Authors have nothing to disclose.

Das Protokoll zu Tierversuchen, die Grundlagen und Ziele der Forschung durchzuführen, von der University of Southern California Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss eingereicht und genehmigt wurden. Das Protokoll für die Einrichtung von Primärkulturen von de-identifizierte menschliche Speiseröhre Proben wurde von der University of Southern California Institutional Review Board genehmigt. 1. Besorgen Sie Maus oder Mensch Ösophagus <ol><li> Erhalten Maus Ösophagus: <ol><li> Euthanize die 8-12 Tage alten Maus mit 2% Isofluran Inhalationsdosis durch Genickbruch folgte. </li><li> Pin das Tier sich mit Bauch nach oben und benetzen die Bauchseite mit 70% Ethanol. Mit einer Pinzette greifen und heben Sie die Haut anterior der Harnröhrenöffnung mit einer Pinzette. Verwenden Sie gerade Standard-OP-Schere entlang der ventralen Mittellinie von der Harnröhrenöffnung bis zum Kinn geschnitten. Achten Sie darauf, nur die Haut geschnitten. &lt;/ Li&gt; <li> Einen Einschnitt von der Harnröhrenöffnung nach unten auf das Knie auf beiden Seiten des Tieres, wodurch ein umgekehrtes &quot;Y&quot;. Eine weitere Einschnitt auf beiden Seiten des Tieres entlang der Rippen. </li><li> Die Haut sorgfältig schälen auf beiden Seiten, aus der zugrunde liegenden Bauchfell und den Brustkorb und legte sich an den Seiten. Untersuchen der Brustkorb über der Brusthöhle und das Peritoneum über der Bauchhöhle. <ol><li> Heben Sie das Bauchfell mit einer Pinzette und durchschneiden bis zum Zwerchfell und Brustkorb und zeigte Schere nach oben, um Schäden an Bauch Inhalte zu verhindern. Gently heben Sie den linken Leberlappen, legen das darunterliegende Magen, der Speiseröhre und Magen-Kreuzung und die Bauch Teil der Speiseröhre. </li></ol></li><li> Verwenden autoklaviert chirurgische Scheren durch das Brustbein und Brustkorb entlang der Mittellinie bis zu den Hals Gürtel geschnitten. Punkt Schere nach oben, um eine Beschädigung der thorakalen Inhalte zu verhindern. Voll den Inhalt des ExposesBrusthöhle durch Ziehen des Brustkorbs zu den Seiten. </li><li> Das Herz und die beiden Lungenlappen vorsichtig entfernen. Absorbieren überschüssiges Blut mit Q-Tips. Die Brust-Ösophagus ist ein schmaler, flexibler Schlauch liegen hinter der Luftröhre und anterior der Brustwirbel. HINWEIS: Die Speiseröhre kann schwierig sein, in murinen Neugeborenen identifizieren. Lokalisierung des Ösophagus und Magen-Kreuzung macht Speiseröhren Identifikation unkompliziert. </li><li> Befolgen Sie sorgfältig die Speiseröhre aus dem Magen, sezieren die umliegende Gefäßsystem, Fett und Gekröse den ganzen Weg bis zu der Speiseröhre Ursprung im Halsraum. Chirurgische Schere mit stumpfer Spitze am besten für diesen Zweck. </li><li> Resezieren die gesamte Länge der Speiseröhre und in Hanks &#39;ausgeglichener Salzlösung (HBSS) zur weiteren Verarbeitung weiter unten beschrieben. Entfernen Sie einen Teil des Magens zur Orientierung, wenn gewünscht. HINWEIS: Aufgrund der kleinen Gewebegröße, die Trennung der Muscularis propria von der Muskelist Schleimhaut nicht in murine Neugeborenen Speiseröhre erreichbar und die gesamte Speiseröhre zu Verarbeitung nachfolgend beschriebenen unterzogen. </li></ol></li><li> Erhalten Menschen Ösophagus: <ol><li> Waschen Sie Ösophagusresektion Proben (typischerweise 5 cm oder weniger) mit HBSS und entfernen Sie alle angeschlossenen Bindegewebe, Fett oder Gefäßsystem. </li><li> Resektion eines Teils der Probe und setzen in Formalin für zukünftige histologische Untersuchung, falls gewünscht. </li><li> Trennen Sie die übrigen Schleimhaut aus Basis Muscularis propria durch scharfe Dissektion. </li><li> Geschnitten Schleimhaut in Unterzentimeter Fragmente und unter der nachstehend beschriebenen Protokoll. HINWEIS: Human Speiseröhre Resektionen in PBS für bis zu 6 Stunden vor der Verarbeitung nachfolgend beschrieben gelagert werden. Quelle der Ösophagektomie Proben wird diktieren, Probengröße und Laborabhängig sein. </li></ol></li></ol> 2. Isolieren murinen und humanen Ösophagus-Stromazellen <ol><li> Isolieren der Speiseröhre Stromazellen from murinen und menschlichen Gewebes durch eine Kombination von mechanischen und enzymatischen Verdau. <ol><li> Mechanisch verdauen durch Zerkleinern des Gewebes mit einer Schere und mehrmaligem Waschen mit HBSS. Enzymatisch zu verdauen durch Inkubieren des Gewebes mit 300 U / ml Kollagenase XI und 0,1 mg / ml Dispase, für 25 min (murine Gewebe) oder bis zu 6 Stunden (menschliches Gewebe). Stellen Sie sicher, dass Instrumente zur Zerkleinerung verwendet wurden autoklaviert und sterilisiert. HINWEIS: Kollagenasen sind Enzyme, die Kollagen, eine extrazelluläre Matrix zur Aufnahme von tierischem Gewebe zusammen verantwortlich Protein zu brechen. Kollagenase XI hat hohe Collagenase-Aktivität und hat Erfolg in dieser Isolierungsprotokoll gesehen. Dispase ist ein bakterielles Enzym mit milden proteolytische Spaltaktivität, welche Zellmembran-Aktivität bewahrt und wird in Kombination mit Kollagenase als Sekundärenzym verwendet. </li><li> Zeigen Schleimhautfragmente aus der Maus oder menschlichem Gewebe in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen oder 5 ml jeweils erhalten, die HBSS. Mince Gewebe weiterin 2-3 mm große Stücke mit einer Schere mit einem offenen Spitzenbreite, die in ihre Röhrchen passen. Planen Sie ausreichend Zeit, damit für Ösophagus-Schleimhaut-Fragmente an den Boden des Röhrchens sedimentieren. </li><li> Langsam dekantieren HBSS, darauf achten, daß das Gewebe versehentlich zu verwerfen. Ersetzen mit frischem HBSS folgenden durch leichtes Schütteln. Alternativ zu entfernen HBSS mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Waschen Gewebe auf diese Weise insgesamt 8 Mal unter leichtem Schütteln in zwischen den Waschgängen so dass genügend Zeit für Speiseröhren Fragmente zwischen jedem Wasch sedimentieren. HINWEIS: Human Tissue mehr benötigen Hacken, dass Neugeborene Mausgewebe. </li></ol></li><li> Inkubieren murinen Gewebe mit 300 U / ml Kollagenase XI und 0,1 mg / ml Dispase für 25 min auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur eingestellt. <ol><li> Inkubieren menschlichem Gewebe mit 300 U / ml XI Kollagenase und 0,1 mg / ml Dispase für bis zu 6 Stunden, auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur eingestellt. HINWEIS: Die Verfügbarkeit von menschlichen esophagus variabel ist. Menschen Ösophagusmukosa mit Enzymen für bis zu 6 h führt zu erfolgreichen Generation von Primärkulturen inkubiert. </li></ol></li><li> Nach enzymatische Verdauung, Hackfleisch Gewebe weiter mit Schere und Zentrifuge bei 200 g für 10 min. </li><li> Überstand verwerfen. Übertragen der Pellets, die aus einer gemischten Zellsuspension auf eine 5-ml-Röhrchen und waschen 5mal in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 2% Sorbitol ergänzt um nicht lebensfähige Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Samenzellen in 6-Well-Platten und die Kultur in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mg / ml Insulin, 10 ug / ml Transferrin, 10 ug / ml Gentamicin und 2 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) . Vakuumfilter (0,22 um) Alle Komponenten außer EGF die nach Filtration zugesetzt werden können. Verteilen Zellen aus menschlichen Resektionsproben erhalten unter mehreren Platten mit 6 Vertiefungen, abhängig von der Größe der Resektion. </li><li> Sobald Brunnen sind 80% konfluent, Gang anhaftenden Zellen zu T25-Kolben unsing 0,05% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Neutralisieren mit Medien und Spin bei 400 x g. <ol><li> Bei einem 6 gut Gang zu einem T25-Kolben, Passage-Zellen bei einer 1: 1-Verhältnis. 3-Verhältnis: 2 oder 1: Konfluente T25-Kolben kann zu einem 1 agiert werden. Um den Durchgang von einer T25-Flasche mit einem T75-Kolben, mit einem 1: 1 Verhältnis. Medienwechsel alle 2-3 Tage, unabhängig von dem Behälter. </li><li> Wachsen Zellen bei 37 ºC in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator und Kultur in den oben beschriebenen myofibroblast Medien. HINWEIS: Epithelzellen nicht unter diesen Kultur oder Gang Bedingungen zu überleben. Zellen zur Charakterisierung und in den unten beschriebenen Studien verwendet werden, sind zwischen den Passagen 5 und 15. </li><li> Cryo-Erhaltung Zellen in flüssigem N 2 durch Zugabe von 10% Dimethylsulfoxid in die Myofibroblasten Medien. </li></ol></li></ol> 3. Charakterisieren murinen und humanen Ösophagus-Stromazellen <ol><li> Untersuchen Sie die Morphologie der Zellen mit einem inversen Mikroskop. Beachten Sie die spindelförmigeMorphologie der anhaftenden Zellen (Abbildung 1). </li><li> Charakterisierung kultivierten Zellen durch Auswerten der folgenden Zytoskelett-Marker: α-SMA, Vimentin, Desmin und Cytokeratin. Stromazellen mit Myofibroblasten-ähnlichen Phänotyp exprimieren Zytoskelett myofibroblast Marker α-SMA und Vimentin (Abbildung 2). <ol><li> Zur weiteren Unterscheidung kultivierten Stromazellen aus Muskelzellen, für Desmin Immunfärbung. Zur Durchführung des Immunfärbung auf kultivierte Zellen, die Platte 1,5 x 10 4 Zellen in 4-Well-Kammerobjektträgern und wachsen in Myofibroblasten Medien für 24 Stunden. Stromazellen mit Myofibroblasten-ähnlichen Phänotyp wird schwach oder nicht vorhanden Desmin-Expression. Stromalen Zellen fehlt die Expression des epithelialen Marker pan-Cytokeratin (Daten nicht gezeigt). HINWEIS: Bewertung der Kulturen gehört die Bewertung von Zytoskelett Marker durch Immunzytochemie und Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie. Immuncytochemie als primäre Methode zur Charakterisierung als der Ex verwendetpression Profil der Proteine ​​des Zytoskeletts ist einzigartig für den Fibroblasten, Myofibroblasten oder Muskelzelle. Durchflusszytometrie stellt die Reinheit der Kultur durch Auswertung Zelloberflächenexpression von Epithel-, Endothel- und blutbildenden Zellen-Marker. CD90 ist nützlich als Zusatz Verfahren zur Identifizierung von menschlichen Stromazellen, wie es sowohl an menschlichen Fibroblasten und Myofibroblasten ausgedrückt. CD90 ist nicht hilfreich bei der Charakterisierung von murinen Stromazellen, wie es auch von Maus-T-Zellen exprimiert wird. </li></ol></li><li> Nachdem die Zellen erreichen 60% Zusammenfluss gründlich Folien mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und befestigen mit Methanol. Inkubieren Zellen in Methanol für 10 min bei -20 ° C, dann in PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Folgen Sie Standard-Immunfärbung Protokoll. </li><li> Kurz vor dem Aufbringen des primären Antikörpers, blockieren die fixierten Zellen mit 5% goatserum in PBS. Verdünnen Sie primäre und sekundäre Antikörper in 5% Ziegenserum als auch. <ol><li> Für den Nachweis von α-SMA und Vimentin, verwenden Sie dieFolgende Antikörper und Konzentrationen: Mouse mAb zu α-SMA bei 1: 250 Verdünnung und Rabbit pAb zu Vimentin bei 1: 500-Verdünnung. </li><li> Inkubieren mit primärem Antikörper bei Raumtemperatur über Nacht bei 4 ° C, Spülen 3 mal mit PBS und fügen sekundären Antikörper Rhodamin-konjugiertes Ziege-anti-Maus bei einer Verdünnung von 1: 200 und Cy2 konjugierten Ziegen anti Kaninchen bei einer Verdünnung von 1: 1000 für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Gegenfärbung Kerne mit 4 &#39;, 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) in einer Konzentration von 1 ug / ml für 1 Minute und dann mit PBS waschen. Analysieren Sie Dias mit einem inversen Mikroskop. </li></ol></li><li> Reinheit der Kulturen durch die Prüfung der murinen und humanen Ösophagus-Zellen, die für blutbildende (CD45) und Endothelzellen (CD31) Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 3). Charakterisierung menschlicher Zellen durch die Expression von stromalen Zelloberflächenmarker CD90. HINWEIS: CD90 kann nicht verwendet werden, um murine Stromazellen murine T cel identifizierenls drücken auch CD90. <ol><li> Lösen kultivierten Maus Speiseröhren Stromazellen von den Kulturflaschen durch Behandlung mit nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung bei 37 ° C für 10 min, mit FACS-Puffer zweimal gewaschen, gezählt und mit FITC-CD45 und CD31-APC mit relevanten Isotypenkontrollen gefärbten gemäß Standard-Färbeverfahren. </li><li> Sammeln Zellen mittels FACS Calibur und Daten mit FlowJo Software analysieren. Vor dem Färben von Zellen, Antikörper zu optimieren und titriert Konzentrationen mit Isotypkontrollen, normale Maus Milz und Knochenmarkzellen. </li></ol></li></ol>

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Diese Arbeit wird durch NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Bell-Institut für Gesundheit und Ernährungsforschung Scholar Award in Gut Physiologie und Gesundheit (AS) und einem Wright Foundation Pilot Award (AS) unterstützt.

Die Techniken zur Primärkultur Generation sind in der Regel ähnlich bei der Verwendung von murinen oder menschlichen Gewebes mit Hacken und Aufschlusszeiten für Gewebegröße angepasst. Unsere Erfahrungen mit murinen Gewebe schlägt vor, dass mit den oben beschriebenen Methoden konsequent in erfolgreiche Etablierung der Primärkulturen führen. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls sind die Sterilisation von chirurgischen Geräten und folgenden Norm sterile Techniken der Gewebekultur. Das Alter der Mäuse ist a...

Epithelial-stromale Wechselwirkungen an der Regulation einer Vielzahl von Gastrointestinaltrakt Funktionen einschließlich Schleimhautregeneration, Reparatur, Fibrose und Karzinogenese 1,2 beteiligt. Diese Wechselwirkungen sind am besten in den Dünndarm und Dickdarm untersucht und kann in ähnlicher Weise eine Rolle bei der Schleimhaut der Speiseröhre Erkrankungen 3. Eine Subpopulation von Darm und Kolon Stromazellen bezeichnet Myofibroblasten wurde gezeigt, dass bei der Vermittlung der Gewebeschädigung, Entzündung teil und Reparatur 4,5. Im distalen Gastrointestinaltrakt werden diese spindelförmige Zellen angrenzend an die Basalmembran an der Grenzfläche zwischen Epithel und Lamina propria und werden als α-SMA und Vimentin positiv definiert, pan-Cytokeratin negativ und schwach positive oder Desmin negativ 5. Die Speiseröhre Stroma wurde nicht konsequent auf zellulärer oder molekularer Ebene charakterisiert. Unsere Arbeit im murinen Speiseröhre demonstrated α-SMA und Vimentin-Zellen in der Speiseröhre Stroma, gelegentlich darunter liegenden zu dem Plattenepithel 6. Epithelial-Stroma-Wechselwirkungen in der Schleimhaut der Speiseröhre Erkrankungen wie Magen- und Speiseröhren vermittelten Verletzung 6 und eosinophile Ösophagitis 3 in Verbindung gebracht. Fibrotischen Strikturen auch eine bekannte Komplikation der Schädigung der Speiseröhre und Stromazellen in der Pathogenese von gastrointestinalen Fibrose in Verbindung gebracht. Isolation dieser Zellen wird dazu beitragen, zu tun, die notwendigen Studien zur gestörten Signalwege zu untersuchen. Diese Vorlage enthält die erforderlichen Primärkulturen von α-SMA positiv, Vimentin positiven Myofibroblasten, dass bestehende Wissenslücken in Bezug auf Signalwege vermitteln, diese Interaktionen angesprochen werden kann etablieren Techniken. Die beschriebene Technik wurde erfolgreich von den Autoren verwendet wird, um primäre murine Colon Myofibroblasten 7 und furthe etablierenr für die Einrichtung von murinen 6 und Menschen Myofibroblasten-ähnlichen Speiseröhren Stromazellen angepasst. Wir beschreiben hier Bedingungen benötigt, um festzustellen und zu charakterisieren diese Kulturen von Maus oder Mensch Ösophagus vor in Zukunft funktionelle Studien verwenden etabliert. Kulturen angebaut und für bis zu 15 Passagen genutzt werden. Isolation und Etablierung von Primärkulturen über die Methoden unten beschrieben erzeugt Stromazellen mit Myofibroblasten Phänotyp; α-SMA, Vimentin positiv und schwach positiv oder negativ für Desmin und Cytokeratin negativ. Dieser Phänotyp unterscheidet sich vom Phänotyp des Ösophagus Fibroblasten, die überwiegend Vimentin ist positiv, α-SMA negativen 3 oder der α-SMA positiv, Vimentin-negativen Phänotyp des Muscularis mucosae 6.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tissue culture reagents</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>trypsin/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Mouse mAB to &amp;alpha;-SMA&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAB to vimentin</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 conjugated Goat anti Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 conjugated to eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 conjugated to APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V and 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block for CD16/CD32</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>5 ml tube</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet and incubators</td><td>Nuaire</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nuaire.com/products/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.nuaire.com/products/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4-well chamber slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Vacuum-Driven Filter System</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single tipped Q-Tips</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Metamorph software (Molecular Devices)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus

Murine und menschliche Speiseröhre Myofibroblasten werden über enzymatische Verdauung erzeugt. Neugeborene (8-12 Tage alt) murine Speiseröhre wird geerntet, zerkleinert, gewaschen und bis zur enzymatischen Verdau mit Kollagenase und Dispase für 25 min unterzogen. Menschliche Speiseröhre Resektionsproben aus Muscularis propria und Adventitia befreit und der verbleibende Schleimhaut zerkleinert und einem enzymatischen Verdau mit Kollagenase und Dispase für 6 h unterzogen. Kultivierte Zellen exprimieren α-SMA und Vimentin und Desmin ausdrückliche schwach oder gar nicht. Die Kulturbedingungen sind nicht förderlich für das Wachstum von Epithelzellen, hämatopoietische oder Endothelzellen. Kultur Reinheit wird durch durchflusszytometrische Beurteilung der Zelloberflächenmarker Expression potentieller Gefährdungs ​​hämatopoetischen und Endothelzellen bestätigt. Das beschriebene Verfahren ist einfach und führt zu einer konsistenten Erzeugung nicht hematopoieitc nicht endothelial Stromazellen. Einschränkungen dieser Technik sind inhärent auf die Verwendung vonPrimärkulturen in der Molekularbiologie Studien, dh die unvermeidlichen Schwankungen zwischen den Kulturen in den verschiedenen Mäusen oder Menschen fest gestoßen. Primäre Kulturen sind jedoch ein repräsentativer Reflexion des in vivo-Zustand im Vergleich zu Zelllinien. Diese Verfahren stellen auch Forscher die Fähigkeit zur Isolierung und Kultur Stromazellen aus verschiedenen klinischen und experimentellen Bedingungen, so dass Vergleiche zwischen den Gruppen. Dadurch gekennzeichnet Speiseröhren Stromazellen können auch in funktionalen Studien, die epithelial-stromale Wechselwirkungen in Erkrankungen der Speiseröhre verwendet werden.

Ösophagus-Stroma-Zellen isoliert durch mechanische und enzymatische Verdauung werden zunächst vernickelt und in 6-Well-Platten kultiviert. Untersuchung von Zellen mit einem inversen Mikroskop innerhalb von Stunden nach Plattierung zeigt eine gemischte Zellsuspension lose anhaftenden zum Plattenboden (1A). Im Laufe der nächsten 24 Stunden, sind spindelförmige Zellen, fest haft an den Plattenboden beobachtet Aufnahmen aus der gemischten Zellsuspension (1B) .Diese sprießen Zellen auf ...

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Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Aufrufe.  Keck School of Medicine, University of Southern California. We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions. 

Serie: Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Biotechnik

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Biologie

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Medizin

Protokolle für humane Ösophagus-Organoide und Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Pathophysiologie der eosinophilen Ösophagitis

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.

Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis 

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Immunologie und Infektion

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Isolierung des murinen intestinalen Mesenchyms, was zu einer hohen Ausbeute an Telozyten führt

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben

Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis

Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis

Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Isolierung des murinen intestinalen Mesenchyms, was zu einer hohen Ausbeute an Telozyten führt

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten