Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

96ウェルプレートのための1。基板の準備<ol><li> （ 図1）検査対象の異なる基板と細胞型を概説し、96ウェルプレートのマップを作成します。 </li><li>ストック異なる基質溶液[ポリ-L-リジン、フィブロネクチン、I型コラーゲン、ラミニンおよびエンタクチン、コラーゲンIV、ラミニン（ECL）]、96ウェルマルチウェルプレートを入手し、無菌細胞培養でワークステーションを準備フード。 </li><li> （この濃度は、以前に、細胞の成長および増殖のための基質濃度依存的アッセイに基づいて決定した）を5μg/ mlの最終濃度になるように滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でストックを希釈することにより、個々の基板を用意する。無菌の貯水池に注ぐ前にボルテックスを用いて混ぜる。 </li><li> 96ウェルマップ（ 図1）に応じて、各ウェルに100μlの基質溶液を加える（12ビットまたは8チャンネルのマイクロピペットは、96ウェルプレートにマイクロピペッティングのために便利である）。パラフィルムのストリップを使用して96ウェルプレートに蓋を密封し、4℃で一晩保存する。 </li></ol> 2.細胞のプレーティングとタイムラプスイメージング注：マウスMSCを、成体C57BL / 6マウスの骨髄から単離し、そして接着細胞株として維持した。レンチウイルスベクターのエンコーディングBDNF（LV-BDNFを使用して、およびグリア細胞由来神経栄養因子（ヒトcDNA GDNF）; MSCは、脳由来神経栄養因子（ヒトcDNA BDNF）を分泌するためにそれらを設計するレンチウイルスベクターを使用して感染したCMV-BDNF-IRES -GFP）、GDNF（LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP）、および緑色蛍光タンパク質（GFP、LV-GFP; CMV-GFP）。 注：マウスの​​間葉系幹細胞のための培養培地（MSCは）10 mg / mlのストレプトマイシン、10％ハイブリドーマ修飾ウシ胎児血清、10％ウマ血清、2mMのL-グルタミン、10,000 U / mlのペニシリンを含有するイスコフ改変ダルベッコ培地である。マウスのMSC（MSCは、GFP-MSCの5種類、BDNF-GFP-MSCを、GDNF-GFP-MのSCおよびBDNF / GDNF-GFP-MSCは）T75細胞培養フラスコ中で約30％コンフルエンスで播種した。 <ol><li> 細胞のプレーティング <ol><li>二回、翌日、吸引により基質溶液を除去し、滅菌PBSの約200μlで各ウェルをすすぐ。最後のPBSでリンスした後、各ウェルに細胞培養培地を（200μl/ウェル）を加える。 37℃に設定し、細胞培養インキュベーター中に96ウェルプレートを置き、平衡化のため、5％CO 2。 </li><li> 96ウェルプレートをインキュベーター内で平衡化されている間、T75フラスコから（馴化培地とも呼ばれる）の増殖培地を回収し（T75フラスコ中のMSCが収穫/めっき時に約70％コンフルエントであるべきである）細胞を採取し無菌条件下で15ミリリットルコニカルチューブに保存する（この条件培地は、以下のステップ2.1.4で使用されます）。 </li><li>フラスコに滅菌PBSの8ミリリットルを加え、穏やかに旋回した後、PBSをオフにピペットで0.05％トリプシンの1ミリリットルを追加し、0.01％T75フラスコの培養表面から細胞を剥離するEDTA溶液。位相差光学系を搭載した倒立顕微鏡を用いてフラスコを表示することにより、細胞の剥離を監視します。 </li><li>細胞が剥離したら、すぐにフラスコに（ステップ2.1.2収集）馴化培地の8ミリリットルを追加します。細胞懸濁液を収集し、15ミリリットルコニカル遠心チューブに移し、細胞をペレットに450×gで4分間遠心する。 </li><li>上清を除去し、新鮮な200μlの細胞ペレットを再懸濁し（37℃）で細胞培養培地を温め。 </li><li>血球計数器を使用してパンブルー生細胞数を実行することによって細胞懸濁液中の細胞数を決定します。約300細胞/ウェルの密度に96ウェルプレートの適切なウェルに細胞をプレー。 </li><li>細胞の各集団のためにこれらのステップを繰り返します。 </li></ol></li><li> タイムラプスイメージング <ol><li> MSCの全てがメッキされた後、場所2時間インキュベーターに96ウェルプレートは、MSCが基板に付着することを可能にする。 </li><li> HCSシステムを起動し、平衡化するためのシステムのために2時間待つ。 37℃までの環境制御装置を設定し、一定の空気供給源HCSシステム環境チャンバに空気中5％CO 2を含む混合ガスシリンダを接続する。 </li><li> 2時間の平衡期間以下のインキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、HCSシステムの細胞増殖チャンバ内に直接配置します。平衡化のための30分は、プレートのあらゆる熱関連の拡張を考慮して、プレートの設定を構成する画像取得と解析ソフトウェアを起動できるようにします。 </li><li>イメージングのための20X目的​​を選択します。 [ すなわち、などフィブロネクチン上のGFP-MSCを（×2回の反復30条件=合計で60ウェルの合計6基材×5 MSCサブタイプ）]タイムラプスイメージングを設定するための条件あたり2つのウェルを選択します。とイメージングのための2つのサイトを選択してください各ウェル中。 </li><li>イメージングのための正しい光の波長を選択してください。 注：二つの異なる波長（位相コントラスト及びGFP蛍光）はタイムラプスイメージングのために選択した。 </li><li>レーザーオートフォーカスを使用して、井戸の底に焦点を当て、最適化された焦点面を見つけるために、複数のサイトや複数のウェル用のテスト画像を撮影する。 </li><li>フォーカスが確立されると、すべての60ウェル（120部位）のための48時間の画像ごとに5分のキャプチャを開始する。 </li><li> HCSシステムからの96ウェルプレートを除去することにより、細胞を24時間ごとにフィード。各ウェルから培地75μlのを削除し、各ウェルに100μlの新鮮な培地を加える（37℃で新鮮な培地を平衡化し、5％CO 2）。 </li><li>タイムラプス実験の終わりに、HCSシステムからの96ウェルプレートを取り外します。無菌条件下で、各ウェルからの馴化培地試料を収集し、別の96ウェルプレートに、これらのサンプルを移す。 注：これらのサンプルは、さらにanalysのために使用することができる神経栄養因子のためのELISAを実行することによってである。 </li><li> （詳細は下記を参照のこと）などのKi67の細胞増殖アッセイまたはヨウ化プロピジウム生/死染色アッセイなどの追加アッセイ用培養したMSCを96ウェルプレートを準備します。 </li><li> セクション5以下で説明するように、細胞遊走/細胞追跡用のタイムラプスイメージング解析を行う。 </li></ol></li></ol> 3. Ki67の細胞の増殖およびヨウ化プロピジウムライブ/デッドアッセイ<ol><li> Ki67の細胞増殖アッセイ（免疫細胞化学） <ol><li> 0.1 Mリン酸（PO 4）を有する細胞培養物は1分間2回リンスバッファー。室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で文化を修正。 PFAを削除し、7分3回PBSでウェルをすすぐ。 </li><li>最後のすすぎの後、各ウェルに遮断溶液100μl（リン酸緩衝生理食塩水、5％正常ロバ血清、0.4％ウシアルブミン血清及び0.2％トリトンX-100）を追加ND 1時間室温でインキュベートする。 200：1の作業割合でブロッカー溶液中で希釈することにより、一次抗体、ウサギ抗Ki67のを準備します。 </li><li>ブロッカー溶液を除去し、各ウェルに一次抗体溶液100μlを適用します。 96ウェルプレートをカバーし、4℃で一晩、サンプルをインキュベートする。 </li><li>翌日、抗体溶液を除去し、7分、3回PBSですすぎます。 </li><li> 500：1の加工率​​でブロッキング溶液中で二次抗体、ロバ抗ウサギCy3のを準備します。 100：1の希釈で二次抗体溶液にDAPI核染色を追加します。最後のPBSリンスを除去した後、各ウェルに二次抗体/ DAPI溶液100μlを加える。 90分間、室温、暗所でインキュベートする。 </li><li>二次抗体/ DAPI溶液を除去し、7分間PBSで各ウェルをすすぎ、3回。画像化されるまで4℃で96ウェルプレートおよびストアをカバーする。 </li></ol></li><li> Propidiumヨウライブ/デッドアッセイ<ol><li>後述のようにヨウ化プロピジウム（PI）排除アッセイによって細胞死を測定する。 </li><li>培養培地中の1.5μMの濃度のヨウ化プロピジウム染色液を準備します。 </li><li>それらの細胞を死滅させることを意図して、2分間MSCの1ウェルに70％エタノールを100μlを追加します。この井戸は、PI染色の陽性対照として役立つ。 MSCの大部分は、PI染色細胞死を示すであろう。エタノール溶液を除去します。 </li><li>各ウェルに、ヨウ化プロピジウム染色溶液100μlを加え、5％CO 2インキュベーター中で37℃で20分間インキュベートする。 </li><li> 1分、2回の0.1 Mリン酸緩衝液で細胞をリンスする。室温で20分間、0.1M P0 4バッファに4％PFAを用いて細胞を固定してください。 PFAを削除し、7分間PBSで3回すすいでください。 </li><li>室温で1時間遮断溶液中に希釈されたDAPI溶液（1:50）でインキュベートする。で全てのウェルをすすぐ7分間、PBS、3回。 </li><li> DAPI溶液を除去し、7分間PBSで各ウェルをすすぎ、3回。画像化されるまで4℃で96ウェルプレートおよびストアをカバーする。 </li></ol></li></ol> 4.自動イメージングと多波長スコアリング分析<ol><li> 96ウェルプレートをロードHCSシステムに（以前のKi67免疫標識またはヨウ化プロピジウム染色のために処理される）、20分のHCSシステムの画像収集および解析ソフトウェアを開き、プレートを平衡化させる。 </li><li>細胞は自動露出機能を利用して存在し、関心のある各波長のオフセットを計算したZ-プレーンを探す1でビニングカメラと2のゲイン設定を使用して、10倍の対物レンズの取得設定を選択します。この分析のために、DAPI（W1）、Cy3で（W2）、およびFITC（W3）のための画像をキャプチャ。陰性対照ウェルは、画像取得のためのシグナルを示さないが​​できる最大強度レベルを選択する。この設定は、POSに適して確認してくださいitive井戸。 </li><li>プレートを取得。画像をキャプチャし、画像取得と解析ソフトウェアのデータベースに格納します。 </li><li>画像いったん上記取得した画像から、オープン画像収集と分析、オフラインのソフトウェアとレビュー版データを取得されている。 </li><li>多波長スコアリング分析を選択します。各波長の最小値と最大強度を設定します。 注：DAPI検出は各可視核の周りに染色をマークする必要があります。 Cy3では、Ki67の免疫反応性（IR）で陽性の細胞を検出する必要があり、負のコントロールの下でIRを検出しないでください。 Cy3のKi67のIRについては、おおよその最小幅は7であった、おおよその最大幅は30であった、地元のバックグラウンドを超える強度が150グレーレベルであり、最小染色面積は、50μm2であった。 </li><li>すべてのポジションのために分析を実行します。スプレッドシートに表示するデータをエクスポートします。 </li></ol> 5.細胞追跡<ol><li>オープン画像acquisitionおよび解析プログラムとをクリックして「レビュープレートデータ[DB] ...」は、目的のプレートを選択する。 </li><li> &quot;まあ対時間」としてデータを表示します。 </li><li>所望の選択を左クリックして、「サイト」セクションからのサイトのいずれかを選択します。選択して下の &quot;...送信された「&quot;波長： &quot;。右96ウェルプレートテンプレートでよくターゲットをクリックして、「ロードイメージ」をクリックしてください。 </li><li> &quot;アプリ&quot;とし、 &quot;トラック·オブジェクト」をクリックすることで、細胞を追跡します。 </li><li> 例えば 、Microsoft Excelのデータをエクスポートする形式を選択して「ダイナミックデータエクスチェンジ（DDE）」を使用してください。 </li><li>起源、デルタxとデルタyに例えば輸出、 経過時間、オブジェクト番号、距離、時間間隔、速度、絶対角度、距離に追跡データを選択する。 </li><li>標的細胞上の「Ctrlキー+左クリック」で関心の各セルにタグをつける。 </li><li>トラック細胞。必要に応じて、停止/「ESC」キーを用いて細胞の不適切な追跡を変更し、設定を調整します。 </li><li>細胞追跡が完了したら、「ログデータ」を使用してデータを保存します。 </li></ol>

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成体間葉系幹細胞（MSC）は、細胞および遺伝子送達に基づく治療を組み合わせる実験戦略の開発のための魅力的な細胞型である。 MSCは17,18のパラダイム/差別適切な誘導と神 ​​経細胞とグリア系統に分化転換、中胚葉系統の細胞に分化することができる多能性であり、かなりの可塑性を表示する。また、MSCは、神経変性状態19を含む多数の障害について、前臨床試験に移植し、有効であることが証明されました。 MSCの治療効果は十分に起因20有益な抗増殖性、抗炎症性および抗アポトーシス活性には公知である。 MSCはまた、おそらく、損傷または疾患21の部位に移植後のナイーブのMSCに関連付けられた神経保護の質に寄与する、種々の神経栄養および成長因子を産生および分泌することが知られている。 IMPOrtantly、MSCは、遺伝的に結合された細胞および遺伝子療法ベースのアプリケーションのための神経栄養因子の持続送達のために修飾することができ、CNS 11,19,22に対する損傷または疾患の多くの動物モデルにおいて使用されている。 組み合わせた細胞および遺伝子療法ベースの戦略を開発するには、細胞の健康状態を注意深くインビトロそれらの広範な使用の前に、特にインビボ適用において評価することが重要である。コンセプトの証明として、我々は高いコンテンツスクリーニング（HCS）のアプローチを用いて、細胞の健康とフィットネス上の遺伝子改変の影響を研究するために設計さと制御MSCラインの複数の集団を調査した。一般的には、HCSは、細胞画像ベースのハイスループットスクリーニング14を指す。このスクリーニングアプローチは、空間の複数のレベル（日ミリ秒）（細胞内への細胞）および時間的なRESでの細胞表現型の定量的評価を可能にするさまざまな実験条件間でolution。細胞増殖、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現、細胞死、及び細胞運動/移動：このアプローチを用いて、我々は次のパラメータに基質選択の可能性の違いにアクセス。実験は、96ウェル細胞培養プレートフォーマットで設計した。単板の中で、私たちが日常的レンチウイルス形質導入細胞の異なるMSC集団の各パラメータに関して、可能な基板関連の違いを調査し、オリジナルと設計のMSC、非形質導入MSCを比較した。これは、直接タイムラプスデジタルイメージングを行うことにより、ヨウ化プロピジウム染色を用いKi67の免疫標識、生/死細胞生存率アッセイを使用して、細胞増殖のようなインビトロアッセイのバッテリ、および、細胞の挙動と異なるMSC亜型の結果を比較するための手段を提供。 1はまた、個々のワットから収集馴化培地サンプルにELISA法を実行することができます。このHCSの延長として定量的神経栄養因子の分泌を決定するためのエル。異なるMSCサブタイプからの条件培地もまた、分泌因子11,23の生物学的活性を決定するためのin vitroバイオアッセイにおいて使用することができる。 HCSプラットフォームのこのタイプは、一次ニューロン培養神経幹細胞株24からの神経突起伸長のインビトロ測定のために使用することができる。全体として、我々の結果は、遺伝的に改変されたMSCの亜集団は、非修飾のMSCと比較して類似した挙動を示すことを実証した。細胞増殖および細胞遊走に対する多様な培養基質の影響は劇的にMSC亜型間で異なるだけでなく、培養基質ではなかった。このように、試験された細胞外マトリックス基質は、これらの異なる設計されたMSCのための細胞の挙動のこれらの側面の調節に重要な役割を果たしているようには見えなかった。 この研究は、differen分析するためのHCSシステムの使用を示す細胞の挙動の側面をトン。しかしながら、画像解析に関連する制限に遭遇することは珍しいことではない。機会に、蛍光画像を分析しながら、それが免疫標識または陽性に染色/標識のように染色した細胞をカウントされるであろう上記の正確な閾値を決定することがやや困難であった。したがって、主観的なバイアスを最小にするために、閾値の決定は、対照と比較して（蛍光イメージングのための陰性対照は、一次または二次抗体の省略によって、すべての処理中に並行して実施した）に依存した。別の制限は、時間の経過デジタル画像を使用して、細胞移動の解析中に発生しました。いくつかのケースでは、イメージングソフトウェアは、実際には非常に短い距離を移行細胞対細胞のランダムなブラウン運動を区別することができなかった。追加の制限が解析ソフトウェアはmultipの存在を区別することができませんでした状況で明らかであった一互いに非常に近接ル細胞。この制限を克服するために、分析ではなく、完全に自動化された分析の間に手動のセル選択を必要とした。細胞播種密度はまた、互いから分離して成長する細胞に対する塊中で増殖するより大きな嗜好を示す細胞の集団間の細胞遊走データスキューをもたらすことができる。違いこれらのタイプは、おそらく部分的には、細胞 - 細胞の環境に対する細胞 - 基質の反射である。 画像を取得し、データ分析を実行するためにHCSシステムを使用して、複数のセルパラメータを評価するための効率的かつ迅速な手段を提供する。また、30の異なる条件（6基質と5種類のMSCのサブタイプ）のためのタイムラプスデジタルビデオは、日常的に環境室を使用しながら、時間から日間（48時間）の範囲の期間に取得した。このデータは、その後、別のECM上で種々の細胞株を横切る細胞の移動速度の差を計算し、決定するために使用された分子。 本報告書では、細胞の健康と機能を評価するために、高コンテンツスクリーニングプラットフォームの実装を強調している。このタイプの分析は、有向細胞成長および神経再生を促進するために、細胞型、ならびにポリマー基板を設計するための合理的な戦略を開発するために有用である。これは、細胞移植戦略を用いてインビボ前臨床研究における従来広範囲の治療因子の幹細胞ベースの送達の応用に向けて不可欠なステップである。

神経系障害の治療のために有用な治療法を実施するの主な問題は、さらに変性を防止し、また、機能の回復を促進する効果的な方法を開発することである。革新的な戦略は、移植前に神経保護因子の産生のために、遺伝子操作幹細胞のex vivoである。遺伝子治療のタイプと結合し、細胞ベースの治療法の組み合わせは、神経系の疾患または損傷誘発性神経細胞死の治療のための強力な方法を提供する。 神経栄養因子は、成熟した神経細胞の成長と発達ニューロンの生存だけでなく、メンテナンスや可塑性のために必須である。多くの研究は、中枢および末梢神経系（CNSおよびPNS）のニューロンの初期の成長および分化を促進する神経栄養因子の重要な役割を実証しており、それらはまた、 インビトロおよび内再生を刺激することができる神経損傷1のニマルモデル。脳由来神経栄養因子（BDNF）は、高度にCNSで発現され、神経発生、シナプス可塑性および修理2の調節に重要な役割を果たしている。グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）は、ドーパミン作動性及び運動ニューロン3を含む神経細胞の多くのタイプの生存を促進する。したがって、神経修復のための重要な戦略は、神経系の損傷したまたは罹患した領域に神経栄養因子の外因性の供給源を提供することにある。 多能性骨髄由来の間葉系幹細胞（MSC）は、損傷または罹患した神経系を治療するための治療用タンパク質の送達のための大きな可能性を保持する。彼らは、2）多能能力、3）少し倫理的な問題、4離およびメンテナンス1）相対的な容易さを含む多くの利点を有するので、MSCの移植は、患者の互換性の細胞ベースの治療法を開発するための努力に大きな注目を集めている）移植と自家移植の4,5のため5）潜在的な以下の生き残りと移行する機能。有望な結果は、脊髄損傷6,7、ストローク8,9、ミエリン欠損10、及び網膜変性11-13を含む様々な神経変性状態の数の動物モデルにおけるナイーブおよび遺伝子操作されたMSCの使用が報告されている。遺伝子操作された幹細胞からの神経栄養因子の送達と細胞移植を結合する新規かつ重要な神経修復のストラテジーである。 細胞ベースの治療因子の送達システムを開発する上で必須のステップでは、操作された細胞の正常な健康状態を決定することである。このように、本研究の主な目的は、遺伝子操作された成体幹細胞の一般的な成長パラメータを評価することであった。急速に複数のセルパラメータを評価するための重要なアプローチは、細胞の画像に基づくハイスループットscreeninを使用することであるG（HTS）、しばしば高いコンテンツスクリーニング（HCS）手順14と呼ばれる。この技術は、自動化された画像取得および解析を可能にし、このアプローチは、幹細胞研究用途に特に適している。本プロジェクトでは、HCSシステムを採用した遺伝子操作した成体幹細胞と細胞基質の好みや細胞機能の迅速な特性評価と最適化が可能プロファイリングプラットフォームを開発しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>96 well plates selected for use in ImageXpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam (Cambridge, MA)</td>
			<td>Ab16667</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>C7661</td>
			<td>Collagen from rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL(Entactin-Collagen-Laminin)</td>
			<td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td>
			<td>08-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chemistry Store (Ames, IA)</td>
			<td>12003510</td>
			<td>100%, 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P285</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P288</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine (mouse)</td>
			<td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice</td>
			<td>Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)</td>
			<td></td>
			<td>Isolated from bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td>
			<td>These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>O4042</td>
			<td>4% PFA in 0.1M PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (EDTA 1X)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>12440&#8211;046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma-qualified FBS</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>ImageXpress micro</td>
			<td>High content screening system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

MSCの成長パラメータは、異なる基板上のMSCの異なる集団を培養することによって調べた。 MSCのサブタイプ（MSCは、GFP-MSCは、BDNF-GFP-MSCは、GDNF-GFP-MSCを、及びBDNF / GDNF-GFP-MSCの）5つの異なる集団は異なるでプレコーティングした96ウェル組織培養プレートに播種した図1に示すように、基板は、培養の4日後、プレートを固定し、免疫標識および/ ​​または適切な試薬を用いて染色した後、HCSシステムを用いて検査し、画像取得及び解析ソフトウェアプログラムを用いて行われた分析。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> 図1：実験計画のために96ウェルプレートテンプレート 96ウェルプレート、種々の基材、ウェルをコーティングしたテンプレートに示すように操作された幹細胞を播種した。は 。例として、唯一のwel行BFにおけるlsがこの実験に使用した。列A、GおよびHは空のままにした。略語 - MSCは：間葉系幹細胞; GFP-MSCは：緑色蛍光タンパク質を発現するMSCを。 BDNF-GFP-MSCの：脳由来神経栄養因子-GFPを発現するMSCを。 GDNF-GFP-MSCの。グリア細胞由来神経栄養因子-GFPを発現するMSCを。 BDNF / GDNF-GFP-MSCの。 BDNFおよびGDNF- GFP発現MSCを。 ECL：エンタクチンコラーゲンIV-ラミニン）。 DAPI対比続く抗Ki67の免疫標識は、異なる基板が操作されたMSC（ 図2A）の異なる集団の増殖に影響を与えたかどうかを評価するために使用した。のKi67抗原の発現は、細胞周期のG 1、S、G 2及びM後期段階の間に優先的に発生し、休止期にある細胞（G 0）が検出されなかったので、増殖15に対する細胞マーカーとして有用である。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）は、一般的に使用されるニューあるDNA 16の領域にに結合すると青色の蛍光を発する明確な染色体対比。フィールド内の細胞の総数は、DAPI染色された核の数を数えることによって決定することができる。 図2Bに示されるように増殖したMSCの割合のばらつきがあったが、全ての基板にもかかわらず、MSCサブタイプのそれぞれについて、かなりの細胞増殖を支持した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> 図2：Ki67の細胞増殖アッセイ。 Ki67の免疫標識の（A）合併、二重蛍光画像（赤）およびDAPI（青色）核染色。 MSCの多くは、Ki67抗体（赤）で免疫標識した。 Ki67についてのパーセンテージを示すスケールバー=50μmである。（B）棒グラフは、ポリスチレン（PS）、ポリ-L-リジン（PLL）、フィブロネクチン、コラーゲン上で増殖させたMSCのサブタイプを免疫標識私は、ラミニン、またはエンタクチン-コラーゲンIV-ラミニン、in vitroで 5日間（ECL）基質（DIV）を入力します。 Nは、一つの実験を=。各バーは、各条件のための2つのウェルから8画像化サイトから平均プールされたデータを表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ヨウ化プロピジウム（PI）染色は、異なる基質が細胞生存率（ 図3）の影響を受けるかどうかを評価するために使用した。ヨウ化プロピジウムは、一般的に使用される赤色蛍光核染色体の対比である。ヨウ化プロピジウムは、膜非透過性であり、一般的に、生細胞から排除され、したがって、集団中の死細胞を検出するのに有用である。フィールド内のすべてのセルを識別するようDAPIなどの一般的な核のラベルと組み合わされた場合、与えられた条件の中の死細胞の割合を決定することができる。 PI陽性細胞の割合は、（試験した全ての基板上に低かった図3）。 PI試薬の陽性対照として、MSCを含む、いくつかのウェルは、70％エタノール中で、図3B及び図3Cに示すように、PI標識細胞の高い割合をもたらし、ほとんどの細胞を死滅させることが知られている条件でインキュベートした（エタノール、正扱わコントロール）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> 図3：ヨウ化プロピジウムは、細胞死アッセイ。 （A）合併、ヨウ化プロピジウム（赤）およびDAPI（青）染色のための二重蛍光画像。生存細胞の全ての核をDAPI（青色）で染色されたが、全くヨウ化プロピジウム染色はMSCが検出されなかった。（B）実質的に全てのMSCは、70％エタノールに暴露した後、ヨウ化プロピジウムで染色した。 A中のスケールバー、B =100μmである。ヨウ化プロピジウム（PI）のパーセンテージを示す（C）棒グラフは、染色されたMSCのサブタイプポリスチレン（PS）、ポリ-L-リジン（PLL）、フィブロネクチン、 インビトロ （DIV） で 5日間コラーゲンタイプI、ラミニン、またはエンタクチン、コラーゲンIV、ラミニン（ECL）基板上に成長させた。■。エタノール制御：この状態は、PI染色試薬の陽性対照として役立った。 PI染色以下のエタノール処理を施しほとんどの細胞は死んでいるので、積極的にPI試薬について染色である。 Nは、一つの実験を=。各バーは、各条件のための2つのウェルから8画像化サイトから平均プールされたデータを表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 操作されたMSCの挙動に対する異なる基質の可能性のある影響を調べるために、細胞遊走は、（ 補足ビデオ1を参照）HCSシステムにタイムラプスデジタル顕微鏡および透過光/環境チャンバシステムを用いて分析した。複数のサイト/ウェルタイムラプスを画像化した画像取得及び解析ソフトウェアプログラムを使用して異なる基板上に成長したMSCの異なる亜集団のための細胞移動速度を計算するために使用される。 図4（c）に示すように、一般に、MSCの全てのサブタイプは、細胞外マトリックスでコーティングされた表面（フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンおよびECL）非コートポリスチレン表面上の最も遅い最速移動速度を示した。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> 図4：細胞追跡および移行 MSCは、画像収集及び分析ソフトウェアで追跡。 29時間後、タイムラプスイメージングセッションの終了時でのタイムラプスイメージング及び（B）の（A）は、開始からの透過光と蛍光画像のオーバーレイされた画像は、（ 補足ビデオ1を参照のこと）。細胞遊走トラック着色李によって示されのNE。スケールバー：ポリスチレン（PS）、ポリ-L-リジン（PLL）、フィブロネクチン、I型コラーゲン、ラミニン上で増殖させたMSCの亜型についての平均移動速度を示す50μmの（C）バーグラフ（ミクロン/時間で表される）、またはエンタクチン-コラーゲンIV-ラミニン、in vitroで 2日間（ECL）基質（DIV）。 Nは、一つの実験を=。各バーは、各条件のための2つのウェルから少なくとも10撮像されたセルの平均を表している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> まとめると、これらの結果は、遺伝子操作されたMSCのこれらの亜集団は、類似の増殖特性を表示するという予備的証拠を提供する。これらの結果は、これらのMSCの遺伝子改変を仲介するレンチウイルスは、このスクリーニングプラットフォームを用いて調べ成長パラメータには劇的な検出可能な有害な作用を誘発しないことを説得力のある証拠を提供する。 補足ビデオ画像取得と解析ソフトウェアプログラムを使用して、MSCの追跡の1。タイムラプスデジタルビデオ。 [1（緑のトラッキングライン）として示され、2（ブルートラッキングライン）] 2のMSCの移行パスのが示されている。ビデオは29時間の期間中に捕獲した。画像は5分ごとに捕獲された。 GFPを発現するMSCの蛍光画像は、ビデオの調製においてタイムラプスイメージングのために使用した。 =50μmのキャリブレーションバー。このタイプの分析は、細胞移動および細胞分裂を含む、細胞の挙動を研究するために有用である。

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High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

医学

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

頭蓋放射線療法によって引き起こされた認知機能障害の回復のための細胞移植戦略を幹

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

リモートハイスループット表現型解析のためのマウスの目の摘出

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve diagnostic and prognostic testing in a clinical setting and may help guide therapeutic interventions. When large numbers of candidate proteins are identified, it may be difficult to validate candidate biomarkers in a timely and efficient fashion from patient plasma samples that are event-driven, of finite volume and irreplaceable, such as at the onset of acute graft-versus-host disease (GVHD), a potentially life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Here we describe the process of performing commercially available ELISAs for six validated GVHD proteins: IL-2R&alpha;5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2, and REG3&alpha;3 (also known as PAP1) in a sequential fashion to minimize freeze-thaw cycles, thawed plasma time and plasma usage. For this procedure we perform the ELISAs in sequential order as determined by sample dilution factor as established in our laboratory using manufacturer ELISA kits and protocols with minor adjustments to facilitate optimal sequential ELISA performance. The resulting plasma biomarker concentrations can then be compiled and analyzed for significant findings within a patient cohort. While these biomarkers are currently for research purposes only, their incorporation into clinical care is currently being investigated in clinical trials.
This technique can be applied to perform ELISAs for multiple proteins/cytokines of interest on the same sample(s) provided the samples do not need to be mixed with other reagents. If ELISA kits do not come with pre-coated plates, 96-well half-well plates or 384-well plates can be used to further minimize use of samples/reagents.

High throughput validation of multiple candidate biomarkers can be performed by sequential ELISA in order to minimize freeze/thaw cycles and use of precious plasma samples. Here, we demonstrate how to sequentially perform ELISAs for six different validated plasma biomarkers1-3 of graft-versus-host disease (GVHD)4 on the same plasma sample.

急性移植片対宿主病のバイオマーカーの検証のためのハイスループットシーケンシャルELISA

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

シーケンシャル<em&gt;インビボ</em&gt;骨折修復中に、骨形成幹細胞/前駆細胞のイメージング

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

一次多発性骨髄腫細胞の薬剤感受性の特徴付けのための器官のハイスループットシステム

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...