Authors have nothing to disclose.

protokol hayvan deneyleri, gerekçesini ve araştırma hedeflerini gerçekleştirmek için, Güney Kaliforniya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından sunulan ve kabul edildi. de tanımlanan insan özefajektomi örneklerinden birincil kültürlerin kurulması için protokol Güney Kaliforniya Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Fare ya da İnsan özefagus elde <ol><li> Fare özefagus edinin: <ol><li> Servikal dislokasyon ardından% 2 izofluran uçucu doz aşımı ile 8-12 gün eski fare Euthanize. </li><li> Aşağı yukarı bakacak şekilde göbek ile hayvan pin ve% 70 etanol ile ventral yüzeyi ıslak. Forseps ile yakala ve forseps ile üretral açılış cilt anterior yukarı kaldırın. Çene üretral açılış ventral orta hat boyunca kesmek için standart düz cerrahi makas kullanın. Sadece cildi kesmek için dikkatli olun. &lt;/ Li&gt; <li> &quot;Y&quot; aşağı ters oluşturan, hayvanın her iki tarafta diz aşağı açılış üretral bir kesi yapmak. Göğüs kafesi boyunca hayvanın her iki tarafında bir kesi olun. </li><li> Dikkatle yatan periton ve göğüs kafesinin kapalı, her iki tarafta cilt soyma ve yanlara yatıyordu. Göğüs boşluğu ve karın boşluğunu örten periton örten göğüs kafesini inceleyin. <ol><li> Karın içeriğine zarar görmesini önlemek için yukarı makas işaret, forseps ile periton kaldırın ve diyafram ve göğüs kafesine içinden yukarı kesti. Yavaşça, karaciğer sol lobunu yukarı kaldırın yatan mide, özofagus-mide kavşak ve yemek borusu karın kısmını açığa. </li></ol></li><li> Servikal kuşak kadar orta hat boyunca sternum ve göğüs kafesi üzerinden kesmek için otoklava cerrahi makas kullanın. Nokta makas yukarı göğüs içeriğine zarar görmesini önlemek için. Tam içeriğini açığayanlara göğüs kafesi çekerek göğüs boşluğu. </li><li> Yavaşça kalp ve akciğerlerin her iki lobu kaldırmak. Q-ipuçları aşırı kan emer. Torasik özofagus torakal vertebra trakea ve anterior dar, esnek tüp yalan posterior. NOT: Özofagus kemirgen yenidoğanlarda tespit etmek zor olabilir. Özofagus-mide birleşme lokalizasyonu özofagus kimlik basit hale getirir. </li><li> Dikkatle çevreleyen damar, yağ diseksiyon, mideden yemek borusu takip ve servikal boşluğunda özofagus kökenli kadar tüm yol mezenterinde. Künt uçlu Cerrahi makaslar, bu amaç için en iyi çalışır. </li><li> Aşağıda tarif edilen ileri işlemler için Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde yemek borusu ve yeri tüm uzunluğu rezeke. İsterseniz yönlendirme amaçlı midenin bir kısmını çıkarın. NOT: Küçük doku boyutu nedeniyle, kas gelen muskularis propria ayrılmasımukoza kemirgen yenidoğan yemek borusundaki ulaşılabilir değildir ve tüm özofagus aşağıda açıklanan işlenirken tabi olmasıdır. </li></ol></li><li> İnsan özefagus edinin: <ol><li> HBSS ile özofagus rezeksiyonu örnekleri (genellikle 5 cm veya daha az) yıkayın ve herhangi bir bağlı bağ dokusu, yağ, ya da damarsal çıkarın. </li><li> Numunenin bir kısmını rezeke ve istenirse ileride histolojik inceleme için formalin yerleştirin. </li><li> Keskin diseksiyon ile altta yatan muskularis propria kalan mukoza ayırın. </li><li> Aşağıda açıklanan protokole alt santimetre parçalara mukoza ve konuyu kesin. Not: İnsan özofagus rezeksiyon aşağıda tarif edilen işlemden önce en fazla 6 saat süre ile, PBS içinde saklanabilir. Özefajektomi örneklerinin kaynağı örnek boyutunu belirleyecektir ve laboratuvar bağımlı olacaktır. </li></ol></li></ol> 2. İzolat Kemirgen ve İnsan Özofagus Stromal Hücreleri <ol><li> F özofagus stromal hücreleri izolemekanik ve enzimatik sindirme bir kombinasyonu ile ROM kemirgen ve insan dokusudur. <ol><li> Mekanik HBSS ile makas ve çoklu yıkama ile doku kıyma ile sindirmek. Enzimatik mi, 300 U / kolajenaz XI ve 0.1 mg / 25 dakika (sıçan dokusu) için mi dispaz ile veya en fazla 6 saat (insan dokusu) için doku inkübe edilerek özet. Kıyma haline gelme kullanılan aletler otoklava ve sterilize edilmiş olduğundan emin olun. NOT: Kolajenaz kollajen, birlikte hayvan dokusunu tutan sorumlu bir hücre dışı matriks proteini parçalayan enzimler vardır. Kollajenaz XI yüksek kollajenaz aktivitesine sahiptir ve bu izolasyon protokolü başarı gördü. Dispase hücre membran etkinliğini koruyan ve bir ikinci enzim olarak kolajenaz ile bir arada kullanılan, hafif proteolitik ayrışma etkinliği olan bakteriyel bir enzimdir. </li><li> HBSS içeren, sırasıyla, 1.7 ml mikro-santrifüj ya da 5 ml tüpler içinde, fare veya insan dokusundan elde edilen mukoza fragmanları, yerleştirin. Kıyma yumuşak kağıt olup,İlgili tüpler içine uyacak bir açık uç genişliği ile makas kullanarak 2-3 mm&#39;lik parçalar halinde. Özofagus mukoza parçaları tüpün dibine çöktürmek için yeterli zaman izin ver. </li><li> Yavaş yavaş yanlışlıkla doku atmak için dikkatli olmak, HBSS süzün. Taze HBSS nazik sallayarak aşağıdaki ile değiştirin. Seçenek olarak ise, 1 ml pipet ile HBSS çıkarın. </li><li> Yumuşak özofagus fragmanları, her bir yıkama arasında çöktürmek için süre bıraktıktan yıkamalar arasında çalkalanarak bu şekilde 8 kez olmak üzere toplam doku yıkayın. NOT: İnsan dokusu bu yeni doğan fare doku kıyma daha gerektirecektir. </li></ol></li><li> Mi, 300 U / kolajenaz XI ve oda sıcaklığında yavaş bir hıza ayarlanmış bir sallanan karıştırma cihazı üzerinde, 25 dakika boyunca 0.1 mg / ml dispaz sahip fare doku inkübe edin. <ol><li> Oda sıcaklığında yavaş bir hızda ayarlanan bir sallanan bir karıştırıcı üzerinde, en fazla 6 saat süre ile, 300 U / ml kolajenaz XI ve 0.1 mg / mL dispase insan dokusu inkübe edin. NOT: İnsan özofajit kullanılabilirliğiGus değişkendir. İnsan özofagus mukoza primer kültürlerinde başarılı nesil kadar 6 saat sonuçlar için enzimler ile inkübe. </li></ol></li><li> Enzimatik sindirimden sonra 10 dakika süreyle 200 x g&#39;de makas ve santrifüj ile daha da kıyma dokusudur. </li><li> Süpernatantı atın. Cansız hücreler ile döküntüleri gidermek için% 2 sorbitol ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde 5 kez 5 ml&#39;lik bir tüpe, bir karma hücre süspansiyonu oluşan pelet aktarın ve yıkayın. </li><li> % 10 cenin sığır serumu ile DMEM içinde 6 oyuklu plakalar ve kültür (FBS), 10 mg / ml insülin, 10 ug tohum hücre / ml transferin, 10 ug / ml gentamisin ve 2 ng / ml, epidermal büyüme faktörü (EGF) . Vakum filtre (0.22 um) süzülerek sonra ilave edilebilir EGF hariç tüm bileşenler. Rezeksiyon boyutuna bağlı olarak, birden çok 6-yuvalı plakalar içinde insan reseksiyon örneklerinden elde edilen hücreler dağıtın. </li><li> Kuyular% 80 konfluent sonra, T25 için geçiş yapışan hücreler bize şişeleriing% 0.05 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA). 400 x g&#39;de medya ve spin ile nötralize edin. <ol><li> Bir T25 şişesi bir 6 yuvalı geçişi için, bir 1 pasaj hücreleri: 1 oranında. 2 ya da 1: 3 oranında konfluent T25 şişesi 1 ile geçişli olabilir. 1 oranı: T75 şişeye bir T25 şişesi geçit, 1 kullanın. 2-3 günde olursa olsun geminin Değişim medya. </li><li> Yukarıda tarif edilen miyofibroblast ortam içinde, nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatöründe ve kültür 37 ° C&#39;de hücreler büyür. NOT: Epitel hücreleri, bu kültür veya geçit koşullarında hayatta yoktur. Karakterizasyonu için ve aşağıda tarif edilen çalışmalarda kullanılan hücreler geçitlerin 5 ile 15 arasında bulunmaktadır. </li><li> Miyofibroblast ortam,% 10 dimetil sülfoksid ekleyerek sıvı N 2 hücreleri Kriyo-koruma. </li></ol></li></ol> 3. karakterize Kemirgen ve İnsan Özofagus Stromal Hücreleri <ol><li> Bir ters mikroskop ile, hücrelerin morfolojisi inceleyin. Mili-şekilli gözlemlemekYapışık hücrelerin morfolojisi (Şekil 1). </li><li> Α-SMA, vimentin, desmin ve sitokeratin: Aşağıdaki hücre iskeleti belirteçlerin değerlendirilmesi ile kültür hücreleri karakterize etmektedir. Bir miyofibroblast gibi fenotip ile stromal hücreler α-SMA ve vimentin (Şekil 2) sitosköletal miyofibroblast belirteçler. <ol><li> Daha fazla desmin için immunostain kas hücreleri, kültürlü stromal hücreler ayırt etmek. Kültürlenmiş hücreler imüno gerçekleştirmek için, 4-çukurlu oda slaytlar 1.5 x 10 4 hücrelerini plaka ve 24 saat süre ile miyofibroblast ortamında büyür. Bir miyofibroblast gibi fenotip ile stromal hücreler zayıf ya da hiç desmin ifadeye sahip olacak. Stromal hücreler epitel işaretleyici pan-sitokeratin ifadesini eksikliği (veriler gösterilmemiştir). NOT: kültürlerin Değerlendirme akış sitometri immünsitokimya ve hücre yüzey belirteçleri ile hücre iskeleti belirteçlerin değerlendirilmesini içerir. İmmünositokimya ex olarak karakterizasyonu birincil yöntem olarak kullanılmaktadırhücre iskeleti proteinleri sıkıştırma profili fibroblast, miyofibroblastm veya kas hücre için benzersizdir. Akış sitometrisi, epitel, endotelyal ve hematopoietik hücreler belirteçlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu değerlendirmek kültür saflığı kurar. CD90 insan fibroblast ve miyofibroblastlar hem de ifade insan stromal hücreler belirleme yardımcı bir yöntem olarak yararlıdır. Aynı zamanda fare T hücreleri tarafından ifade edilen CD90 kemirgen stromal hücrelerin karakterizasyonu yararlı değildir. </li></ol></li><li> Hücreler% 60 kaynaşmaya eriştikten sonra, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile slaytlar yıkayın ve metanol ile sabitleyin. -20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca metanol içinde hücreleri inkübe edilmiş, sonra kullanılana kadar 4 ° C de PBS içinde depolar. </li><li> Standart immünoboyama protokolünü izleyin. </li><li> Kısaca, birincil antikor tatbik edilmesinden önce, PBS içinde% 5 goatserum ile sabitleştirilmiş hücreler bloke eder. Yanı% 5 keçi serumu içinde birincil ve ikincil antikorlar ile seyreltilir. <ol><li> Α-SMA ve vimentin tespiti için kullanımıAşağıdaki antikorlar ve konsantrasyonları: Fare mAK α-SMA 1 de: 500 seyreltme: 1 de vimentin 250 seyreltme ve Tavşan PAB. </li><li> Gece boyunca 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında primer antikor ile inkübe 3 defa PBS ile yıkayın ve 1 arasında bir seyreltme Rodamin konjuge keçi anti-fare sekonder antikor ekleyin: 1 saat süre ile 1000: 1 arasında bir seyreltme 200 ve Cy2&#39;nin konjuge keçi anti-tavşan oda sıcaklığında karıştırılmıştır. </li><li> Counterstain çekirdekler 4 ile &#39;, 1 dakika boyunca 1 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) ve daha sonra, PBS ile yıkayın. Bir ters mikroskop ile slaytlar analiz. </li></ol></li><li> Hematopoietik için, sıçan ve insan yemek borusu hücre elde edilmesi (CD45) ve akış sitometrisi ile endotelyal (CD31) hücre yüzey markörlerinin (Şekil 3) kültürler saflığını oluşturulması. Stromal hücre yüzey işaretleyici CD90 ekspresyonu ile ayrıca insan hücreleri karakterize eder. Not: CD90 fare T cel murin stromal hücreleri tanımlamak için kullanılamazls da CD90 ifade eder. <ol><li> , Iki kez FACS tamponu ile yıkandı, sayıldı ve ilgili izotop kontrol FITC-CD45 ve APC-CD31 ile lekelenmiştir, 10 dakika için 37 ° C &#39;de enzimatik olmayan ayrıştırma çözeltisi ile muamele etmek suretiyle, kültür şişelerinden kültürlenmiş fare özofagus stromal hücreleri ayırmak göre Standart boyama işlemlerine. </li><li> FACS Calibur kullanarak hücreleri toplamak ve FlowJo yazılımı ile verileri analiz. Lekeleme yapan hücrelerin önce, antikorları en iyi duruma getirmek ve izotip kontrolleri, normal fare dalak ve kemik iliği hücreleri kullanılarak konsantrasyonlarda titre edilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair.">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li><li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria.">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Helper+2+Cytokines,+Transforming+Growth+Factor+beta1,+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis.">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts.">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response.">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion.">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities.">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li></ol>

Bu çalışma Gut Fizyoloji ve Sağlık (AS) ve Wright Vakfı Pilot Ödülü (AS) NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), Sağlık AGA-General Mills Bell Enstitüsü ve Beslenme Araştırmacı Ödülü tarafından desteklenmektedir.

doku boyutu için uyarlanmış kıyma ve sindirim kez sıçangil ya da insan doku kullanıldığında, birincil kültür oluşturulması için teknikler genellikle benzerdir. Sıçangil doku ile olan deneyim, yukarıda tarif edilen metotlar kullanılarak sürekli olarak primer kültürlerinde başarılı bir şekilde kurulmasının neden olduğunu göstermektedir. Protokol kapsamında Kritik adımlar cerrahi ekipman sterilizasyon ve doku kültürü standart steril teknikler şunlardır. farelerin yaş da önemli bir ad?...

Epitel-stromal etkileşimleri mukozal rejenerasyon, onarım, fibrozis, ve karsinogenezinde 1,2 olmak üzere gastrointestinal sistem fonksiyonları çeşitli düzenlenmesinde rol oynar. Bu etkileşimler en küçük bağırsak ve kolon incelenmiş ve benzer özofagus mukoza bozuklukları 3 rol oynayabilir. Bağırsak ve kolon stromal hücreler olarak adlandırılan rolü in bir alt popülasyonu, doku yaralanması, iltihaplanma aracı katılmak ve 4,5 onarmak için gösterilmiştir. Distal GI, bu iğ biçimli hücreler epiteli ve lamina propria arasındaki arayüzde bazal membran bitişik bulunan ve α-SMA ve vimentin olarak tanımlanan olumlu,-pan sitokeratin negatif ve zayıf pozitif veya negatif desmin 5. özofagus stroma sıkı bir hücresel ya da moleküler düzeyde olmamıştır. Kemirgen özofagusta Çalışmalarımız de ettimonstrated α-SMA yassı epitel 6 bazen alttaki özofagus stromada ve vimentin hücreleri. Epitel-stromal etkileşimler gibi gastro-özofageal aracılı yaralanma 6 ve eozinofilik özofajit 3 gibi özofagus mukoza bozuklukları suçlanmıştır. Fibrotik darlıklar gastrointestinal fibrozis patogenezinde suçlanmıştır özofagus yaralanması ve stromal hücrelerin bilinen bir komplikasyonudur. Bu hücrelerin izolasyonu dengesiz sinyal yolları araştırmak için gerekli çalışmaları gerçekleştirmek yardımcı olacaktır. Bu başvuru, bu etkileşimlerin aracılık sinyal yollar ile ilgili bilgi mevcut boşluklar ele alınabilir şekilde α-SMA pozitif, vimentin pozitif miyofibroblastlar birincil kültürleri kurmak için gerekli teknikleri sağlar. açıklanan teknik başarıyla birincil kemirgen kolon miyofibroblastlar 7 ve furthe kurmak için yazarlar tarafından kullanılmıştırr murin 6 ve insan miyofibroblast gibi özofagus stromal hücrelerin kurulması için uyarlanmış. Bu yazıda kurmak ve fare veya gelecekteki fonksiyonel çalışmalarda kullanmak için önce insan özofagus kurulan bu kültürleri karakterize için gerekli koşulları açıklar. Kültürler büyütülür ve yukarı 15 geçişleri için kullanılabilir. Aşağıda gösterilen yöntemler aracılığıyla izole edilmesi ve primer kültürlerin kurulması miyofibroblast fenotip ile stromal hücreler oluşturur; , vimentin pozitif ve zayıf pozitif veya negatif desmin ve sitokeratin negatif-SMA α. Bu fenotip, ağırlıklı olarak vimentin pozitif olan özofagus fibroblast fenotipi, negatif α-SMA 3 veya müsküler mukozanın 6 α-SMA pozitif, vimentin negatif fenotipi ayrıdır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tissue culture reagents</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>trypsin/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Mouse mAB to &amp;alpha;-SMA&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAB to vimentin</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 conjugated Goat anti Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 conjugated to eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 conjugated to APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V and 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block for CD16/CD32</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>5 ml tube</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet and incubators</td><td>Nuaire</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nuaire.com/products/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.nuaire.com/products/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4-well chamber slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Vacuum-Driven Filter System</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single tipped Q-Tips</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Metamorph software (Molecular Devices)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus

Mürin ve insan özofagus miyofibroblastlar enzimatik sindirme ile oluşturulur. Yenidoğan (8-12 günlük) sıçangil yemek borusu, hasat kıyılmış, yıkandı ve 25 dakika boyunca kolajenaz ve dispaz ile enzimatik sindirme tabi tutulur. İnsan özofagus rezeksiyonu örnekleri muskularis propria ve adventisyanın elimden ve kalan mukoza kıyılmış edilir ve en fazla 6 saat kollajenaz ve dispase ile enzimatik sindirim tabi. Kültürlü hücreler α-SMA ve vimentinin ve ekspres desmin zayıf veya hiç ifade eder. Kültür şartları, epitel, hematopoietik, veya endotel hücrelerinin büyümesi için elverişli değildir. Kültür saflığı daha fazla potansiyel tehlike hematopoietik ve endotel hücrelerinin hücre yüzeyi işaretleyicisi ifade akış sitometrik değerlendirilmesi ile doğrulanır. Kullanılan teknik, basit ve non-hematopoetik olmayan endotel stromal hücrelerin sürekli üretimi ile sonuçlanır. Bu tekniğin Sınırlamalar kullanımına doğasında vardıryani moleküler biyoloji çalışmalarında, birincil kültürleri, kaçınılmaz değişkenliği farklı fareler ve insanlarda arasında kurulan kültürler arasında karşılaştı. Birincil kültürler, ancak hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında in vivo olarak durumunun daha iyi temsil yansımasıdır. Bu yöntemler ayrıca, araştırmacılar, gruplar arasındaki karşılaştırmalar sağlayan izole yeteneği, farklı klinik ve deneysel koşullardan elde edilen kültür stromal hücreler, sağlar. Özelliği özofagus stromal hücreleri, özofagus hastalıklarda epitelyal, stromal etkileşimlerinin araştırılması fonksiyonel çalışmalarda da kullanılabilir.

Mekanik ve enzimatik sindirim kullanılarak izole özofagus stromal hücreler ilk olarak kaplama ve 6 yuvalı plakalar içinde kültürlendi. Kaplama birkaç saat içinde, bir inverted mikroskop ile hücrelerin incelenmesi plaka tabanı (Şekil 1A) gevşek bir biçimde, bir karma hücre süspansiyonu gösterir. Bir sonraki 24 saat içinde, plaka alt kısmında sıkıca yapışık iğ şeklinde hücreler karma hücre süspansiyonu çimlenme hücreler, 5 gün içinde tüm alanını kaplar ve şekil tutma ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus at JoVE.com

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Görüntüleme.  Keck School of Medicine, University of Southern California. We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions. 

Video: Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Gelişim Biyolojisi

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Biyomühendislik

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Biyoloji

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Tıp

İnsan Özofagus Organoidleri ve Hava-Sıvı Arayüz Kültür Protokolleri

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

Yazar Spotlight: Eozinofilik Özofajitin Patofizyolojisinin Araştırılması

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.

Eozinofilik Özofajitte Epitel Bariyerini Araştırmak İçin Üç Boyutlu Hücre Kültürü Modelleri 

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Murin bağırsak mezenkiminin izolasyonu yüksek telosit verimi ile sonuçlanır

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

Eozinofilik Özofajitte Epitel Bariyerini Araştırmak İçin Üç Boyutlu Hücre Kültürü Modelleri

Eozinofilik Özofajitte Epitel Bariyerini Araştırmak İçin Üç Boyutlu Hücre Kültürü Modelleri

Eozinofilik Özofajitte Epitel Bariyerini Araştırmak İçin Üç Boyutlu Hücre Kültürü Modelleri

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Murin bağırsak mezenkiminin izolasyonu yüksek telosit verimi ile sonuçlanır

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu