Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

1. הכנת תשתית לצלחות 96-היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מפה של הצלחת 96-היטב המתארת ​​את מצעים השונים ותא-סוגים להיבדק (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את מניית הפתרונות של מצעים שונים [poly-L- ליזין, פיברונקטין, קולגן סוג אני, laminin, וIV-laminin entactin-קולגן (ECL)], צלחת ו96-היטב multiwell להכין תחנת עבודה בתרבית תאים סטריליים מכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מצעים בודדים על ידי דילול מניות בפוספט סטרילי שנאגרו (PBS) לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מיליליטר (ריכוז זה נקבע בעבר על בסיס assay תלוי ריכוז מצע לצמיחה והתפשטות של תאים). מערבבים בעזרת מערבולת לפני המזיגה למאגר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון מצע 100 μl היטב לתוך כל אחד על פי מפת 96-היטב (איור 1) (micropipette 12 או ערוץ 8-נוח לmicropipetting לתוך צלחת 96-היטב). לאטום את המכסה לצלחת 96-היטב באמצעות רצועה של Parafilm ולאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> הדמיה ציפוי והזמן לשגות 2. תא הערה: עכבר MSCs היו מבודד ממוח העצם של מבוגרים C57BL / 6 עכברים ומתוחזק כקו תא חסיד. MSCs היו נגוע באמצעות וקטורי lentiviral להנדס אותם להפריש המופק במוח גורם neurotrophic (BDNF; cDNA אדם) וגורם נוירוטרופי שמקורן בתאים גליה (GDNF; cDNA אדם) באמצעות של וקטור lentiviral BDNF (LV-BDNF קידוד; CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), וירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). הערה: תקשורת תרבות לתאי גזע mesenchymal העכבר (MSCs) היא השינוי בינוני של Iscove של Dulbecco המכיל 10% בסרום hybridoma מוסמך שור עוברי, 10% בסרום סוסים, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, ו10,000 U / פניצילין מיליליטר, 10 מ&quot;ג / סטרפטומיצין מיליליטר . חמישה סוגים שונים של תאי גזע של עכבר (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-Mמאמנים וBDNF / GDNF-GFP-MSCs) היו מצופים בנקודת מפגש כ -30% בצלוחיות תרבית תאי T75. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא, להסיר את פתרונות מצע על ידי שאיפה ולשטוף היטב כל אחד עם כ -200 μl של PBS סטרילי, פעמיים. הוסף מדיה תרבית תאים (200 μl / טוב) זה טוב אחרי שטיפת PBS הסופית. מניחים את צלחת 96-גם לתרבית תאי חממה נקבעה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לאיזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הצלחת 96-היטב היא equilibrating בחממה, לקצור את התאים (תאי גזע בצלוחיות T75 צריך להיות כ 70% ומחוברות בזמן קציר / ציפוי) על ידי איסוף תקשורת הצמיחה (המכונה בתקשורת מותנית כ) מהבקבוק T75 ו אחסון בצינור חרוטי 15 מיליליטר בתנאים סטריליים (תקשורת מותנית זה תשמש בשלב 2.1.4 להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מיליליטר של PBS סטרילי לבקבוק ועדינות מערבולת ואז פיפטה את PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של טריפסין 0.05% ושל 0.01%פתרון EDTA לנתק את התאים ממשטח התרבות של בקבוק T75. צג ניתוק תא על ידי צפייה בבקבוק באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת באופטיקה בניגוד שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים יש מנותקים, להוסיף באופן מיידי 8 מיליליטר של התקשורת המותנה (שנאסף בשלב 2.1.2) לבקבוק. אסוף את ההשעיה התא ולהעביר לצינור 15 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה ו צנטריפוגות למשך 4 דקות ב 450 XG לגלולת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 200 μl של טרי וחימם תקשורת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר התאים בהשעית התא על ידי ביצוע ספירת תאי trypan כחולה קיימא באמצעות hemocytometer. צלחת התאים בצפיפות של כ -300 תאים / גם לתוך הבארות המתאימות של 96 גם הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים אלה עבור כל אוכלוסייה של תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן לשגות הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל MSCs כבר מצופה, מקוםצלחת 96-היטב לחממה עבור שעה 2 כדי לאפשר לMSCs לצרף המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל את מערכת HCS ולהמתין לשעה 2 למערכת כדי לאזן. הגדר את בקר הסביבתי עד 37 מעלות צלזיוס ולהתחבר בלון גז מעורב המכיל 5% CO 2 באוויר לתא הסביבתי מערכת HCS אספקת מקור אוויר קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת 96-היטב מן החממה לאחר תקופת איזון שעה 2 ומקום ישירות לתוך תא צמיחת תאים של מערכת HCS. לאפשר 30 דקות לאיזון לדין וחשבון על כל הרחבה הקשורות לחום של הצלחת ולאחר מכן להפעיל את תוכנת רכישת תמונה וניתוח כדי לקבוע את הגדרות הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מטרת 20X להדמיה. בחר שתי בארות לכל מצב [כלומר, GFP-MSCs על פיברונקטין וכו &#39;(6 מצעים x 5 תת MSC עבור הסכום כולל של 30 תנאים x 2 משכפל = 60 בארות בסך הכל)] להקמת הדמיה הזמן לשגות. בחר שני אתרים להדמיה עםבכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אורכי גל האור הנכונים להדמיה. הערה: שני אורכי גל שונים (בניגוד שלב וקרינת GFP), שנבחרו לזמן לשגות הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בתחתית גם באמצעות פוקוס אוטומטי לייזר ולקחת תמונות מבחן למספר רבים של אתרים ובארות רבות למצוא מישור מוקד מותאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמוקד כבר נקבע, להתחיל בלכידת תמונות כל 5 דקות במשך 48 שעות לכל 60 בארות (120 אתרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את התאים בכל שעה 24 על ידי הסרת הצלחת 96-היטב ממערכת HCS. הסר 75 μl של תקשורת מכל טוב ולהוסיף תקשורת טרי 100 μl היטב כל אחד (לאזן תקשורת טרי זה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של ניסוי הזמן לשגות, להסיר את הצלחת 96-היטב ממערכת HCS. בתנאים סטריליים, לאסוף דגימות התקשורת המותנות מכל טוב ולהעביר דגימות אלה למשנהו צלחת 96-היטב. הערה: דגימות אלה יכולים לשמש לanalys נוסףהוא על ידי ביצוע ELISA לגורמי neurotrophic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחת 96-היטב עם MSCs התרבותי למבחנים נוספים, כגון assay התפשטות תאי Ki67 או יודיד propidium החי assay צביעה מת / (ראה פירוט בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח הזמן לשגות הדמיה למעקב הגירה / תא תא כאמור בסעיף 5 להלן. </li></ol></li></ol> התפשטות תאי 3. Ki67 ויודיד Propidium Live / Assay המלח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cell Ki67 הפצת הנשק Assay (Immunocytochemistry) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תרביות תאים עם 0.1 פוספט M (4 PO) חיץ לרגע אחד שתי פעמים. תקן את התרבות עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את PFA ולשטוף את הבארות עם PBS במשך שבע דקות, שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הסופית, להוסיף פתרון של חוסם 100 μl (מלוח חיץ פוספט, 5% בסרום חמור רגיל, 0.4% בסרום אלבומין שור, ו -0.2% Triton X-100) לכל אחד גםnd דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. הכן את הנוגדן הראשוני, ארנב נגד Ki67, על ידי דילול בפתרון חוסם ביחס עבודה של 1: 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון חוסם וליישם את פתרון הנוגדן הראשוני 100 μl היטב כל אחד. מכסה את צלחת 96-היטב דגירה הדגימות ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא, להסיר את פתרון הנוגדן ולשטוף עם PBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנוגדנים משני, חמור נגד הארנב Cy3 בחסימת פתרון ביחס עבודה של 1: 500. להוסיף כתם גרעיני DAPI לפתרון נוגדנים משני בדילול של 1: 100. לאחר הסרת שטיפת PBS האחרונה, חל מפתרון הנוגדן / DAPI המשני לכל 100 μl היטב. דגירה בטמפרטורת חדר בחושך במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן / פתרון DAPI המשני ולשטוף היטב עם כל PBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. מכסה את צלחת 96-היטב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד הדמיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Propidium יודיד Live / Assay המלח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד מוות של תאים על ידי יודיד propidium assay הדרה (PI) כפי שיתואר להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון כתם יודיד propidium בריכוז של 1.5 מיקרומטר בתקשורת ובתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של 70% אתנול 100 μl ולאחת מMSCs 2 דקות עם הכוונה להרוג תאים אלה. גם זה משמש כביקורת חיובית לכתם לצרכן. רוב MSCs יהיה המציין מוות של תאים מוכתמים PI. הסר את פתרון אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון כתם יודיד propidium 100 μl לכל היטב דגירה במשך 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים עם חיץ פוספט 0.1 M דקות 1, 2 פעמים. תקן את התאים עם 4% PFA ב 0.1 חיץ M P0 4 במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את PFA ולשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם פתרון DAPI (01:50) בדילול מלא בפתרון חוסם עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. יש לשטוף את כל הבארות עםPBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון DAPI ולשטוף היטב עם כל PBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. מכסה את צלחת 96-היטב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד הדמיה. </li></ol></li></ol> ניתוח 4. אוטומטי הדמיה וMultiwavelength ניקוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון צלחת 96-היטב (מעובד בעבר עבור immunolabeling Ki67 או מוכתם יודיד propidium) למערכת HCS ולאפשר את הצלחת לאזן במשך 20 דקות פתחו את תוכנת רכישת תמונת מערכת וניתוח HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הגדרות רכישה למטרת 10X באמצעות המצלמה binning ליום 1 ובהגדרת רווח של 2. מצא את Z-המטוס שבו התאים מתגוררים על ידי ניצול פונקצית החשיפה האוטומטית ולחשב את הקיזוז לכל אורך גל של עניין. בניתוח זה, ללכוד תמונות לDAPI (W1), Cy3 (W2), וFITC (W3). בחר את רמת העצמה המקסימלית שבבארות השליטה השליליות להראות שום אות לרכישת תמונה. לאשר הגדרה זו מתאים לקופהבארות itive. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש צלחת. צלם תמונות ולאחסן אותם ברכישת התמונה ותוכנה באתר של ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתמונות נרכשו, תוכנת תמונה פתוחה רכישה וניתוח לא מקוונת וצלחת סקירת נתונים מהתמונות שנרכשו לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ניתוח ניקוד Multi-גל. הגדר את המינימום ומקסימום עוצמות לכל אורך גל. הערה: זיהוי DAPI אמור לסמן את ההכתמה מסביב לכל גרעין גלוי. Cy3 אמור לזהות את התאים החיוביים עם immunoreactivity Ki67 (IR) ולא צריך לזהות IR תחת הבקרה השלילית. לCy3 Ki67 IR, הרוחב המינימאלי המשוער היה 7 מיקרומטר, רוחב מרבי משוער היה 30 מיקרומטר, העצמה מעל הרקע המקומי הייתה 150 רמות אפורות, ואת האזור המוכתם המינימאלי היה 50 מיקרומטר 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח לרוץ לכל העמדות. לייצא את הנתונים כדי להציג בגיליון אלקטרוני. </li></ol> מעקב 5. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> acquisitio תמונה פתוחהn ותכנית ניתוח ולחץ על &quot;נתונים פלייט הסקירה [DB] ...&quot;, בחירת הצלחת של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את הנתונים כ&quot; זמן לעומת ובכן &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אחד מהאתרים מהמדור &quot;האתרים&quot; על ידי הקלקה על הבחירה הרצויה. בחר באפשרות &quot;מועבר ...&quot; תחת &quot;אורכי הגל:&quot;. לחץ לחיצה ימנית על היעד גם בתבנית צלחת 96-היטב ולחץ על &quot;תמונות טען&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר התאים על ידי לחיצה על &quot;Apps&quot; ולאחר מכן &quot;אובייקטי מסלול&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;Dynamic Data Exchange (DDE)&quot; לבחור את הפורמט כדי לייצא את הנתונים, למשל, Microsoft Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את נתוני מעקב ליצוא, למשל, זמן שחלף, מספר אובייקט, מרחק, מרווח זמן, מהירות, זווית מוחלטת, מרחק למקור, x ו- y דלתא הדלתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתייג כל תא של עניין עם &quot;מקש Ctrl + לחיצה השמאלית&quot; על תאי יעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מסלול. אם יש צורך, להפסיק / לשנות מעקב לא תקין של תאים עם המקש &quot;Esc&quot; ולאחר מכן להתאים את ההגדרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מעקב התא הוא מלא, לשמור את הנתונים עם &quot;יומן נתונים&quot;. </li></ol>

<ol>
	<li>Thoenen, H., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins:+from+enthusiastic+expectations+through+sobering+experiences+to+rational+therapeutic+approaches.">Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches.</a> Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).</li><li>Park, H., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+regulation+of+neural+circuit+development+and+function.">Neurotrophin regulation of neural circuit development and function.</a> Nature reviews. 14, 7-23 (2013).</li><li>Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+for+midbrain+dopaminergic+neurons.">GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.</a> Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).</li><li>Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+and+migration+of+human+bone+marrow+stromal+cells+implanted+in+the+brains+of+albino+rats--similarities+to+astrocyte+grafts.">Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).</li><li>Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+strategy+for+cell+and+gene+therapy:+harnessing+the+power+of+adult+stem+cells+to+repair+tissues.">One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).</li><li>Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+of+the+spinal+cord+following+intravenous+delivery+of+bone+marrow+cells.">Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells.</a> Glia. 39, 229-236 (2002).</li><li>Hofstetter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+stromal+cells+form+guiding+strands+in+the+injured+spinal+cord+and+promote+recovery.">Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).</li><li>Chopp, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+neural+injury+with+marrow+stromal+cells.">Treatment of neural injury with marrow stromal cells.</a> Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+marrow+stromal+cells+restores+cerebral+blood+flow+and+reduces+cerebral+atrophy+in+rats+with+traumatic+brain+injury:+in+vivo+MRI+study.">Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study.</a> Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).</li><li>Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+into+acid+sphingomyelinase-deficient+mice+delays+the+onset+of+neurological+abnormalities+and+extends+their+life+span.">Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).</li><li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+BDNF-secreting+mesenchymal+stem+cells+provides+neuroprotection+in+chronically+hypertensive+rat+eyes.">Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52, 4506-4515 (2011).</li><li>Arnhold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirally+transduced+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+pigment+epithelial+cells+and+induce+rescue+effects+in+RCS+rats.">Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 47, 4121-4129 (2006).</li><li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+transplantation+of+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+delays+retinal+degeneration+in+the+RCS+rat+model+of+retinal+degeneration.">Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration.</a> Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).</li><li>Xia, X., Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+a+high-content+screening+approach+to+stem+cell+research+and+drug+discovery.">Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+a+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow.">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418, 41-49 (2002).</li><li>Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+and+human+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+neurons.">Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).</li><li>Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+as+therapeutic+agents+and+potential+targeted+gene+delivery+vehicle+for+brain+diseases.">Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).</li><li>Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+features+of+mesenchymal+stem+cells.">Neuroprotective features of mesenchymal stem cells.</a> Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).</li><li>Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells+in+spinal+cord+injury,+regenerative+medicine+and+possible+clinical+applications.">The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications.</a> Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+lentivirus-mediated+TH+and+GDNF+genetic+engineering+mesenchymal+stem+cells+on+Parkinson's+disease+rat+model.">The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model.</a> Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).</li><li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+released+from+engineered+mesenchymal+stem+cells+attenuates+glutamate-+and+hydrogen+peroxide-mediated+death+of+staurosporine-differentiated+RGC-5+cells.">Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells.</a> Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).</li><li>Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+human+embryonic+stem+cell-derived+hN2+cells+using+automated+high-content+image+analysis.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis.</a> Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).</li></ol>

עמלות פרסום למאמר זה וידאו נתמכו על-ידי התקנים מולקולריים, LLC.

תאים בוגרים mesenchymal גזע (תאי גזע) הם סוג תא אטרקטיבי לפיתוח אסטרטגיה ניסיונית שילוב טיפול מסירה סלולארי וגן מבוסס. MSCs הוא multipotent, מסוגל להבדיל לתוך תאים של שושלת mesodermal, ולהציג גמישות רבה, הבחנה / transdifferentiating לשושלות עצביות וגליה עם האינדוקציה המתאימה פרדיגמות 17,18. יתר על כן, MSCs הושתל והוכח כיעיל במחקרים פרה-קליניים למספר ההפרעות, לרבות תנאים ניווניות 19. היעילות הטיפולית של MSCs ידוע בשל אנטי-השגשוג מועיל, פעילות אנטי-דלקתית ואנטי-האפופטוזיס 20. MSCs ידוע גם לייצר ולהפריש גורמי neurotrophic וצמיחה שונים, שסביר להניח תורמים לאיכויות neuroprotective הקשורים MSCs הנאיבי לאחר השתלה באתרים של פציעה או מחלה 21. Importantly, MSCs ניתן מהונדס גנטי לאספקה ​​רצופה של גורמי neurotrophic עבור יישומים מבוססי ריפוי גנטי סלולארי ומשולבים והיה בשימוש במספר המודלים של בעלי החיים של פציעה או מחלה ל11,19,22 CNS. בפיתוח אסטרטגיה המבוססת על טיפול תאי וגנטי בשילוב, חשובה שבריאותם של התאים מוערכת בזהירות, ובמיוחד בלפני השימוש הנרחב שלהם במבחנת יישומי vivo. כהוכחה של מושג, שחקרנו אוכלוסיות מרובות של קווים מהונדסים וMSC שליטה כדי ללמוד את ההשלכות של השינויים הגנטיים על בריאות תא וכושר באמצעות גישת הקרנת תוכן גבוהה (HCS). באופן כללי, HCS מתייחס להקרנת תפוקה גבוהה סלולרית מבוסס תמונה 14. גישה זו מאפשרת הקרנת הערכה כמותית של פנוטיפים סלולריים במספר הרמות של מרחבי (תא subcellular) ובזמן (אלפיות השניה לימים) מילolution פני תנאי ניסוי שונים. שימוש בגישה זו אנו ניגשים הבדלים אפשריים בהעדפת מצע על הפרמטרים הבאים: התפשטות תאים, ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מוות של תאים, ותנועתיות תא / הגירה. ניסויים תוכננו בפורמט צלחת תרבית תאי 96-היטב. בתוך צלחת אחת חקרנו באופן שגרתי הבדלים הקשורים למצע האפשר ביחס לכל אחד מפרמטרים לאוכלוסיות השונות של תאי MSC-transduced lentiviral והשוואת MSCs המהונדס עם המקורי MSCs, שאינו transduced. זה סיפק אמצעים כדי להשוות ישירות את התוצאות עבור תת-הסוגים השונים MSC עם סוללה של מבחני במבחנה כגון התפשטות תאים באמצעות immunolabeling Ki67, assay כדאיות תא חי / מת באמצעות מכתים יודיד propidium, והתנהגות תא על ידי ביצוע הדמיה דיגיטלית זמן לשגות . כשלוחה של HCS זה ניתן גם לבצע ELISAs על דגימות שנאספו מתקשורת מותנית w הבודדאמות כדי לקבוע כמותית הפרשה של גורמי neurotrophic. גם תקשורת אוויר מתת MSC שונה ניתן להשתמש במבחנת bioassays כדי לקבוע פעילות ביולוגית של גורמים מופרשים 11,23. גם זה סוג של פלטפורמת HCS עשוי לשמש למדידות במבחנה של תולדת neurite מתרבויות עצביות עיקריות ושורות תאי גזע עצביות 24. בסך הכל, התוצאות שלנו הראו כי תת-האוכלוסיות של תאי הגזע המהונדסים הגנטית המוצגות התנהגויות דומות בהשוואה לתאי הגזע מהונדס-אי. ההשפעה של מצעי תרבות מגוונים על צמיחת תאים ונדידת תאים לא הייתה שונה באופן דרמטי בין תת MSC, כמו גם מצעי תרבות. ככזה, מצעי המטריצה ​​תאיים נבדקו לא הופיעו לשחק תפקיד קריטי בויסות היבטים של התנהגות תא אלה לMSCs המהונדס השונים הללו. מחקר זה מדגים את השימוש במערכת HCS לניתוח בידולהיבטי t של התנהגות תא. עם זאת, אין זה נדיר להיתקל במגבלות הקשורות לניתוח תמונה. בהזדמנות, תוך ניתוח תמונות הקרינה, זה היה קצת קשה לקבוע את ערך הסף הנכון שמעליו immunolabeled או תאים מוכתמים יהיו נספר שכותרתו חיובית / מוכתם. לכן, כדי למזער את ההטיה סובייקטיבית, קביעת ערכי סף הייתה תלויה השוואה לבקרה (בקרה שלילית להדמית הקרינה בוצעו במקביל בכל העיבוד על ידי ההשמטה של ​​הנוגדנים הראשוניים או משניים). מגבלה נוספת הייתה נתקלה במהלך הניתוח של נדידת תאים באמצעות הדמיה דיגיטלית לשגות-זמן. בחלק מהמקרים, תוכנת ההדמיה לא הייתה מסוגלת להבדיל בין התנועה בראונית האקראית של תא מול תא למעשה הנודד רק במרחק קצר מאוד. מגבלות נוספות ניכרו במצבים שבם תוכנת הניתוח לא הייתה מסוגלת להבחין בנוכחות של multipתאי le הסמוך מאוד לאחד אחר. כדי להתגבר על בחירת תא מדריך להגבלה נדרשה זה במהלך הניתוח ולא ניתוח אוטומטי לחלוטין. צפיפות ציפוי תא יכולה גם לגרום לעיקום נתוני נדידת תאים בין האוכלוסיות של תאים המציגים העדפה גדולה יותר לגדול בגושים לעומת תאים שגדלים בבידוד זה מזה. הבדלים אלו סוגים בחלק סביר השתקפות של תא-מצע לעומת העדפות תאי תאים. שימוש במערכת HCS לרכוש תמונות ולבצע ניתוח נתונים מספקת אמצעי יעיל ומהיר על מנת להעריך פרמטרים תאים מרובים. בנוסף, קטעי וידאו דיגיטליים הזמן לשגות במשך 30 תנאים שונים (6 מצעים ו 5 תת MSC שונה) נרכשו באופן שיגרתי לתקופות הנעות בין שעות עד ימים (48 שעות) בעת השימוש בתא הסביבתי. נתונים אלה היו לאחר מכן שימשו לחישוב ולקבוע הבדלים בשיעורי נדידת תאים על פני שורות תאים שונות בECM שונהמולקולות. בדוח זה אנו מדגישים את היישום של פלטפורמת הקרנת תוכן גבוהה כדי להעריך את בריאות תא ותפקודו. סוג זה של ניתוח הוא שימושי לפיתוח אסטרטגיות הגיוניות לעיצוב תא-סוגים, כמו גם מצעי פולימר כדי להקל על צמיחת תאים ביימה והתחדשות עצבית. זהו צעד חיוני לקראת יישום של משלוח מבוסס תאי גזע של גורמים טיפוליים לפני נרחב במחקרים פרה-קליניים vivo באמצעות אסטרטגיות השתלת תאים.

נושא מרכזי ביישום טיפולים יעילים לטיפול בהפרעות במערכת עצבים הוא בפיתוח שיטות יעילות המונעות ניוון נוסף וגם להקל על התאוששות של תפקוד. אסטרטגיה חדשנית היא גנטי בתאי גזע מהנדס לשעבר vivo, לייצור של גורמי הגנה עצביים, לפני ההשתלה שלהם. זה שילוב של טיפול מבוסס תאים, בשילוב עם סוג של ריפוי גנטי, מספק שיטה רבת עוצמה לטיפול במחלה או מוות עצבי הנגרם על-פגיעה במערכת העצבים. גורמי neurotrophic חיוניים לצמיחה והישרדות של תאי עצב בפיתוח, כמו גם תחזוקה ופלסטיות של נוירונים בוגרים. מספר המחקרים הראו תפקידים משמעותיים של גורמי neurotrophic בקידום צמיחה והתמיינות ראשוניות של תאי עצב במערכת העצבים המרכזית והיקפית (CNS וPNS) והם יכולים גם לעורר התחדשות במבחנה ובמודלים nimal של פגיעה עצבית 1. גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF) בא לידי ביטוי ביותר במערכת העצבים המרכזית והיא ממלאת תפקידים חשובים בויסות התפתחות עצבית, פלסטיות הסינפטית ותיקון 2. תא גלייה גורם neurotrophic (GDNF) המופק מקו מקדם הישרדות של סוגים רבים של תאי עצב הכוללים דופאמין וmotorneurons 3. לפיכך, אסטרטגיה חשובה לתיקון עצבי היא לספק מקורות אקסוגניים של גורמי neurotrophic לאזורים הפגועים או חולים של מערכת העצבים. תאי עצם multipotent-נגזר מח גזע mesenchymal (MSCs) מחזיקים פוטנציאל גדול עבור משלוח של חלבונים תרופתיים לטיפול במערכת העצבים הפגועה או חולה. השתלה של תאי גזע משכה תשומת לב רבה במאמצים לפתח טיפולים מבוססי תאים תואמים מטופל כן יש להם מספר היתרונות כוללים, 1) קלות היחסית של בידוד ותחזוקה, 2) קיבולת multipotential, 3) חששות אתיים קטנים, 4) יכולת לשרוד ולהעביר לאחר השתלה ו -5) פוטנציאל להשתלה עצמית 4,5. תוצאות מבטיחות כבר דיווחו עם שימוש בתאי גזע נאיבי ומהונדסים גנטי במודלים של בעלי חיים למספר תנאים ניווניות שונים, כוללים פגיעה בחוט השדרה 6,7, שבץ 8,9, המיאלין חסר 10, וניוון רשתית 11-13. צימוד השתלת תאים עם משלוח של גורמי neurotrophic מתאי גזע מהונדסים גנטי הוא רומן ואסטרטגיה תיקון עצבי חשובה. צעד חיוני בפיתוח מערכות אספקת גורם טיפולי המבוסס על תאים הוא לקבוע את הבריאות הנורמלית של התאים המהונדסים. ככזה, המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה להעריך פרמטרים צמיחה כלליים של תאי גזע בוגרים מהונדסים גנטי. גישה חשובה להעריך במהירות פרמטרים תאים מרובים היא להעסיק screenin גבוה דרך תמונה מבוססת סלולאריg (HTS), המכונה לעתים קרובות הקרנת תוכן גבוהה כמו נהלים (HCS) 14. טכנולוגיה זו מאפשרת רכישת תמונה אוטומטית וניתוח וגישה זו היא גם מתאימה במיוחד ליישומי מחקר בתאי גזע. בפרויקט זה פיתחנו פלטפורמה ליצירת פרופילים המאפשרת אפיון המהיר ואופטימיזציה של העדפות מצע תא ותפקודים תאיים בתאי גזע בוגרים מהונדסים גנטי המעסיקים מערכת HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>96 well plates selected for use in ImageXpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam (Cambridge, MA)</td>
			<td>Ab16667</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>C7661</td>
			<td>Collagen from rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL(Entactin-Collagen-Laminin)</td>
			<td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td>
			<td>08-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chemistry Store (Ames, IA)</td>
			<td>12003510</td>
			<td>100%, 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P285</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P288</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine (mouse)</td>
			<td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice</td>
			<td>Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)</td>
			<td></td>
			<td>Isolated from bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td>
			<td>These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>O4042</td>
			<td>4% PFA in 0.1M PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (EDTA 1X)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>12440&#8211;046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma-qualified FBS</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>ImageXpress micro</td>
			<td>High content screening system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

פרמטרים צמיחת MSC נבדקו על ידי culturing האוכלוסיות השונות של תאי גזע על מצעים שונים. חמש האוכלוסיות שונות של תת MSC (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs, וBDNF / GDNF-GFP-MSCs) היו מצופות לתוך צלחות 96-היטב בתרבית רקמה טרום מצופה עם שונה מצעים כפי שמודגמים באיור 1. לאחר ארבעה ימים של culturing, הצלחות קבועות וimmunolabeled ו / או מוכתמים בחומרים הכימיים המתאימים ולאחר מכן נבחנו באמצעות מערכת HCS וניתוחים שנערכו עם רכישת התמונה ותוכנת ניתוח תכנית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> איור 1:. תבנית 96, גם צלחת לעיצוב ניסיוני 96-גם צלחות היו מצופים עם מצעים ובארות שונים היו זרע עם תאי גזע מהונדסים כפי שמוצגת בתבנית. כדוגמא, רק wells בBF שורות שימש בניסוי זה. שורות, G ו- H נותרו ריקים. קיצורים - MSCs: תאי גזע mesenchymal; GFP-MSCs: MSCs להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק; BDNF-GFP-MSCs: המוח נגזר MSCs גורם-להביע GFP neurotrophic; GDNF-GFP-MSCs; גליה תא הנגזר MSCs גורם-להביע GFP neurotrophic; BDNF / GDNF-GFP-MSCs; MSCs להביע GFP BDNF וGDNF-; ECL: Entactin-קולגן IV-Laminin). immunolabeling אנטי-Ki67, ואחריו counterstaining DAPI, שימש כדי להעריך אם מצעים השונים השפיעו על התפשטות של האוכלוסיות השונות של תאי גזע מהונדסים (איור 2 א). ביטוי של אנטיגן Ki67 מתרחש באופן מועדף בשלבים מאוחר 1 G, S, G 2 וM של מחזור התא, ולא זוהה בתאים בשלב המנוחה (G 0), ולכן הוא שימושי כסמן סלולארי להתפשטות 15 . 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) הוא נו נפוץcounterstain ברור וכרומוזום שפולט הקרינה כחולה על מחייב לAT אזורים של DNA 16. המספר הכולל של תאים בתחום יכול להיקבע על ידי ספירת מספר גרעיני DAPI מוכתם. כפי שמודגם באיור 2, אם כי לא היה שינוי באחוזים של MSCs מתרבים, כל מצעים בכל זאת נתמך התפשטות תאים רבה לכל אחד מתת MSC. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> איור 2: assay התפשטות תאי Ki67. () מוזגו, תמונה כפולה ניאון של immunolabeling Ki67 (אדום) וDAPI מכתים גרעיני (כחול). רבים מMSCs היו immunolabeled עם נוגדן Ki67 (אדום). בר סולם = 50 מיקרומטר. (ב) גרף בר הממחיש את אחוזי Ki67 immunolabeled תת MSC גדל על פוליסטירן (PS), poly-L- ליזין (PLL), פיברונקטין, קולגןהקלד אני, laminin, או IV-laminin entactin-קולגן מצעים (ECL) במשך 5 ימים במבחנה (DIV). N = ניסוי אחד. כל עמודה מייצגת ממוצעת של נתונים שנאספו מאתרים 8 צילמו מ2 בארות עבור כל תנאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יודיד צביעת Propidium (PI) שימשה כדי להעריך אם מצעים שונים השפיעו על הישרדות תא (איור 3). יודיד Propidium הוא counterstain גרעיני וכרומוזום אדום-ניאון נפוץ. יודיד Propidium הוא impermeant קרום ובדרך כלל מתאי קיימא, ובכך הוא שימושי כדי לזהות תאים מתים באוכלוסייה. חלקם של תאים מתים בתוך מצב נתון ניתן לקבוע בשילוב עם תווית גרעינית כללית כגון DAPI לזהות את כל התאים בתוך שדה. אחוז תאי PI-החיובי היה נמוך בכל מצעים שנבדקו (איור 3). כביקורת חיובית למגיב PI, כמה בארות המכילות MSCs הודגרו באתנול 70%, מצב המכונה להרוג רוב התאים, וכתוצאה מכך אחוז גבוה של תאים שכותרתו PI כפי שמודגם באיור 3 ו3C (אתנול טופל חיובי שליטה). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> איור 3: assay המוות של תאי יודיד Propidium. () מוזגו, תמונת ניאון כפולה ליודיד propidium (אדום) וDAPI צביעה (כחולה). למרות שהגרעינים של כל תאי קיימא הוכתמו DAPI (כחול), לא מכתים יודיד propidium התגלה בMSCs. (B) כמעט כל MSCs היו מוכתמים ביודיד propidium בעקבות חשיפה לאתנול 70%. ברים בקנה מידה A ו- B = 100 מיקרומטר. תת סוג MSC (C) גרף בר הממחיש את האחוזים של יודיד propidium (PI) מוכתםs גדל על פוליסטירן (PS), poly-L- ליזין (PLL), פיברונקטין, אני, laminin, או IV-laminin entactin-קולגן מצעי סוג קולגן (ECL) במשך 5 ימים במבחנה (DIV). אתנול בקרה: מצב זה שימש כביקורת חיובית עבור מגיב מכתים לצרכן. רוב התאים נתון לטיפול באתנול כתם PI הבא מתים ובכך מוכתם באופן חיובי למגיב לצרכן. N = ניסוי אחד. כל עמודה מייצגת ממוצעת של נתונים שנאספו מאתרים 8 צילמו מ2 בארות עבור כל תנאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כדי לחקור את ההשפעה האפשרית של מצעים שונים על התנהגותם של תאי גזע מהונדסים, נדידת תאים נותחה באמצעות מערכת מועברת האור / הסביבתית הקאמרית במערכת HCS מיקרוסקופיה ודיגיטלית זמן לשגות (ראה וידאו נוסף 1). מספר אתרים / גם הם צילמו זמן לשגותומשמש לחישוב שיעורי נדידת תאים לאוכלוסיות השונות של תאי גזע גדלו על מצעים השונים באמצעות רכישת תמונה וניתוח התוכנה. באופן כללי, כפי שמוצג באיור 4C, כל תת-הסוגים של תאי הגזע הראו שיעור ההגירה המהיר ביותר על פני השטח תאיים מצופה מטריצה ​​(פיברונקטין, קולגן, Laminin וECL) והאיטיים ביותר על משטחי קלקר מצופים שאינם. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> איור 4:. מעקב סלולארי וההגירה MSCs מעקב עם רכישת תמונה ותוכנת ניתוח. תמונות overlayed של משודרות תמונות אור וקרינה מ() תחילת הזמן לשגות הדמיה ו- (ב) בשעה 29 שעות מאוחר יותר בסוף פגישת ההדמיה הזמן לשגות (ראו וידאו נוסף 1). מסלולי נדידת תאים מסומנים על ידי li בצבע<html> נס. בר סולם:. 50 גרף מיקרומטר בר (C) הממחיש את שיעורי הגירה הממוצע (המבוטא מיקרומטר / hr) לתת MSC גדל על פוליסטירן (PS), poly-L- ליזין (PLL), פיברונקטין, קולגן סוג אני, laminin, מצעים או IV-laminin entactin-קולגן (ECL) עבור 2 ימים במבחנה (DIV). N = ניסוי אחד. כל עמודה מייצגת הממוצעת של לפחות 10 תאים צילמו מ2 בארות עבור כל תנאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יחדיו, תוצאות אלה מספקות ראיות ראשוניות לכך שאוכלוסיות של תאי גזע מהונדסים גנטי אלה להציג מאפייני צמיחה דומים. תוצאות אלה מספקות ראיות משכנעות לכך lentiviral בתיווך שינויים גנטיים של תאי הגזע אלה מושרה אין השפעות מזיקות לגילוי דרמטיות על הפרמטרים הצמיחה נחקרו תוך שימוש בפלטפורמת הקרנה זו. = &quot;Jove_content&quot;&gt; וידאו נוסף וידאו 1. זמן לשגות דיגיטלי של מעקב MSC באמצעות רכישת תמונה וניתוח התוכנה. נתיב הנדידה של לשני MSCs [מצויינים כמו 1 (קו ירוק מעקב) ו- 2 (קו הכחול מעקב)] מומחשים. וידאו שנתפס במשך תקופת 29 שעות. תמונות שנתפסו כל 5 דקות. תמונות הקרינה של MSCs להביע GFP שימשו לזמן לשגות הדמיה בהכנת הווידאו. בר כיול = 50 מיקרומטר. סוג זה של ניתוח הוא שימושי חוקר התנהגויות תא, כולל נדידת תאים וחלוקת תא.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies at JoVE.com

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

high-throughput-characterization-adult-stem-cells-engineered-for

Research

JoVE Journal

Medicine

10.7K Views.  Iowa State University. This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Video: High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

גזע להשתלות אסטרטגיות Cell לשיקום של ליקוי קוגניטיבי נגרמת על ידי הקרנות גולגולתי

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve diagnostic and prognostic testing in a clinical setting and may help guide therapeutic interventions. When large numbers of candidate proteins are identified, it may be difficult to validate candidate biomarkers in a timely and efficient fashion from patient plasma samples that are event-driven, of finite volume and irreplaceable, such as at the onset of acute graft-versus-host disease (GVHD), a potentially life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Here we describe the process of performing commercially available ELISAs for six validated GVHD proteins: IL-2R&alpha;5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2, and REG3&alpha;3 (also known as PAP1) in a sequential fashion to minimize freeze-thaw cycles, thawed plasma time and plasma usage. For this procedure we perform the ELISAs in sequential order as determined by sample dilution factor as established in our laboratory using manufacturer ELISA kits and protocols with minor adjustments to facilitate optimal sequential ELISA performance. The resulting plasma biomarker concentrations can then be compiled and analyzed for significant findings within a patient cohort. While these biomarkers are currently for research purposes only, their incorporation into clinical care is currently being investigated in clinical trials.
This technique can be applied to perform ELISAs for multiple proteins/cytokines of interest on the same sample(s) provided the samples do not need to be mixed with other reagents. If ELISA kits do not come with pre-coated plates, 96-well half-well plates or 384-well plates can be used to further minimize use of samples/reagents.

High throughput validation of multiple candidate biomarkers can be performed by sequential ELISA in order to minimize freeze/thaw cycles and use of precious plasma samples. Here, we demonstrate how to sequentially perform ELISAs for six different validated plasma biomarkers1-3 of graft-versus-host disease (GVHD)4 on the same plasma sample.

תפוקה גבוהה ELISA סדרתית עבור אימות של סמנים ביולוגיים של מחלות אקוטיות שתל נגד מארח

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

אספקה ​​אינטראנסלית של תאים בתאי גזע כדי גליובלסטומה במודל עכבר

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...