אינם שורדים בתנאי התרבות או מעבר הללו. תאים המשמשים לאפיון ובמחקרים שתוארו להלן בין הקטעים 5 ו -15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריו לשמר תאים בנוזל N 2 על ידי הוספת 10% sulfoxide דימתיל לתקשורת myofibroblast. </li></ol></li></ol> 3. תאים מאפיינים Murine ואדם הוושט סטרומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המורפולוגיה של תאים עם מיקרוסקופ הפוכה. שים לב לכישור-הצורהמורפולוגיה של תאים חסיד (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין תאים בתרבית על ידי הערכה של סמני cytoskeletal הבאים: α-SMA, vimentin, desmin, וcytokeratin. תאי סטרומה עם פנוטיפ כמו myofibroblast-להביע סמני myofibroblast cytoskeletal α-SMA וvimentin (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבחין נוסף תאי סטרומה בתרבית מתאי שריר, immunostain לdesmin. כדי לבצע immunostaining על תאים בתרבית, צלחת 1.5 x 10 4 תאים בשקופיות קאמריות 4 היטב ולגדול בתקשורת myofibroblast למשך 24 שעות. תאי סטרומה עם פנוטיפ כמו myofibroblast-יהיו ביטוי desmin חלש או לא קיימים. תאי סטרומה חסרי ביטוי של הפאן-cytokeratin סמן אפיתל (מידע לא מוצג). הערה: הערכה של תרבויות כוללת הערכה של סמני cytoskeletal על ידי סמני immunocytochemistry ופני תא על ידי הזרימה cytometry. Immunocytochemistry משמש כשיטת העיקרית של אפיון כלשעברפרופיל pression של חלבוני cytoskeletal הוא ייחודי לפיברובלסטים, myofibroblast או תא שריר. Cytometry זרימה קובעת טוהר תרבות על ידי הערכת ביטוי פני תא של אפיתל, אנדותל, וסמני תאי hematopoietic. CD90 הוא מועיל כשיטת משלים של זיהוי תאי סטרומה אדם כפי שהוא בא לידי ביטוי בשני fibroblasts וmyofibroblasts האנושיים. CD90 הוא לא מועיל באפיון של תאי סטרומה עכבריים כפי שבאו לידי ביטוי גם על ידי תאי T עכבריים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תאים מגיעים 60% מפגש, לשטוף שקופיות עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS) ולתקן עם מתנול. דגירה תאים במתנול במשך 10 דקות ב -20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאחסן בPBS על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב פרוטוקול immunostaining סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לפני החלת הנוגדן הראשוני, לחסום את התאים הקבועים עם goatserum 5% ב- PBS. לדלל נוגדנים ראשוניים ומשניים ב -5% בסרום עז גם כן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך זיהוי של α-SMA וvimentin, השתמש בהנוגדנים הבאים וריכוזים: עכבר מאב לα-SMA ב 1: 250 דילול והארנב PAB לvimentin ב 1: 500 דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני בטמפרטורת חדר למשך הלילה ב 4 ° C, לשטוף 3 פעמים עם PBS ולהוסיף נוגדנים משני עכבר אנטי עיזים מצומדות Rhodamine בדילול של 1: 200 וCy2 ארנב אנטי עיזים מצומדת בדילול של 1: 1,000 לשעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרעיני Counterstain עם 4 &#39;, 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) בריכוז של 1 מיקרוגרם / מיליליטר 1 דקות ולאחר מכן לשטוף עם PBS. לנתח שקופיות עם מיקרוסקופ הפוכה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים טוהר תרבויות על ידי בדיקה של תאי הוושט עכבריים ואנושיים לhematopoietic (CD45) והאנדותל (CD31) סמנים פני תא על ידי הזרימה cytometry (איור 3). לאפיין תאים אנושיים עוד יותר על ידי ביטוי של CD90 הסמן פני תא סטרומה. הערה: CD90 לא יכול לשמש לזיהוי תאי סטרומה עכבריים כcel T העכבריls גם להביע CD90. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאי סטרומה הוושט עכבר בתרבית מתרבות צלוחיות על ידי טיפול בתא אינו אנזימטית דיסוציאציה פתרון על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לשטוף עם חיץ FACS פעמיים, נספר ומוכתם עם FITC-CD45 וAPC-CD31 עם פקדי isotype רלוונטיים, על פי לנהלי צביעה סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים באמצעות Calibur FACS ולנתח נתונים עם תוכנת FlowJo. לפני תאים מכתימים, לייעל נוגדנים ולכייל ריכוזים באמצעות פקדי isotype, טחול עכבר רגיל, ותאי מח עצם. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair.">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li><li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria.">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Helper+2+Cytokines,+Transforming+Growth+Factor+beta1,+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis.">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts.">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response.">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion.">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities.">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li></ol>

עבודה זו נתמכת על ידי NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-ג&#39;נרל מילס בל מכון לבריאות ותזונה מחקר Scholar פרס בפיזיולוגית גוט ובריאות (AS) וקרן פיילוט פרס רייט (AS).

הטכניקות לדור התרבות העיקרית הן בדרך כלל דומות בעת שימוש ברקמה עכברית או אדם עם זמנים וגנדרניים ועיכול מותאם לגודל רקמה. הניסיון שלנו עם רקמה עכברית מצביע על כך ששימוש בשיטות שתוארו לעיל לגרום באופן עקבי בהקמה מוצלחת של תרבויות עיקריות. צעדים קריטיים בפרוטוקול כולל?...

אינטראקציות אפיתל-סטרומה מעורבות ברגולציה של מגוון רחב של פונקציות במערכת עיכול כוללים התחדשות רירית, תיקון, סיסטיק, והיווצרות סרטן 1,2. אינטראקציות אלה נחקרו הטובים ביותר במעי הדק ובמעי הגס ועלולות דומה משחקות תפקיד בהפרעות ברירית הוושט 3. תת-אוכלוסייה של myofibroblasts תאי סטרומה מעי הגס וכינה הודגמה להשתתף בתיווך פגיעה ברקמות, דלקת ולתקן 4,5. במערכת עיכול דיסטלי, תאי ציר בצורה הבאות נמצאים בסמוך לקרום במרתף בממשק שבין propria האפיתל וlamina ומוגדרים כα-SMA וvimentin חיובי, פאן-cytokeratin השלילי, וחולשה חיובית או שלילי desmin 5. סטרומה הוושט לא התאפיינה בקפדנות ברמה תאית או מולקולרית. העבודה שלנו בוושט העכברי עוברת דהα-SMA monstrated תאים וvimentin בסטרומה הוושט, לעתים subjacent לאפיתל קשקש 6. אינטראקציות אפיתל-סטרומה היו מעורבות בהפרעות ברירית הוושט כגון פגיעת גסטרו-הוושט תיווך 6 ושט אאוזינופילית 3. הגבלות fibrotic גם סיבוך ידוע של תאי פציעה וסטרומה הוושט היה מעורבת בפתוגנזה של סיסטיק עיכול. בידוד של תאים אלה יסייע להשיג את המחקרים הדרושים כדי לחקור מסלולי איתות מופרעים. הגשה זו מספקת את הטכניקות הדרושות כדי להקים תרבויות עיקריות של myofibroblasts α-SMA החיובי, vimentin החיובי כך פערים קיימים בידע לגבי מסלולי איתות תיווך אינטראקציות אלה ניתן לטפל. הטכניקה המתוארת שמשה בהצלחה על ידי מהחברים להקים myofibroblasts העיקרי עכברי המעי הגס 7 וfurther מותאם להקמת עכברית 6 ותאי סטרומה אדם כמו myofibroblast-הוושט. במסמך זה אנו מתארים תנאים הנדרשים כדי להקים ולאפיין תרבויות אלה הוקמו מעכבר או וושט אדם לפני השימוש במחקרים תפקודיים עתיד. ניתן לגדל תרבויות ומנוצלות עד ליום 15 במעברים. בידוד והקמת התרבויות העיקריות באמצעות השיטות מפורטות להלן מייצר תאי סטרומה עם פנוטיפ myofibroblast; α-SMA, vimentin חיובי, וחולשה חיובי או שלילי לdesmin, וcytokeratin שלילי. פנוטיפ זו שונה מהפנוטיפ של פיברובלסטים הוושט שהיא בעיקר vimentin חיובי, α-SMA השלילי 3 או הפנוטיפ השלילי החיובי, vimentin α-SMA של muscularis mucosae 6.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tissue culture reagents</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>trypsin/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Mouse mAB to &amp;alpha;-SMA&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAB to vimentin</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 conjugated Goat anti Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 conjugated to eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 conjugated to APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V and 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block for CD16/CD32</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>5 ml tube</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet and incubators</td><td>Nuaire</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nuaire.com/products/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.nuaire.com/products/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4-well chamber slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Vacuum-Driven Filter System</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single tipped Q-Tips</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Metamorph software (Molecular Devices)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus

myofibroblasts העכברי והוושט אנושי נוצרים באמצעות עיכול אנזימטי. ילוד הוושט עכברי (ישן 8-12 יום) שנקטפו, טחון, שטף, ונתונים לעיכול אנזימטי עם collagenase וdispase במשך 25 דקות. דגימות כריתת הוושט אדם ניטלו ממנו propria muscularis וadventitia והרירית הנותרת טחונות, ונתונים לעיכול אנזימטי עם collagenase וdispase עד 6 שעות. תאים בתרבית להביע α-SMA וvimentin וdesmin המפורש חלש או בכלל לא. תנאי תרבות הם לא תורמים לצמיחה של אפיתל, דם, או תאי האנדותל. טוהר תרבות הוא אישר עוד יותר על ידי הערכת cytometric זרימה של ביטוי סמן תא שטח של hematopoietic המזהם הפוטנציאלי ותאי האנדותל. הטכניקה המתוארת היא פשוטה ותוצאות בדור של אי-hematopoieitc, תאי סטרומה שאינם עולה בקנה אחד אנדותל. מגבלות של שיטה זו הן אינהרנטי לשימוש בתרבויות עיקריות בלימודי ביולוגיה מולקולריים, כלומר, השתנות בלתי נמנעות נתקלו בין תרבויות הוקמו על פני עכברים או בני אדם שונים. תרבויות עיקריות עם זאת הן השתקפות נציג יותר של מדינת in vivo בהשוואה לשורות תאים. שיטות אלה מספקים גם חוקרים היכולת לבודד ותאי סטרומה התרבות ממצבים קליניים וניסויים שונים, המאפשר השוואה בין קבוצות. גם תאי סטרומה הוושט מאופיינים ניתן להשתמש במחקרים תפקודיים חוקרים אינטראקציות אפיתל-סטרומה בהפרעות בושט.

תאי סטרומה הוושט המבודדים באמצעות עיכול מכאני והאנזימטית לראשונה מצופים ותרבותי ב6 צלחות גם. בדיקה של תאים עם מיקרוסקופ הפוך בתוך שעות של ציפוי מדגימה השעיה תא מעורבת חסיד רופף לתחתית הצלחת (איור 1 א). במהלך שעות הבאות 24, תאים דמויי כישור בתקיפות חסיד לתחתית ה...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus at JoVE.com

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  Keck School of Medicine, University of Southern California. We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions. 

Video: Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Developmental Biology

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Bioengineering

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Medicine

אורגנואידים של הוושט האנושי ופרוטוקולי תרבית ממשק אוויר-נוזל

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

מחבר זרקור: חקירת הפתופיזיולוגיה של דלקת הוושט האאוזינופילית

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.

מודלים תלת מימדיים של תרביות תאים לחקר מחסום האפיתל בדלקת ושט אאוזינופילית 

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Immunology and Infection

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ

מודלים תלת מימדיים של תרביות תאים לחקר מחסום האפיתל בדלקת ושט אאוזינופילית

מודלים תלת מימדיים של תרביות תאים לחקר מחסום האפיתל בדלקת ושט אאוזינופילית

מודלים תלת מימדיים של תרביות תאים לחקר מחסום האפיתל בדלקת ושט אאוזינופילית

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים