Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

<ol>
	<li>Thoenen, H., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins:+from+enthusiastic+expectations+through+sobering+experiences+to+rational+therapeutic+approaches.">Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches.</a> Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).</li><li>Park, H., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+regulation+of+neural+circuit+development+and+function.">Neurotrophin regulation of neural circuit development and function.</a> Nature reviews. 14, 7-23 (2013).</li><li>Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+for+midbrain+dopaminergic+neurons.">GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.</a> Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).</li><li>Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+and+migration+of+human+bone+marrow+stromal+cells+implanted+in+the+brains+of+albino+rats--similarities+to+astrocyte+grafts.">Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).</li><li>Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+strategy+for+cell+and+gene+therapy:+harnessing+the+power+of+adult+stem+cells+to+repair+tissues.">One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).</li><li>Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+of+the+spinal+cord+following+intravenous+delivery+of+bone+marrow+cells.">Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells.</a> Glia. 39, 229-236 (2002).</li><li>Hofstetter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+stromal+cells+form+guiding+strands+in+the+injured+spinal+cord+and+promote+recovery.">Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).</li><li>Chopp, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+neural+injury+with+marrow+stromal+cells.">Treatment of neural injury with marrow stromal cells.</a> Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+marrow+stromal+cells+restores+cerebral+blood+flow+and+reduces+cerebral+atrophy+in+rats+with+traumatic+brain+injury:+in+vivo+MRI+study.">Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study.</a> Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).</li><li>Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+into+acid+sphingomyelinase-deficient+mice+delays+the+onset+of+neurological+abnormalities+and+extends+their+life+span.">Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).</li><li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+BDNF-secreting+mesenchymal+stem+cells+provides+neuroprotection+in+chronically+hypertensive+rat+eyes.">Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52, 4506-4515 (2011).</li><li>Arnhold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirally+transduced+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+pigment+epithelial+cells+and+induce+rescue+effects+in+RCS+rats.">Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 47, 4121-4129 (2006).</li><li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+transplantation+of+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+delays+retinal+degeneration+in+the+RCS+rat+model+of+retinal+degeneration.">Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration.</a> Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).</li><li>Xia, X., Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+a+high-content+screening+approach+to+stem+cell+research+and+drug+discovery.">Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+a+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow.">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418, 41-49 (2002).</li><li>Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+and+human+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+neurons.">Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).</li><li>Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+as+therapeutic+agents+and+potential+targeted+gene+delivery+vehicle+for+brain+diseases.">Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).</li><li>Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+features+of+mesenchymal+stem+cells.">Neuroprotective features of mesenchymal stem cells.</a> Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).</li><li>Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells+in+spinal+cord+injury,+regenerative+medicine+and+possible+clinical+applications.">The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications.</a> Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+lentivirus-mediated+TH+and+GDNF+genetic+engineering+mesenchymal+stem+cells+on+Parkinson's+disease+rat+model.">The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model.</a> Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).</li><li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+released+from+engineered+mesenchymal+stem+cells+attenuates+glutamate-+and+hydrogen+peroxide-mediated+death+of+staurosporine-differentiated+RGC-5+cells.">Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells.</a> Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).</li><li>Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+human+embryonic+stem+cell-derived+hN2+cells+using+automated+high-content+image+analysis.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis.</a> Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).</li></ol>

وتم دعم رسوم النشر لهذه المقالة الفيديو عن طريق الأجهزة الجزيئية، LLC.

الخلايا الجذعية الوسيطة الكبار (اللجان الدائمة) هي نوع من الخلايا جذابة لوضع استراتيجية تجريبية الجمع بين تسليم العلاج الخلوي والجيني مقرها. اللجان الدائمة هي متعدد القدرات، قادرة على التفريق الى خلايا من سلالته أرومية متوسطة، وعرض ليونة كبيرة، التفريق / transdifferentiating في الأنساب العصبية والدبقية مع الحث المناسب النماذج 17،18. وعلاوة على ذلك، تم زرع اللجان الدائمة وأثبتت فعاليتها في الدراسات قبل السريرية لعدد من الاضطرابات، بما في ذلك ظروف الاعصاب 19. الكفاءة العلاجية من اللجان الدائمة هو معروف بسبب مفيد لمكافحة التكاثري، والأنشطة المضادة للالتهابات ومضادة للأفكارك الخاصة 20. ومن المعروف أيضا اللجان الدائمة لإنتاج وإفراز العديد من عوامل عصبية والنمو، الأمر الذي يسهم المرجح أن الصفات اعصاب المرتبطة اللجان الدائمة ساذجة بعد زرع في مواقع الإصابة أو المرض 21. IMPOrtantly، اللجان الدائمة يمكن تعديلها وراثيا لتسليم المستمر للعوامل عصبية عن الجمع بين التطبيقات المستندة إلى العلاج الجيني الخلوية و، واستخدمت في عدد من النماذج الحيوانية من الإصابة أو المرض إلى الجهاز العصبي المركزي 11،19،22. في تطوير إستراتيجية تعتمد العلاج الخلوي والجينات مجتمعة، من المهم أن صحة الخلايا وتقييمها بعناية قبل استخدامها المكثف للفي المختبر، وخاصة في التطبيقات الجسم الحي. كدليل على المفهوم، ونحن التحقيق السكان متعددة من الخطوط الهندسية والتحكم MSC من أجل دراسة النتائج المترتبة على التعديلات الوراثية على صحة الخلايا واللياقة البدنية باستخدام نهج عالية فحص المحتوى (HCS). بشكل عام، HCS يشير إلى الخلوي الصورة القائمة على إنتاجية عالية فحص 14. هذا النهج يسمح فحص والتقييم الكمي من الظواهر الخلوية في مستويات متعددة من المكانية (الخلية إلى التحت خلوية) والزمنية (ميلي ثانية إلى أيام) الدقةolution عبر ظروف تجريبية مختلفة. باستخدام هذا النهج الذي الوصول الخلافات المحتملة في تفضيل الركيزة على المعايير التالية: تكاثر الخلايا والتعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP)، موت الخلية، والحركة خلية / الهجرة. تم تصميم التجارب في 96-جيدا شكل لوحة ثقافة الخلية. ضمن لوحة واحدة ونحن التحقيق بشكل روتيني الخلافات المتعلقة الركيزة الممكنة فيما يتعلق بكل المعلمة للسكان MSC مختلفة من الخلايا transduced lentiviral ومقارنة اللجان الدائمة هندسيا مع الأصل، اللجان الدائمة غير transduced. تقدم هذه وسيلة لمقارنة نتائج مباشرة لأنواع فرعية مختلفة MSC مع بطارية لفحوصات في المختبر مثل تكاثر الخلايا باستخدام Ki67 immunolabeling، ويعيش / ميت بقاء الخلية الفحص باستخدام يوديد propidium تلطيخ، وسلوك الخلية عن طريق أداء الوقت الفاصل بين التصوير الرقمي . وامتدادا لهذا HCS واحد يمكن ان تؤدى ELISAs على عينات سائل الإعلام مكيفة التي تم جمعها من فرد ثells لتحديد الكمية إفراز عوامل عصبية. وسائل الإعلام مكيفة من أنواع فرعية مختلفة MSC يمكن أن تستخدم أيضا في اختبارات بيولوجية في المختبر لتحديد النشاط البيولوجي من العوامل يفرز 11،23. هذا النوع من منصة HCS ويمكن أيضا أن تستخدم لفي المختبر قياسات ثمرة neurite من الثقافات العصبية الأولية والعصبية خطوط الخلايا الجذعية 24. وعموما، أظهرت نتائجنا أن مجموعات سكانية فرعية من اللجان الدائمة المعدلة وراثيا المعروضة سلوكيات مماثلة في المقارنة إلى اللجان الدائمة غير المعدلة. وكان تأثير ركائز ثقافة متنوعة على نمو الخلايا والهجرة الخلية لا يختلف بشكل كبير بين أنواع فرعية MSC، فضلا عن ركائز الثقافة. على هذا النحو، فإن ركائز المصفوفة خارج الخلية اختبار لا يبدو أن تلعب دورا حاسما في تعديل هذه الجوانب من سلوك الخلية لهذه اللجان الدائمة مهندسة مختلفة. وتوضح هذه الدراسة استخدام نظام HCS لتحليل مختلفار جوانب السلوك الخلية. ومع ذلك، فإنه ليس من غير المألوف لمواجهة القيود المرتبطة تحليل الصور. في بعض الأحيان، في حين أن تحليل الصور مضان، كان من الصعب بعض الشيء لتحديد قيمة العتبة الصحيحة أعلاه والتي immunolabeled أو أن تحسب الخلايا الملون وصفت بأنها إيجابا / الملون. وهكذا، للحد من التحيز الذاتي، كان تحديد القيم عتبة يعتمد على مقارنة مع الضوابط (تم تنفيذ ضوابط السلبية للتصوير مضان بالتوازي خلال تجهيز جميع من هذا الإغفال من الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية). تمت مصادفة الحد آخر خلال تحليل للهجرة الخلية باستخدام الفاصل الزمني التصوير الرقمي. في بعض الحالات، كان البرنامج التصوير غير قادرين على التفريق بين الحركة البراونية عشوائية من خلية مقابل خلية المهاجرة الواقع على بعد مسافة قصيرة جدا. كانت قيود إضافية واضحة في الحالات التي يكون فيها البرنامج تحليل غير قادرين على التمييز بين وجود multipخلايا جنيه على مقربة جدا إلى واحد آخر. للتغلب على هذا القيد المطلوبة تحديد الخلية اليدوية أثناء التحليل بدلا من تحليل مؤتمتة بالكامل. كثافة الطلاء خلية يمكن أن يؤدي أيضا إلى انحراف بيانات الهجرة الخلية بين السكان من الخلايا التي تبدي قدرا أكبر من الأفضلية لتنمو في كتل مقابل الخلايا التي تنمو بمعزل عن بعضها البعض. هذه الأنواع من الاختلافات في جزء من المحتمل انعكاس لخلية الركيزة مقابل تفضيلات خلية خلية. باستخدام نظام HCS للحصول على الصور وإجراء تحليل البيانات يوفر وسيلة فعالة وسريعة لتقييم المعلمات خلية متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، تم أشرطة الفيديو الرقمية الوقت الفاصل لمدة 30 ظروف مختلفة (6 ركائز و 5 أنواع فرعية مختلفة MSC) اكتسبت بشكل روتيني لفترات تتراوح بين ساعات إلى أيام (48 ساعة) أثناء استخدام الغرفة البيئية. تم استخدام هذه البيانات في وقت لاحق لحساب وتحديد الفروق في معدلات الهجرة الخلية عبر خطوط الخلايا المختلفة على ECM مختلفةالجزيئات. في هذا التقرير قمنا سلط الضوء على تنفيذ منصة عالية فحص المحتوى لتقييم صحة الخلية وظيفة. هذا النوع من التحليل هو مفيد لوضع استراتيجيات عقلانية لتصميم خلية أنواع، وكذلك ركائز البوليمر لتسهيل نمو الخلايا الموجهة وتجديد العصبي. وهذه خطوة أساسية نحو تطبيق الجذعية تسليم خلية القاعدة من العوامل العلاجية قبل واسعة النطاق في الدراسات قبل السريرية المجراة باستخدام استراتيجيات زرع الخلايا.

ثمة مسألة رئيسية مع تنفيذ العلاجات المفيدة لعلاج اضطرابات الجهاز العصبي هي في تطوير طرق فعالة منع المزيد من تدهور وتسهيل استعادة وظيفة أيضا. استراتيجية مبتكرة هي وراثيا الخلايا الجذعية مهندس خارج الحي، لإنتاج عوامل اعصاب، قبل الزرع الخاصة بهم. هذا المزيج من العلاج القائم على الخلايا، إلى جانب وجود نوع من العلاج الجيني، ويوفر وسيلة قوية لعلاج المرض أو الإصابة الناجمة عن وفاة الخلايا العصبية في الجهاز العصبي. عوامل عصبية ضرورية للنمو وبقاء الخلايا العصبية النامية وكذلك صيانة واللدونة من الخلايا العصبية الناضجة. وقد أظهر عدد من الدراسات الأدوار الهامة من عوامل عصبية في تعزيز النمو الأولي والتفريق بين الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي (CNS والجهاز العصبي المحيطي)، وأنها يمكن أيضا أن يحفز تجديد في المختبر وفينماذج نيمال الإصابة العصبية 1. وأعربت المستمدة من الدماغ عامل التغذية العصبية (BDNF) غاية في الجهاز العصبي المركزي وتلعب أدوارا هامة في تنظيم التطور العصبي، اللدونة متشابك وإصلاح 2. خط المشتقة من الخلايا الدبقية عامل التغذية العصبية (GDNF) يعزز بقاء العديد من أنواع الخلايا العصبية بما في ذلك الدوبامين وmotorneurons 3. وهكذا، استراتيجية هامة لإصلاح العصبي هو توفير مصادر خارجية من عوامل عصبية إلى المناطق المصابة أو المريضة من الجهاز العصبي. الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام متعددة القدرات (اللجان الدائمة) عقد إمكانات كبيرة للتسليم من البروتينات العلاجية لعلاج الجهاز العصبي التالفة أو المريضة. وقد اجتذب زرع اللجان الدائمة اهتماما كبيرا في الجهود الرامية إلى تطوير علاجات خلية القاعدة متوافقة المرضى منذ لديهم عدد من المزايا بما في ذلك، 1) السهولة النسبية من العزلة وصيانة، 2) قدرة multipotential، 3) المخاوف الأخلاقية قليلا، 4) القدرة على البقاء والهجرة بعد زرع و5) إمكانية زرع ذاتي 4،5. وقد تم الإبلاغ عن نتائج واعدة مع استخدام اللجان الدائمة ساذجة وهندستها وراثيا في النماذج الحيوانية لعدد من الظروف العصبية المختلفة، بما في ذلك إصابة في العمود الفقري الحبل 6،7، 8،9 السكتة الدماغية، المايلين نقص 10، وتنكس الشبكية 11-13. اقتران زرع الخلايا مع تسليم عوامل عصبية من الخلايا الجذعية المعدلة وراثيا هي رواية واستراتيجية مهمة إصلاح العصبية. خطوة أساسية في تطوير النظم العلاجية تسليم العامل القائم على الخلية لتحديد صحة طبيعية من الخلايا المهندسة. على هذا النحو، وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة لتقييم المعلمات نمو العامة للخلايا الجذعية البالغة وراثيا. مدخلا مهما لتقييم بسرعة المعلمات خلايا متعددة هو لتوظيف الخلوية القائم على صورة عالية من خلال screeninز (HTS)، غالبا ما يشار إلى ارتفاع باسم الفحص المحتوى (HCS) إجراءات 14. تسمح هذه التقنية الحصول على الصور الآلي والتحليل وهذا النهج هو بشكل خاص مناسبة تماما لتطبيقات أبحاث الخلايا الجذعية. في هذا المشروع قمنا بتطوير منصة التنميط الذي يسمح لتوصيف السريع والأمثل للتفضيلات الركيزة الخلايا والوظائف الخلوية مع الخلايا الجذعية البالغة وراثيا التي تستخدم نظام HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>96 well plates selected for use in ImageXpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam (Cambridge, MA)</td>
			<td>Ab16667</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>C7661</td>
			<td>Collagen from rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL(Entactin-Collagen-Laminin)</td>
			<td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td>
			<td>08-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chemistry Store (Ames, IA)</td>
			<td>12003510</td>
			<td>100%, 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P285</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P288</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine (mouse)</td>
			<td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice</td>
			<td>Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)</td>
			<td></td>
			<td>Isolated from bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td>
			<td>These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>O4042</td>
			<td>4% PFA in 0.1M PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (EDTA 1X)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>12440&#8211;046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma-qualified FBS</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>ImageXpress micro</td>
			<td>High content screening system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

تم فحص المعلمات النمو MSC بواسطة زراعة في مجموعات مختلفة من اللجان الدائمة على ركائز مختلفة. تم مطلي الخمس مجموعات مختلفة من الأنواع الفرعية MSC (اللجان الدائمة، GFP-اللجان الدائمة، عامل التغذية العصبية-GFP-اللجان الدائمة، GDNF-GFP-اللجان الدائمة، وعامل التغذية العصبية / GDNF-GFP-اللجان الدائمة) في لوحات 96-جيدا زراعة الأنسجة المغلفة مسبقا مع مختلف ركائز كما هو موضح في الشكل (1). وبعد أربعة أيام من زراعة، وثبتت لوحات وimmunolabeled و / أو ملطخة مع الكواشف المناسبة ثم درست باستخدام نظام HCS والتحليلات التي أجريت مع الحصول على الصور وبرنامج برامج التحليل. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> تم المصنف قالب لوحة 96-جيدا لتصميم تجريبي تم المغلفة لوحات 96-جيدا مع مختلف ركائز والآبار مع الخلايا الجذعية المهندسة كما هو مبين في القالب: الشكل 1. وكمثال على ذلك، أهلا وسهلا فقطواستخدمت ليرة سورية في صفوف BF في هذه التجربة. تركت صفوف A، G و H فارغة. الاختصارات - اللجان الدائمة: الخلايا الجذعية الوسيطة. GFP-اللجان الدائمة: اللجان الدائمة، معربا عن بروتين فلوري الخضراء؛ عامل التغذية العصبية-GFP-اللجان الدائمة: الدماغ تستمد اللجان الدائمة التعبير عن عامل GFP-عصبية. GDNF-GFP-اللجان الدائمة. تستمد الخلايا الدبقية اللجان الدائمة التعبير عن عامل GFP-عصبية. عامل التغذية العصبية / GDNF-GFP-اللجان الدائمة. عامل التغذية العصبية وGDNF- اللجان الدائمة، معربا عن GFP. ECL: Entactin الكولاجين IV-Laminin). مكافحة Ki67 immunolabeling، تليها دابي counterstaining، وكان يستخدم لتقييم ما إذا كانت ركائز مختلفة أثرت تكاثر مجموعات مختلفة من اللجان الدائمة هندسيا (الشكل 2A). التعبير عن مستضد Ki67 يحدث تفضيلي خلال المراحل المتأخرة G 1، S، G 2 و M من دورة الخلية، ولم يتم الكشف في الخلايا في مرحلة الراحة (G 0)، وبالتالي هو مفيد كعلامة الخلوية لانتشار 15 . 4 &quot;، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) هو نو يشيع استخدامهامباين واضح وكروموسوم التي تنبعث مضان الأزرق على ملزم لAT مناطق DNA 16. يمكن تحديد العدد الكلي للخلايا في حقل عن طريق حساب عدد من نوى دابي الملون. كما هو موضح في الشكل 2B، وإن كان هناك تفاوت في نسب اللجان الدائمة المتكاثرة، كل ذلك يدعم ركائز تكاثر الخلايا كبيرا لكل من الأنواع الفرعية MSC. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> الشكل 2: Ki67 فحص تكاثر الخلايا. (A) مدموجة، صورة مزدوجة فلوري من Ki67 immunolabeling (أحمر) ودابي (الأزرق) تلطيخ النووي. تم immunolabeled العديد من اللجان الدائمة مع الأجسام المضادة Ki67 (الحمراء). شريط النطاق = 50 ميكرومتر. (B) بار الرسم البياني يوضح النسب المئوية للKi67 immunolabeled فرعية MSC نمت على البوليسترين (PS)، وبولي-L-ليسين (PLL)، فبرونيكتين، والكولاجيناكتب I، laminin، أو entactin الكولاجين IV-laminin (ECL) ركائز لمدة 5 أيام في المختبر (DIV). N = تجربة واحدة. كل شريط يمثل متوسط ​​البيانات المجمعة من 8 مواقع تصويرها من 2 الآبار لكل حالة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> وقد استخدم يوديد propidium (PI) تلطيخ لتقييم ما إذا ركائز مختلفة أثرت بقاء الخلية (الشكل 3). يوديد propidium هو أحمر فلوري النووية وكروموسوم مباين شائعة الاستخدام. يوديد propidium هو impermeant الغشاء ويستثنى عادة من خلايا قابلة للحياة، وبالتالي هو مفيد للكشف عن الخلايا الميتة في عدد السكان. يمكن تحديد نسبة الخلايا الميتة داخل شرط معين عند دمجها مع تسمية النووية عامة مثل دابي لتحديد جميع الخلايا داخل حقل. وكانت النسبة المئوية للخلايا-PI إيجابي منخفضة على كل ركائز فحص (الشكل 3). كما تحكم إيجابية للكاشف PI، وحضنت بضع آبار تحتوي على اللجان الدائمة في الايثانول 70٪، وهي حالة تعرف لقتل معظم الخلايا، مما أدى إلى نسبة عالية من الخلايا المسمى PI كما هو موضح في الشكل 3B و3C (الإيثانول تعامل الإيجابي السيطرة). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> الشكل 3: يوديد Propidium فحص موت الخلايا. (A) المدمجة، مزدوجة صورة الفلورسنت ليوديد propidium (أحمر) ودابي (الأزرق) تلطيخ. على الرغم من أن كانت ملطخة نوى كل من خلايا قابلة للحياة مع دابي (الأزرق)، تم الكشف عن أي تلطيخ يوديد propidium في اللجان الدائمة. (B) تقريبا كانت ملطخة جميع اللجان الدائمة مع يوديد propidium بعد التعرض لالايثانول 70٪. الحانات النطاق في A و B = 100 ميكرون. (C) بار الرسم البياني يوضح النسب المئوية من يوديد propidium (PI) ملطخة MSC النوع الفرعيق نمت على البوليسترين (PS)، وبولي-L-ليسين (PLL)، فبرونيكتين، نوع الكولاجين I، laminin، أو entactin الكولاجين IV-laminin (ECL) ركائز لمدة 5 أيام في المختبر (DIV). تحكم الإيثانول: هذا الشرط بمثابة مراقبة إيجابية للكاشف PI تلطيخ. معظم الخلايا تعرض لPI وصمة عار بعد العلاج الإيثانول قد لقوا حتفهم، وبالتالي الملون بشكل إيجابي لكاشف PI. N = تجربة واحدة. كل شريط يمثل متوسط ​​البيانات المجمعة من 8 مواقع تصويرها من 2 الآبار لكل حالة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> للتحقيق في تأثير ممكن من ركائز مختلفة على سلوك اللجان الدائمة هندسيا، تم تحليل الهجرة الخلية باستخدام الوقت الفاصل بين المجهر الرقمي والضوء / نظام غرفة البيئي تنتقل على النظام HCS (انظر التكميلي فيديو 1). مواقع متعددة / جيد والوقت الفاصل بين تصويروتستخدم لحساب معدلات الهجرة الخلية لمجموعات سكانية فرعية مختلفة من اللجان الدائمة المتزايد على مختلف ركائز باستخدام برنامج حاسوبي الحصول على الصور وتحليلها. بشكل عام، كما هو مبين في الشكل 4C، وأظهرت جميع أنواع فرعية من اللجان الدائمة أسرع معدل الهجرة على أسطح الخلية المغلفة مصفوفة ([فيبرونكتين]، الكولاجين، Laminin وECL) وأبطأ على الأسطح غير المغلفة البوليسترين. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> تتبع تتبع الخلية والهجرة اللجان الدائمة مع الحصول على الصور وبرامج التحليل: الشكل 4. الصور يغطى المنقولة ضوء ومضان الصور من (A) بداية الوقت الفاصل بين التصوير و(B) في 29 ساعة في وقت لاحق في نهاية الدورة الوقت الفاصل بين التصوير (انظر التكميلي فيديو 1). يشار إلى مسارات الهجرة الخلية التي كتبها لى الملونة<html> الأخبار. شريط مقياس: 50 ميكرون (C) بار الرسم البياني يظهر بصورة متوسط ​​معدلات الهجرة (كنسبة ميكرون / ساعة) لأنواع فرعية MSC نمت على البوليسترين (PS)، وبولي-L-ليسين (PLL)، فبرونيكتين، نوع الكولاجين I، laminin، أو entactin الكولاجين IV-laminin (ECL) ركائز لمدة 2 أيام في المختبر (DIV). N = تجربة واحدة. يمثل كل شريط متوسط ​​لا يقل عن 10 خلايا تصويرها من 2 الآبار لكل حالة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> أخذت معا، وهذه النتائج تقدم دليلا أوليا على أن هذه القطعان من اللجان الدائمة وراثيا عرض خصائص نمو مماثلة. وتوفر هذه النتائج أدلة دامغة على أن lentiviral بوساطة التعديلات الجينية لهذه اللجان الدائمة التي يسببها أي آثار ضارة للكشف دراماتيكية على معايير النمو التحقيق باستخدام هذه المنصة الفرز. = &quot;jove_content&quot;&gt; التكميلي الفيديو 1. الوقت الفاصل بين الفيديو الرقمي من تتبع MSC باستخدام برنامج حاسوبي الحصول على الصور وتحليلها. طريق الهجرة لاثنين من اللجان الدائمة [أشار ك 1 (الخط الأخضر تتبع) و 2 (الأزرق خط تتبع)] موضحة. القبض على الفيديو خلال فترة 29 ساعة. تم التقاط الصور في كل 5 دقائق. تم استخدام الصور مضان من اللجان الدائمة، معربا عن GFP للتصوير مرور الزمن في إعداد الفيديو. = شريط المعايرة 50 ميكرون. هذا النوع من التحليل هو مفيد للتحقيق في سلوكيات الخلية، بما في ذلك الهجرة الخلية وانقسام الخلية.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies at JoVE.com

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

عالية الإنتاجية توصيف الخلايا الجذعية البالغة المهندسة لتسليم العوامل العلاجية لاستراتيجيات اعصاب

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

high-throughput-characterization-adult-stem-cells-engineered-for

Research

JoVE Journal

Medicine

10.7K Views.  Iowa State University. This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Video: High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

ومنصة عالية الإنتاجية الآلي للتنمية في خطوط التصنيع لخلية التداوي البروتين

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

زرع الخلايا الجذعية استراتيجيات من أجل استعادة الضعف المعرفي التي تحدثها العلاج الإشعاعي القحف

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

سمل العيون الماوس لPhenotyping عالي الإنتاجية عن بعد

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve diagnostic and prognostic testing in a clinical setting and may help guide therapeutic interventions. When large numbers of candidate proteins are identified, it may be difficult to validate candidate biomarkers in a timely and efficient fashion from patient plasma samples that are event-driven, of finite volume and irreplaceable, such as at the onset of acute graft-versus-host disease (GVHD), a potentially life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Here we describe the process of performing commercially available ELISAs for six validated GVHD proteins: IL-2R&alpha;5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2, and REG3&alpha;3 (also known as PAP1) in a sequential fashion to minimize freeze-thaw cycles, thawed plasma time and plasma usage. For this procedure we perform the ELISAs in sequential order as determined by sample dilution factor as established in our laboratory using manufacturer ELISA kits and protocols with minor adjustments to facilitate optimal sequential ELISA performance. The resulting plasma biomarker concentrations can then be compiled and analyzed for significant findings within a patient cohort. While these biomarkers are currently for research purposes only, their incorporation into clinical care is currently being investigated in clinical trials.
This technique can be applied to perform ELISAs for multiple proteins/cytokines of interest on the same sample(s) provided the samples do not need to be mixed with other reagents. If ELISA kits do not come with pre-coated plates, 96-well half-well plates or 384-well plates can be used to further minimize use of samples/reagents.

High throughput validation of multiple candidate biomarkers can be performed by sequential ELISA in order to minimize freeze/thaw cycles and use of precious plasma samples. Here, we demonstrate how to sequentially perform ELISAs for six different validated plasma biomarkers1-3 of graft-versus-host disease (GVHD)4 on the same plasma sample.

عالية الإنتاجية ELISA متسلسل للتأكد من صحة العلامات الحيوية من الأمراض الطعم ضد المضيف الحاد

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الثديية سابق للورم ظهاري الأولية المستمدة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لسرطان الثدي

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

نظام عضوي إنتاجية عالية لتوصيف الدواء حساسية خلايا المايلوما المتعددة الابتدائية

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; توصيف ممغنط مير تعديل الخلايا البطانية

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

داخل الأنف تسليم الخلايا الجذعية العلاجية إلى الورم الدبقي في نموذج الفأر

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...