Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

1. Untergrundvorbereitung für 96-Well-Platten <ol><li> Erstellen Sie eine Karte von der 96-Lochplatte umreißt die verschiedenen Substrate und Zelltypen zu (Abbildung 1) untersucht werden. </li><li> Besorgen Sie sich die Stammlösungen von unterschiedlichen Substraten [Poly-L-Lysin, Fibronektin, Kollagen Typ I, Laminin und Entactin-Kollagen IV-Laminin (ECL)], ein 96-Loch-Multiwellplatte und erstellt einen Arbeitsplatz in einem sterilen Zellkultur Kapuze. </li><li> Planen einzelner Substrate durch Verdünnen Lager in steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einer Endkonzentration von 5 ug / ml (diese Konzentration wurde zuvor basierend auf einer Substratkonzentration abhängigen Assay für Wachstum und Vermehrung der Zellen bestimmt). Mischen mit einem Vortex vor dem Gießen in einen sterilen Behälter. </li><li> 100 l Substratlösung in jede Vertiefung nach dem 96-Loch-Karte (Abbildung 1) (a 12- oder 8-Kanal Mikropipette ist für Mikropipettieren in eine Platte mit 96 Vertiefungen). Verschließen Sie den Deckel auf die 96-Lochplatte mit einem Streifen Parafilm und über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> 2. Zell Plating und Zeitraffer-Imaging HINWEIS: Maus-MSCs wurden aus dem Knochenmark von Erwachsenen C57BL / 6-Mäusen isoliert und als adhärente Zelllinie beibehalten wird. Und Gliazellen stammenden neurotrophen Faktor (GDNF; menschliche cDNA) unter Verwendung von lentiviralen Vektors kodiert BDNF (LV-BDNF;; MSCs wurden mit lentiviralen Vektoren, sie zu konstruieren, um dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (human cDNA BDNF) sekretieren infiziert CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP) und grün fluoreszierendes Protein (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). HINWEIS: Die Kulturmedien für Maus mesenchymale Stammzellen (MSCs) ist Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium, das 10% Hybridom-qualifizierte fötalem Rinderserum, 10% Pferdeserum, 2 mM L-Glutamin und 10.000 U / ml Penicillin, 10 mg / ml Streptomycin . Die fünf verschiedenen Arten von Maus-MSCs (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs und BDNF / GDNF-GFP-MSCs) wurden bei etwa 30% Konfluenz in T75 Zellkulturflaschen ausplattiert. <ol><li> Zelle Plating <ol><li> Am folgenden Tag, nehmen Sie die Substratlösungen durch Aspiration und spülen Sie jede Vertiefung mit etwa 200 ul sterilem PBS, zweimal. Hinzufügen Zellkulturmedien (200 ul / Vertiefung) in jede Vertiefung nach dem letzten PBS spülen. Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für die Gleichgewichtseinstellung eingestellt. </li><li> (Bezeichnet als konditioniertes Medium), während der 96-Well-Platte wird in den Inkubator Äquilibrieren, Ernte der Zellen durch das Sammeln des Wachstumsmediums (MSCs in T75 Kolben sollten etwa 70% konfluent Zeitpunkt der Ernte / Beschichtung sein kann) von der T75-Kolben und Speichern in einem 15 ml konischen Röhrchen unter sterilen Bedingungen (das konditionierte Medium wird im Schritt 2.1.4) verwendet werden. </li><li> In 8 ml sterilem PBS in den Kolben und schwenken Sie dann pipettieren Sie das PBS und 1 ml 0,05% Trypsin und 0,01%EDTA-Lösung, um die Zellen von der Kulturoberfläche des T75-Kolben zu lösen. Überwachen Zellablösung durch Betrachten der Kolben unter Verwendung eines Umkehrmikroskops mit Phasenkontrastoptik ausgestattet. </li><li> Wenn die Zellen abgenommen, sofort 8 ml der konditionierten Medien (in Schritt 2.1.2 gesammelt) in den Kolben. Sammeln Sie die Zellsuspension und Transfer zu einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 4 Minuten bei 450 · g, um die Zellen zu pelletieren. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 200 &amp; mgr; l frisch und erwärmt (37 ° C) Zellkulturmedien. </li><li> Bestimmen der Anzahl der Zellen in der Zellsuspension durch Ausführen einer Trypanblau Lebendzellzahl unter Verwendung eines Hämocytometers. Platte, die Zellen in einer Dichte von etwa 300 Zellen / Vertiefung in die Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte für jede Population von Zellen. </li></ol></li><li> Zeitraffer-Imaging <ol><li> Sobald alle MSCs wurden vernickelt, OrtDie 96-Well-Platte in einen Inkubator für 2 h, damit sich die MSCs an dem Substrat zu befestigen. </li><li> Starten Sie den HCS-System und warten Sie 2 Stunden für das System ins Gleichgewicht kommen. Setzen Sie den Umgebungsregler auf 37 ° C und eine Verbindung eines Mischgases Zylinder, enthaltend 5% CO 2 in Luft zu dem HCS System Umgebungskammer Zuführen eines konstanten Luftquelle. </li><li> Entfernen Sie den 96-Well-Platte aus dem Inkubator nach 2 h Äquilibrierungsperiode und legen Sie direkt in die Zellwachstumskammer des HCS-System. Lassen Sie 30 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung aus irgendeinem wärmebedingte Ausdehnung der Platte Konto und starten Sie die Bildaufnahme und Analyse-Software, um die Platte zu konfigurieren. </li><li> Wählen Sie das 20X Ziel für die Bildgebung. Wählen Sie zwei Vertiefungen pro Bedingung [dh GFP-MSCs auf Fibronektin usw. (6 Substraten x 5 MSC Subtypen für insgesamt 30 Bedingungen x 2 Wiederholungen = 60 Bohrungen insgesamt)] für den Aufbau Zeitraffer-Bildgebung. Wählen Sie zwei Standorte für die Bildgebung mitin jede Vertiefung. </li><li> Wählen Sie die richtige Lichtwellenlängen für die Bildgebung. HINWEIS: Zwei verschiedene Wellenlängen (Phasenkontrast und GFP-Fluoreszenz) wurden für Zeitraffer-Bildgebung ausgewählt. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf die Well-Boden mit Laserautofokus und nehmen Sie Testbilder für mehrere Standorte und mehrere Brunnen, um eine optimierte Brennebene zu finden. </li><li> Sobald der Fokus festgelegt wurde, beginnt die Aufnahme von Bildern alle 5 min für 48 Stunden für alle 60 Bohrlöcher (120 Websites). </li><li> Feed the Zellen alle 24 Stunden durch das Entfernen der Platte mit 96 Vertiefungen aus dem HCS-System. Entfernen 75 ul Medium aus jeder Vertiefung werden 100 ul frisches Medium zu jeder Vertiefung (äquilibrieren dieses frischem Medium bei 37 ° C und 5% CO 2). </li><li> Am Ende des Zeitraffer-Experiment, entfernen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen aus dem HCS-System. Unter sterilen Bedingungen sammeln die konditionierten Medienproben aus jeder Vertiefung und übertragen diese Proben auf eine andere Platte mit 96 Vertiefungen. HINWEIS: Diese Proben können für die weitere Analytik eingesetzt werdenwird durch Ausführen ELISA für neurotrophe Faktoren. </li><li> Bereiten Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit kultivierten MSCs für weitere Tests, wie Ki67-Zellproliferationstest oder Propidiumiodid Live / Dead Färbeassay (Details siehe unten). </li><li> Führen Sie Zeitraffer-Imaging-Analyse für die Zellmigration / Zellverfolgung wie in Abschnitt 5 beschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Ki67 Zellproliferation und Propidiumiodid Live / Dead-Assay <ol><li> Ki67 Cell Proliferation Assay (Immunzytochemie) <ol><li> Spülen der Zellkulturen mit 0,1 M Phosphat (PO 4) Puffer für eine Minute zweimal. Befestigen Sie die Kultur mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die PFA und spülen Sie die Vertiefungen mit PBS sieben Minuten drei Mal. </li><li> Nach der letzten Spülung 100 l Blocker-Lösung (Phosphatpuffersalzlösung, 5% normalem Eselserum, 0,4% Rinderserumalbumin und 0,2% Triton X-100) in jede Vertiefung einnd Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Vorbereiten des primären Antikörpers, Kaninchen-Anti-Ki67, durch Verdünnen in Blocker-Lösung bei einem Bearbeitungsverhältnis von 1: 200. </li><li> Entfernen den Blocker-Lösung und gelten 100 ul des primären Antikörperlösung in jede Kammer. Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und Inkubieren der Proben bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Am folgenden Tag, nehmen Sie die Antikörperlösung und mit PBS spülen für 7 min, 3-mal. </li><li> Vorbereiten des sekundären Antikörper, Esel Anti-Kaninchen-Cy3 in Blockierungslösung bei einem Arbeitsverhältnis von 1: 500. Hinzufügen DAPI Kernfärbung auf die Sekundärantikörperlösung bei einer Verdünnung von 1: 100. Nach der Entfernung des letzten PBS spülen gelten 100 ul des sekundären Antikörper / DAPI-Lösung zu jedem Well. Inkubieren bei Raumtemperatur im Dunkeln für 90 min. </li><li> Entfernen Sie den sekundären Antikörper / DAPI-Lösung und spülen Sie jede Vertiefung mit PBS für 7 min, 3-mal. Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und bei 4 ° C bis zur Bildgebung. </li></ol></li><li> Propidium Iodid Live / Dead-Assay <ol><li> Messen Zelltod durch Propidiumjodid (PI) Ausschluss-Assay, wie unten beschrieben. </li><li> Bereiten Sie die Propidiumiodid-Färbung Lösung bei einer Konzentration von 1,5 uM in Kulturmedien. </li><li> 100 l 70% Ethanol, um eine Vertiefung der MSCs für 2 Minuten mit der Absicht, diese Zellen zu töten. Dies dient auch als eine positive Kontrolle für die PI-Färbung. Der Großteil der MSCs werden PI-gefärbte Angabe Zelltod sein. Entfernen Sie die Ethanollösung. </li><li> 100 l Propidiumiodid-Färbung Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 20 min bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Spüle die Zellen mit 0,1 M Phosphatpuffer für 1 min, 2 mal. Fixieren die Zellen mit 4% PFA in 0,1 M P0 4 Puffer für 20 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die PFA und mit PBS spülen dreimal für 7 min. </li><li> Inkubieren mit DAPI-Lösung (1:50) in Blocker-Lösung 1 h bei Raumtemperatur verdünnt. Alle Vertiefungen mit SpülenPBS für 7 min, 3-mal. </li><li> Entfernen Sie die DAPI-Lösung und spülen Sie jede Vertiefung mit PBS für 7 min, 3-mal. Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und bei 4 ° C bis zur Bildgebung. </li></ol></li></ol> 4. Automated Imaging und Multiwellenlängen Scoring Analyse <ol><li> Legen Sie eine Platte mit 96 Vertiefungen (zuvor für Ki67 Immunmarkierung oder Propidiumiodid-gefärbten verarbeitet) in die HCS-System und damit die Platte für 20 Minuten ins Gleichgewicht Öffnen Sie die HCS-System-Image-Erfassung und Analyse-Software. </li><li> Wählen Sie die Einstellungen für den Erwerb 10X-Objektiv von der Kamera aus Binning bei 1 und eine Verstärkungseinstellung des 2. Suchen Sie die Z-Ebene, in der sich die Zellen befinden durch die Nutzung der automatischen Belichtungsfunktion und berechnet den Offset für jede Wellenlänge von Interesse. Für diese Analyse wurden die Aufnahmen für DAPI (W1), Cy3 (W2) und FITC (W3). Wählen Sie die maximale Intensität Ebene, auf der die Negativkontrollen zeigen kein Signal für die Bildaufnahme. Bestätigen Sie die Einstellung für die pos geeignet istitive Brunnen. </li><li> Erwerben Platte. Machen Sie Bilder und speichern sie in der Bildaufnahme und Analyse-Software-Datenbank. </li><li> Sobald Bilder erworben wurden, offene Bildaufnahme und Analyse offline Software und Überprüfung Platte Daten aus den obigen Bilder erworben. </li><li> Wählen Sie das Multi-Wellenlängen-Scoring-Analyse. Konfigurieren Sie die minimale und maximale Intensität für jede Wellenlänge. HINWEIS: DAPI Erkennung sollte die Färbung um jeden sichtbaren Kern markieren. Cy3 sollten die positiven Zellen mit Ki67 Immunreaktivität (IR) zu erkennen und sollte IR unter den negativen Kontrollen nicht erkennen. Cy3 Ki67 IR, die ungefähre minimale Breite betrug 7 &amp; mgr; m, ungefähre Maximalbreite betrug 30 &amp; mgr; m, wird die Intensität über dem lokalen Hintergrund betrug 150 Graustufen und die minimale Buntbereich betrug 50 &amp; mgr; m 2. </li><li> Führen Analyse für alle Positionen. Exportieren Sie die Daten in Spreadsheet anzuzeigen. </li></ol> 5. Zelltracking <ol><li> Bild öffnen Acquisition und Analyse-Programm und klicken Sie auf &quot;Bewertung Platte Daten [DB] ...&quot;, die Auswahl der Platte von Interesse. </li><li> Die Daten anzuzeigen, wie &quot;Time vs. Well&quot;. </li><li> Wählen Sie eine der Webseiten, die im Abschnitt &quot;Seiten&quot; auf der linken Maustaste auf die gewünschte Auswahl. Wählen Sie &quot;Übertragene ...&quot; unter den &quot;Wellenlängen:&quot;. Rechtsklick auf das Ziel auch in der 96-Well-Platte-Vorlage und klicken Sie auf &quot;Bilder laden&quot;. </li><li> Verfolgen Sie die Zellen, indem Sie auf den &quot;Apps&quot; und dann &quot;Track-Objekte&quot;. </li><li> Verwenden Sie &quot;Dynamic Data Exchange (DDE)&quot;, um das Format, um die Daten, zum Beispiel Microsoft Excel exportieren. </li><li> Wählen Sie die Tracking-Daten zu exportieren, zum Beispiel, vergangene Zeit, Objektnummer, Entfernung, Zeit-Intervall, Geschwindigkeit, absoluten Winkel, Entfernung zum Ursprung, Delta x und Delta y. </li><li> Tag jede Zelle von Interesse mit &quot;Strg-Taste + linke Maustaste&quot; auf den Zielzellen. </li><li> Track-Zellen. Stoppen Sie gegebenenfalls / ändern unsachgemäße Tracking von Zellen mit der Taste &quot;Esc&quot; und passen Sie die Einstellungen. </li><li> Nach Zellverfolgung abgeschlossen ist, speichern Sie Daten mit &quot;Protokolldaten&quot;. </li></ol>

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Adulte mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind eine attraktive Zelltyp für die Entwicklung einer experimentellen Strategie, die eine zelluläre und Genabgabe basierte Therapie. MSCs sind multipotent, zur Differenzierung zu Zellen mesodermalen Linie und zeigen erhebliche Plastizität, Differenzierungs / Transdifferenzierung zu neuronalen und glialen Linien mit der entsprechenden Induktions Paradigmen 17,18. Weiterhin MSCs transplantiert wurden und wirksam erwiesen in präklinischen Studien für eine Reihe von Erkrankungen, einschließlich neurodegenerativer Bedingungen 19. Die therapeutische Wirksamkeit von MSCs ist gut aufgrund ihrer günstigen anti-proliferative, anti-entzündliche und anti-apoptotischen Aktivitäten 20 bekannt. MSCs sind ebenfalls bekannt, verschiedene neurotrophe und Wachstumsfaktoren, die trägt wahrscheinlich zu den neuroprotektiven Eigenschaften mit naiven MSCs nach der Transplantation an den Stellen der Verletzung oder Erkrankung 21 verbunden zu produzieren und zu sezernieren. Importantly können MSCs genetisch unterstützte Abgabe von neurotrophen Faktoren für kombinierte zellulare und Gentherapie-Anwendungen modifiziert werden, und sind in einer Reihe von Tiermodellen der Verletzung oder Krankheit des ZNS 11,19,22 eingesetzt. In der Entwicklung eines kombinierten Zell- und Gentherapie-basierte Strategie ist es wichtig, dass die Gesundheit der Zellen sorgfältig vor der umfassenden Nutzung für die in vitro und insbesondere in vivo Anwendungen bewertet. Wie Proof of Concept, untersuchten wir mehrere Populationen entwickelt und Steuer MSC Linien, um die Auswirkungen der genetischen Veränderungen auf Zell Gesundheit und Fitness mit einem High Content Screening (HCS) Ansatz zu studieren. In der Regel bezieht sich auf Zell HCS bildbasierten Hochdurchsatzscreening 14. Dieses Screening-Ansatz ermöglicht eine quantitative Beurteilung der zellulären Phänotypen auf mehreren Ebenen von räumlichen (Zelle auf subzellulärer) und zeitliche (Millisekunden bis Tagen) reslösung in verschiedenen experimentellen Bedingungen. Mit diesem Ansatz haben wir mögliche Unterschiede in der Substratpräferenz von folgenden Parametern aufgerufen: Zellproliferation, Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), Zelltod und Zellbeweglichkeit / Migration. Die Experimente wurden in 96-well-Zellkulturplatte Format ausgelegt. Innerhalb einer einzigen Platte wir routinemäßig auf die einzelnen Parameter für die verschiedenen MSC Populationen lentiviralen-transduzierten Zellen untersucht mögliche Substratspezifische Unterschiede in Bezug und verglichen die entwickelt MSCs mit der ursprünglichen, nicht-transduzierten MSCs. Dies ergab ein Mittel, um direkt mit einer Reihe von In-vitro-Assays wie Zellproliferation mit Ki67 Immunmarkierung, Live / Dead-Zelllebensfähigkeitstest mit Propidiumiodid-Färbung, und das Zellverhalten, indem Sie Zeitraffer Digital Imaging vergleichen Sie die Ergebnisse für die verschiedenen Subtypen MSC . Als eine Erweiterung dieser HCS kann man auch durchführen ELISAs auf konditionierten Medienproben aus einzelnen w gesammeltenells quantitativ zu bestimmen Sekretion von neurotrophen Faktoren. Konditionierte Medien aus verschiedenen MSC-Subtypen können auch in in vitro Bioassays zur biologischen Aktivität von sezernierten Faktoren 11,23 bestimmen. Diese Art von HCS-Plattform kann auch für in vitro-Messungen von Neuritenwachstum aus primären neuronalen Kulturen und neuronale Stammzelllinien 24 verwendet werden. Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass die Subpopulationen der genetisch veränderten MSCs ähnelnde Verhalten im Vergleich zu den nicht modifizierten MSCs. Der Einfluss verschiedener Kultursubstrate auf Zellwachstum und Zellmigration war nicht dramatisch verschieden zwischen den MSC-Subtypen sowie Kultursubstraten. Als solche hat die extrazellulären Matrixsubstrate getestet anscheinend nicht eine kritische Rolle bei der Modulation dieser Aspekte des Zellverhaltens für diese unterschiedlichen Engineered MSCs spielen. Diese Studie zeigt die Verwendung eines HCS System zum Analysieren von different Aspekte des Zellverhaltens. Jedoch ist es nicht ungewöhnlich, dass Einschränkungen bei der Bildanalyse zugeordnet stoßen. Gelegentlich, während die Analyse der Fluoreszenzbilder, war es etwas schwierig, den richtigen Schwellenwert, ab dem immun oder gefärbten Zellen würde gezählt als positiv bezeichnet / gefärbt werden zu bestimmen. Somit subjektiven Bias zu minimieren, wird die Bestimmung von Schwellenwerten war abhängig von einem Vergleich mit den Kontrollen (negative Kontrollen für die Fluoreszenz-Bildgebung wurden parallel bei allen Verarbeitung durch das Weglassen der primären oder sekundären Antikörper durchgeführt). Eine weitere Einschränkung wurde bei der Analyse der Zellmigration mit Zeitraffer Digital Imaging gestoßen. In einigen Fällen war die Bildverarbeitungssoftware nicht in der Lage, zwischen zufälligen Brownsche Bewegung einer Zelle gegenüber einer Zelle tatsächlich Migration nur eine sehr kurze Strecke zu unterscheiden. Zusätzliche Beschränkungen waren deutlich in Situationen, in denen die Analysesoftware nicht in der Lage, das Vorhandensein von multip unterscheidenle Zellen in unmittelbarer Nähe zu einem anderen. Um diese Einschränkung zu erforderlichen manuellen Zellenauswahl während der Analyse eher als eine vollautomatische Analyse zu überwinden. Zell Plattierungsdichte kann auch in Schrägzellmigration von Daten zwischen Populationen von Zellen, die größer ist bevorzugt in Klumpen gegen Zellen, die isoliert von einander wachsen wachsen Anzeigen führen. Diese Arten von Unterschiede sind zum Teil eher ein Spiegelbild der Zell-Substrat-gegen Zell-Zell-Vorlieben. Mit einem HCS-System, um Bilder zu erfassen und führen Sie Datenanalysen bietet ein effizientes und schnelles Mittel, um mehrere Zellparameter zu bewerten. Darüber hinaus wurden im Zeitraffer digitale Videos für 30 verschiedene Bedingungen (6 Substraten und 5 verschiedene MSC-Subtypen) routinemäßig für die Zeiträume von Stunden bis Tagen (48 Stunden) während der Verwendung der Klimakammer erworben. Diese Daten wurden anschließend verwendet, zu berechnen und zu bestimmen, Unterschiede in der Zellmigration Raten in verschiedenen Zelllinien auf verschiedenen ECMMolekülen. In diesem Bericht haben wir die Implementierung einer High Content Screening-Plattform, um die Zell Gesundheit und Funktion beurteilen hervorgehoben. Diese Art der Analyse ist für die Entwicklung von Strategien zur rationellen Gestaltung von Zelltypen, wie auch Polymersubstrate gerichtet Zellwachstum und die neuronale Regeneration zu erleichtern. Dies ist ein wesentlicher Schritt in Richtung Anwendung von stammzellbasierten Abgabe therapeutischer Faktoren vor umfangreiche präklinische Studien in vivo mittels Zelltransplantation Strategien.

Eines der Hauptprobleme bei der Durchführung nützliche Therapien zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems ist bei der Entwicklung wirksamer Methoden, die weitere Degeneration verhindern und Wiederherstellung der Funktion zu erleichtern. Eine innovative Strategie Genmanipulation Stammzellen ex vivo, für die Herstellung von neuroprotektiven Faktoren, vor ihrer Transplantation. Diese Kombination von zellbasierte Therapie in Verbindung mit einer Art von Gentherapie, ein leistungsfähiges Verfahren für die Behandlung von Krankheit oder Verletzung induzierten neuronalen Zelltod im Nervensystem. Neurotrophe Faktoren sind entscheidend für Wachstum und Überleben von sich entwickelnden Neuronen sowie Wartung und Plastizität von reifen Nervenzellen. Eine Reihe von Studien haben eine bedeutende Rolle von neurotrophen Faktoren bei der Förderung der anfänglichen Wachstum und die Differenzierung von Neuronen im zentralen und peripheren Nervensystems (ZNS und PNS) gezeigt, und sie können auch dazu anregen Regeneration in vitro und in einemnimal Modelle von Nervenverletzungen ein. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) ist hoch im ZNS exprimiert und spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Entwicklung des Nervensystems, die synaptische Plastizität und Reparatur 2. Gliazelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF) fördert das Überleben vieler Arten von Neuronen, einschließlich dopaminerger und Motoneuronen 3. Somit ist es eine wichtige Strategie zur neuronalen Reparatur exogenen Quellen von neurotrophen Faktoren auf die verletzte oder erkrankte Bereiche des Nervensystems. Multiknochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSC) ein großes Potential für die Lieferung von therapeutischen Proteinen, um die beschädigte oder erkrankte Nervensystems zu behandeln. Transplantation von MSCs beträchtliche Aufmerksamkeit in den Bemühungen des Patienten kompatibel zellbasierten Therapien zu entwickeln zogen, da sie eine Reihe von Vorteilen, einschließlich: 1) der relativen Leichtigkeit der Isolierung und Wartung, 2) multipotente Fähigkeit, 3) kleiner ethische Bedenken und 4 haben) Überlebensfähigkeit und wandern nach der Transplantation und 5) Potenzial für autologe Transplantation 4,5. Vielversprechende Ergebnisse wurden bei Verwendung von naiven und gentechnisch MSCs in Tiermodellen für eine Vielzahl von verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Verletzungen des Rückenmarks 6,7, Schlaganfall 8,9, Myelinmangel 10 und Netzhautdegeneration 11-13 berichtet. Koppeln Zelltransplantation mit der Lieferung von neurotrophen Faktoren aus gentechnisch veränderten Stammzellen ist ein neuartiges und wichtiges neuronales Reparaturstrategie. Ein wesentlicher Schritt bei der Entwicklung von zellbasierten therapeutischen Faktor-Delivery-Systeme, die normale Gesundheit der gentechnisch veränderten Zellen zu bestimmen. Als solches ist das Hauptziel dieser Studie war es, allgemeine Wachstumsparameter von gentechnisch veränderten adulten Stammzellen zu bewerten. Ein wichtiger Ansatz zur raschen Einschätzung mehrerer Zellparametern ist es, zelluläre bildbasierten Hochdurch screenin beschäftigeng (HTS), die oft als High Content Screening (HCS) Verfahren 14 bezeichnet. Diese Technologie ermöglicht die automatisierte Bildaufnahme und Analyse, und dieser Ansatz ist besonders gut für die Stammzellenforschung Anwendungen geeignet. In diesem Projekt haben wir eine Profiling-Plattform, die für die schnelle Charakterisierung und Optimierung von Zellsubstrat Vorlieben und Zellfunktionen mit gentechnisch veränderten adulten Stammzellen unter Verwendung einer HCS-System ermöglicht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>96 well plates selected for use in ImageXpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam (Cambridge, MA)</td>
			<td>Ab16667</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>C7661</td>
			<td>Collagen from rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL(Entactin-Collagen-Laminin)</td>
			<td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td>
			<td>08-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chemistry Store (Ames, IA)</td>
			<td>12003510</td>
			<td>100%, 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P285</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P288</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine (mouse)</td>
			<td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice</td>
			<td>Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)</td>
			<td></td>
			<td>Isolated from bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td>
			<td>These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>O4042</td>
			<td>4% PFA in 0.1M PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (EDTA 1X)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>12440&#8211;046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma-qualified FBS</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>ImageXpress micro</td>
			<td>High content screening system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

MSC Wachstumsparameter wurden durch Kultivierung der verschiedenen Populationen von MSCs auf unterschiedlichen Substraten untersucht. Die fünf verschiedenen Populationen von MSC-Subtypen (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs und BDNF / GDNF-GFP-MSCs) wurden in 96-Well-Gewebekulturplatten mit unterschiedlichen vorbeschichtet plattiert Substrate, wie in Abbildung 1 dargestellt. Nach vier Tagen Kultivierung wurden die Platten fixiert und immunmarkierten und / oder mit den entsprechenden Reagenzien gefärbt und unter Verwendung des HCS System dann untersucht und Analysen mit der Bildaufnahme und Analyse-Software-Programm durchgeführt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> Fig. 1: 96-Well-Platte Vorlage für experimentelle Design 96-Well-Platten wurden mit verschiedenen Substraten und Vertiefungen beschichtet wurden mit Engineered Stammzellen geimpft, wie in der Schablone gezeigt. Als Beispiel wird nur wells in Reihen BF wurden in diesem Experiment verwendet. Reihen A, G und H wurden leer gelassen. Abkürzungen - MSCs: mesenchymale Stammzellen; GFP-MSCs: grün fluoreszierende Protein-exprimierenden MSC; BDNF-GFP-MSCs: brain derived neurotrophic factor-GFP-exprimierenden MSC; GDNF-GFP-MSCs; Gliazelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor-GFP-exprimierenden MSCs; BDNF / GDNF-GFP-MSCs; BDNF und GDNF- GFP exprimierende MSCs; ECL: Entactin-Collagen IV-Laminin). Anti-Ki67 Immunmarkierung, gefolgt von DAPI Gegenfärbung wurde verwendet, um zu bewerten, ob die verschiedenen Substrate beeinflußt Proliferation der verschiedenen Populationen von Engineered MSCs (2A). Die Expression des Antigens Ki67 läuft bevorzugt in der späten G 1, S, G 2 und M-Phasen des Zellzyklus und wird nicht in den Zellen in der Ruhephase (G 0) erkannt wird, und ist daher geeignet als zellulärer Marker für die Proliferation 15 . 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) ist eine häufig verwendete nuklar und Chromosomengegenfärbung, die blaue Fluoreszenz bei der Bindung an AT Regionen der DNA 16 abgibt. Die Gesamtzahl der Zellen in einem Bereich, kann durch Zählen der Anzahl von DAPI Kerne bestimmt werden. Wie in 2B dargestellt ist, obwohl es Variationen in den Prozentsätzen von proliferierenden MSCs, alle Substrate dennoch beträchtliche Zellproliferation für jede der MSC Subtypen unterstützt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> Abbildung 2: Ki67 Zellproliferationsassay. (A) verschmolzen, doppelklicken Fluoreszenzbild von Ki67 Immunmarkierung (rot) und DAPI (blau) Kernfärbung. Viele der MSCs wurden mit dem Ki67-Antikörper (rot) immunmarkiert. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. (B) Balkendiagramm, das die Prozentsätze der Ki67 immunolabeled MSC Subtypen von Polystyrol (PS) gewonnen, die Poly-L-Lysin (PLL), Fibronektin, KollagenTyp I, Laminin, Entactin und Kollagen-IV-Laminin (ECL) Substrate für 5 Tage in vitro (DIV). N = einem Experiment. Jeder Balken stellt gemittelt gepoolten Daten aus 8 abgebildet Webseiten, die auf 2 Brunnen für jede Bedingung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Propidiumiodid (PI) Färbung wurde verwendet, um zu beurteilen, ob verschiedene Substrate beeinflussen das Überleben der Zellen (Abbildung 3). Propidiumiodid ist eine häufig verwendete Rot-Fluoreszenz Kern- und Chromosomen-Gegenfärbung. Propidiumiodid ist Membran impermeant und allgemein von lebensfähigen Zellen ausgeschlossen sind, und ist daher nützlich, um tote Zellen zu erkennen in einer Population. Der Anteil von toten Zellen in einer gegebenen Bedingung bestimmt, wenn sie mit einer allgemeinen Kern Markierung, wie DAPI kombiniert, um alle Zellen innerhalb eines Feldes zu identifizieren. Der Anteil der PI-positiven Zellen war niedrig auf allen untersuchten Substraten (Abbildung 3). Als positive Kontrolle für die PI-Reagenz wurden einige Vertiefungen, die MSCs in 70% Ethanol inkubiert wurde, was üblicherweise für die meisten Zellen zu töten, was zu einem hohen Prozentsatz an PI-markierten Zellen, wie in 3B und 3C dargestellt (Ethanol behandelt positive Steuerung). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3: Propidiumiodid Zelltod-Assay. (A) verschmolzen, Doppelfluoreszenzbild für Propidiumiodid (rot) und DAPI (blau) Färbung. Obwohl die Kerne aller lebensfähigen Zellen wurden mit DAPI (blau) gefärbt wurde keine Propidiumiodidfärbung im MSCs. (B) praktisch alle MSCs wurden mit Propidiumiodid nach Exposition mit 70% igem Ethanol gefärbt erkannt. Maßstabsbalken in A und B = 100 &amp; mgr; m. (C) Balkendiagramm, das die Prozentsätze der Propidiumiodid (PI) gefärbt MSC SubtypS auf Polystyrol (PS), Poly-L-Lysin (PLL), Fibronektin, Collagen vom Typ I, Laminin, Entactin und Kollagen-IV-Laminin (ECL) Substrate für 5 Tage in vitro (DIV) gezüchtet. Ethanol Steuerung: Diese Bedingung diente als positive Kontrolle für die PI Färbereagenz. Die meisten Zellen zu PI-Färbung nach Ethanol-Behandlung unterzogen sind tot und damit positiv für den PI-Reagenz gefärbt. N = einem Experiment. Jeder Balken stellt gemittelt gepoolten Daten aus 8 abgebildet Webseiten, die auf 2 Brunnen für jede Bedingung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Um den möglichen Einfluss von verschiedenen Substraten auf das Verhalten von technischen MSCs, Zellmigration wurde mit Zeitraffer digitale Mikroskopie und den Durchlicht / Klimakammer-System auf dem HCS-System analysiert untersuchen (siehe Zusatz Video 1). Mehrere Standorte / Vertiefung wurden Zeitraffer abgebildetund verwendet, um die Zellmigrationsraten für die verschiedenen Subpopulationen von MSCs wachsen auf den verschiedenen Substraten mit Hilfe der Bildaufnahme und Analyse-Software zu berechnen. Im Allgemeinen, wie in 4C gezeigt, alle Subtypen von MSCs zeigte die schnellste Migrationsrate auf die extrazelluläre Matrix-beschichteten Oberflächen (Fibronectin, Kollagen, Laminin und ECL) und dem langsamsten auf nicht-beschichteten Polystyroloberflächen. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> Abb. 4: Zellverfolgung und Migration MSCs verfolgt mit der Bildaufnahme und Analyse-Software. Überlagerten Bilder der Durchlicht und Fluoreszenzbilder von (A) dem Beginn der Zeitraffer-Imaging und (B) 29 Stunden später am Ende des Zeitraffer-Imaging-Sitzung (siehe Zusatz Video 1). Zellmigration Spuren durch die farbige li angegebennes. Maßstab:. 50 um (C) Balkendiagramm, das durchschnittliche Migrationsraten (als &amp; mgr; m / h ausgedrückt) zum MSC Subtypen von Polystyrol (PS) gewonnen, die Poly-L-Lysin (PLL), Fibronektin, Collagen vom Typ I, Laminin, oder Entactin-Kollagen IV-Laminin (ECL) Substrate für 2 Tage in vitro (DIV). N = einem Experiment. Jeder Balken stellt den Mittelwert von mindestens 10 abgebildet Zellen von 2 Brunnen für jede Bedingung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse liefern erste Hinweise, dass diese Subpopulationen von gentechnisch MSCs ähnliche Wachstumseigenschaften anzuzeigen. Diese Ergebnisse liefern überzeugende Beweise, dass der lentivirale vermittelten genetischen Veränderungen dieser MSCs induzierte keine dramatischen nachweisbare schädliche Auswirkungen auf die Wachstumsparameter untersucht mit dieser Screening-Plattform. STADT Video 1. Zeitraffer-Digital-Video von MSC-Tracking mit Hilfe der Bildaufnahme und Analyse-Software-Programm. Die Migration ist für zwei MSCs [wie 1 (grün Spurlinie) und 2 (Blau-Tracking-Linie) angegeben] dargestellt. Video während einer 29 Stunden-Zeitraum erfasst. Bilder wurden alle 5 Minuten eingefangen. Fluoreszenzbilder der GFP-exprimierenden MSC wurde für Zeitraffer-Bildgebung bei der Erstellung des Videos verwendet. Kalibrierung bar = 50 &amp; mgr; m. Diese Art der Analyse ist für die Untersuchung der Zellverhalten, einschließlich der Zellmigration und der Zellteilung.

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High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

high-throughput-characterization-adult-stem-cells-engineered-for

Research

JoVE Journal

Medicine

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Serie: High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Forschung

Medizin

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

Stem Cell Transplantation Strategien für die Wiederherstellung der kognitiven Dysfunktion von Cranial Strahlentherapie verursachten Schäden

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Maus Eye Enukleation für Remote High-throughput Phänotypisierung

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve diagnostic and prognostic testing in a clinical setting and may help guide therapeutic interventions. When large numbers of candidate proteins are identified, it may be difficult to validate candidate biomarkers in a timely and efficient fashion from patient plasma samples that are event-driven, of finite volume and irreplaceable, such as at the onset of acute graft-versus-host disease (GVHD), a potentially life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Here we describe the process of performing commercially available ELISAs for six validated GVHD proteins: IL-2R&alpha;5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2, and REG3&alpha;3 (also known as PAP1) in a sequential fashion to minimize freeze-thaw cycles, thawed plasma time and plasma usage. For this procedure we perform the ELISAs in sequential order as determined by sample dilution factor as established in our laboratory using manufacturer ELISA kits and protocols with minor adjustments to facilitate optimal sequential ELISA performance. The resulting plasma biomarker concentrations can then be compiled and analyzed for significant findings within a patient cohort. While these biomarkers are currently for research purposes only, their incorporation into clinical care is currently being investigated in clinical trials.
This technique can be applied to perform ELISAs for multiple proteins/cytokines of interest on the same sample(s) provided the samples do not need to be mixed with other reagents. If ELISA kits do not come with pre-coated plates, 96-well half-well plates or 384-well plates can be used to further minimize use of samples/reagents.

High throughput validation of multiple candidate biomarkers can be performed by sequential ELISA in order to minimize freeze/thaw cycles and use of precious plasma samples. Here, we demonstrate how to sequentially perform ELISAs for six different validated plasma biomarkers1-3 of graft-versus-host disease (GVHD)4 on the same plasma sample.

High Throughput Sequential ELISA zur Validierung von Biomarkern des akuten Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Ein organ High Throughput-System zur Charakterisierung von Arzneimittelempfindlichkeit von Primary Multiple Myelomzellen

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered

Zusammenfassung

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