Name: high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies
Uploaded: 2015-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
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Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

96ウェルプレートのための1。基板の準備<ol><li> （ 図1）検査対象の異なる基板と細胞型を概説し、96ウェルプレートのマップを作成します。 </li><li>ストック異なる基質溶液[ポリ-L-リジン、フィブロネクチン、I型コラーゲン、ラミニンおよびエンタクチン、コラーゲンIV、ラミニン（ECL）]、96ウェルマルチウェルプレートを入手し、無菌細胞培養でワークステーションを準備フード。 </li><li> （この濃度は、以前に、細胞の成長および増殖のための基質濃度依存的アッセイに基づいて決定した）を5μg/ mlの最終濃度になるように滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でストックを希釈することにより、個々の基板を用意する。無菌の貯水池に注ぐ前にボルテックスを用いて混ぜる。 </li><li> 96ウェルマップ（ 図1）に応じて、各ウェルに100μlの基質溶液を加える（12ビットまたは8チャンネルのマイクロピペットは、96ウェルプレートにマイクロピペッティングのために便利である）。パラフィルムのストリップを使用して96ウェルプレートに蓋を密封し、4℃で一晩保存する。 </li></ol> 2.細胞のプレーティングとタイムラプスイメージング注：マウスMSCを、成体C57BL / 6マウスの骨髄から単離し、そして接着細胞株として維持した。レンチウイルスベクターのエンコーディングBDNF（LV-BDNFを使用して、およびグリア細胞由来神経栄養因子（ヒトcDNA GDNF）; MSCは、脳由来神経栄養因子（ヒトcDNA BDNF）を分泌するためにそれらを設計するレンチウイルスベクターを使用して感染したCMV-BDNF-IRES -GFP）、GDNF（LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP）、および緑色蛍光タンパク質（GFP、LV-GFP; CMV-GFP）。 注：マウスの​​間葉系幹細胞のための培養培地（MSCは）10 mg / mlのストレプトマイシン、10％ハイブリドーマ修飾ウシ胎児血清、10％ウマ血清、2mMのL-グルタミン、10,000 U / mlのペニシリンを含有するイスコフ改変ダルベッコ培地である。マウスのMSC（MSCは、GFP-MSCの5種類、BDNF-GFP-MSCを、GDNF-GFP-MのSCおよびBDNF / GDNF-GFP-MSCは）T75細胞培養フラスコ中で約30％コンフルエンスで播種した。 <ol><li> 細胞のプレーティング <ol><li>二回、翌日、吸引により基質溶液を除去し、滅菌PBSの約200μlで各ウェルをすすぐ。最後のPBSでリンスした後、各ウェルに細胞培養培地を（200μl/ウェル）を加える。 37℃に設定し、細胞培養インキュベーター中に96ウェルプレートを置き、平衡化のため、5％CO 2。 </li><li> 96ウェルプレートをインキュベーター内で平衡化されている間、T75フラスコから（馴化培地とも呼ばれる）の増殖培地を回収し（T75フラスコ中のMSCが収穫/めっき時に約70％コンフルエントであるべきである）細胞を採取し無菌条件下で15ミリリットルコニカルチューブに保存する（この条件培地は、以下のステップ2.1.4で使用されます）。 </li><li>フラスコに滅菌PBSの8ミリリットルを加え、穏やかに旋回した後、PBSをオフにピペットで0.05％トリプシンの1ミリリットルを追加し、0.01％T75フラスコの培養表面から細胞を剥離するEDTA溶液。位相差光学系を搭載した倒立顕微鏡を用いてフラスコを表示することにより、細胞の剥離を監視します。 </li><li>細胞が剥離したら、すぐにフラスコに（ステップ2.1.2収集）馴化培地の8ミリリットルを追加します。細胞懸濁液を収集し、15ミリリットルコニカル遠心チューブに移し、細胞をペレットに450×gで4分間遠心する。 </li><li>上清を除去し、新鮮な200μlの細胞ペレットを再懸濁し（37℃）で細胞培養培地を温め。 </li><li>血球計数器を使用してパンブルー生細胞数を実行することによって細胞懸濁液中の細胞数を決定します。約300細胞/ウェルの密度に96ウェルプレートの適切なウェルに細胞をプレー。 </li><li>細胞の各集団のためにこれらのステップを繰り返します。 </li></ol></li><li> タイムラプスイメージング <ol><li> MSCの全てがメッキされた後、場所2時間インキュベーターに96ウェルプレートは、MSCが基板に付着することを可能にする。 </li><li> HCSシステムを起動し、平衡化するためのシステムのために2時間待つ。 37℃までの環境制御装置を設定し、一定の空気供給源HCSシステム環境チャンバに空気中5％CO 2を含む混合ガスシリンダを接続する。 </li><li> 2時間の平衡期間以下のインキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、HCSシステムの細胞増殖チャンバ内に直接配置します。平衡化のための30分は、プレートのあらゆる熱関連の拡張を考慮して、プレートの設定を構成する画像取得と解析ソフトウェアを起動できるようにします。 </li><li>イメージングのための20X目的​​を選択します。 [ すなわち、などフィブロネクチン上のGFP-MSCを（×2回の反復30条件=合計で60ウェルの合計6基材×5 MSCサブタイプ）]タイムラプスイメージングを設定するための条件あたり2つのウェルを選択します。とイメージングのための2つのサイトを選択してください各ウェル中。 </li><li>イメージングのための正しい光の波長を選択してください。 注：二つの異なる波長（位相コントラスト及びGFP蛍光）はタイムラプスイメージングのために選択した。 </li><li>レーザーオートフォーカスを使用して、井戸の底に焦点を当て、最適化された焦点面を見つけるために、複数のサイトや複数のウェル用のテスト画像を撮影する。 </li><li>フォーカスが確立されると、すべての60ウェル（120部位）のための48時間の画像ごとに5分のキャプチャを開始する。 </li><li> HCSシステムからの96ウェルプレートを除去することにより、細胞を24時間ごとにフィード。各ウェルから培地75μlのを削除し、各ウェルに100μlの新鮮な培地を加える（37℃で新鮮な培地を平衡化し、5％CO 2）。 </li><li>タイムラプス実験の終わりに、HCSシステムからの96ウェルプレートを取り外します。無菌条件下で、各ウェルからの馴化培地試料を収集し、別の96ウェルプレートに、これらのサンプルを移す。 注：これらのサンプルは、さらにanalysのために使用することができる神経栄養因子のためのELISAを実行することによってである。 </li><li> （詳細は下記を参照のこと）などのKi67の細胞増殖アッセイまたはヨウ化プロピジウム生/死染色アッセイなどの追加アッセイ用培養したMSCを96ウェルプレートを準備します。 </li><li> セクション5以下で説明するように、細胞遊走/細胞追跡用のタイムラプスイメージング解析を行う。 </li></ol></li></ol> 3. Ki67の細胞の増殖およびヨウ化プロピジウムライブ/デッドアッセイ<ol><li> Ki67の細胞増殖アッセイ（免疫細胞化学） <ol><li> 0.1 Mリン酸（PO 4）を有する細胞培養物は1分間2回リンスバッファー。室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で文化を修正。 PFAを削除し、7分3回PBSでウェルをすすぐ。 </li><li>最後のすすぎの後、各ウェルに遮断溶液100μl（リン酸緩衝生理食塩水、5％正常ロバ血清、0.4％ウシアルブミン血清及び0.2％トリトンX-100）を追加ND 1時間室温でインキュベートする。 200：1の作業割合でブロッカー溶液中で希釈することにより、一次抗体、ウサギ抗Ki67のを準備します。 </li><li>ブロッカー溶液を除去し、各ウェルに一次抗体溶液100μlを適用します。 96ウェルプレートをカバーし、4℃で一晩、サンプルをインキュベートする。 </li><li>翌日、抗体溶液を除去し、7分、3回PBSですすぎます。 </li><li> 500：1の加工率​​でブロッキング溶液中で二次抗体、ロバ抗ウサギCy3のを準備します。 100：1の希釈で二次抗体溶液にDAPI核染色を追加します。最後のPBSリンスを除去した後、各ウェルに二次抗体/ DAPI溶液100μlを加える。 90分間、室温、暗所でインキュベートする。 </li><li>二次抗体/ DAPI溶液を除去し、7分間PBSで各ウェルをすすぎ、3回。画像化されるまで4℃で96ウェルプレートおよびストアをカバーする。 </li></ol></li><li> Propidiumヨウライブ/デッドアッセイ<ol><li>後述のようにヨウ化プロピジウム（PI）排除アッセイによって細胞死を測定する。 </li><li>培養培地中の1.5μMの濃度のヨウ化プロピジウム染色液を準備します。 </li><li>それらの細胞を死滅させることを意図して、2分間MSCの1ウェルに70％エタノールを100μlを追加します。この井戸は、PI染色の陽性対照として役立つ。 MSCの大部分は、PI染色細胞死を示すであろう。エタノール溶液を除去します。 </li><li>各ウェルに、ヨウ化プロピジウム染色溶液100μlを加え、5％CO 2インキュベーター中で37℃で20分間インキュベートする。 </li><li> 1分、2回の0.1 Mリン酸緩衝液で細胞をリンスする。室温で20分間、0.1M P0 4バッファに4％PFAを用いて細胞を固定してください。 PFAを削除し、7分間PBSで3回すすいでください。 </li><li>室温で1時間遮断溶液中に希釈されたDAPI溶液（1:50）でインキュベートする。で全てのウェルをすすぐ7分間、PBS、3回。 </li><li> DAPI溶液を除去し、7分間PBSで各ウェルをすすぎ、3回。画像化されるまで4℃で96ウェルプレートおよびストアをカバーする。 </li></ol></li></ol> 4.自動イメージングと多波長スコアリング分析<ol><li> 96ウェルプレートをロードHCSシステムに（以前のKi67免疫標識またはヨウ化プロピジウム染色のために処理される）、20分のHCSシステムの画像収集および解析ソフトウェアを開き、プレートを平衡化させる。 </li><li>細胞は自動露出機能を利用して存在し、関心のある各波長のオフセットを計算したZ-プレーンを探す1でビニングカメラと2のゲイン設定を使用して、10倍の対物レンズの取得設定を選択します。この分析のために、DAPI（W1）、Cy3で（W2）、およびFITC（W3）のための画像をキャプチャ。陰性対照ウェルは、画像取得のためのシグナルを示さないが​​できる最大強度レベルを選択する。この設定は、POSに適して確認してくださいitive井戸。 </li><li>プレートを取得。画像をキャプチャし、画像取得と解析ソフトウェアのデータベースに格納します。 </li><li>画像いったん上記取得した画像から、オープン画像収集と分析、オフラインのソフトウェアとレビュー版データを取得されている。 </li><li>多波長スコアリング分析を選択します。各波長の最小値と最大強度を設定します。 注：DAPI検出は各可視核の周りに染色をマークする必要があります。 Cy3では、Ki67の免疫反応性（IR）で陽性の細胞を検出する必要があり、負のコントロールの下でIRを検出しないでください。 Cy3のKi67のIRについては、おおよその最小幅は7であった、おおよその最大幅は30であった、地元のバックグラウンドを超える強度が150グレーレベルであり、最小染色面積は、50μm2であった。 </li><li>すべてのポジションのために分析を実行します。スプレッドシートに表示するデータをエクスポートします。 </li></ol> 5.細胞追跡<ol><li>オープン画像acquisitionおよび解析プログラムとをクリックして「レビュープレートデータ[DB] ...」は、目的のプレートを選択する。 </li><li> &quot;まあ対時間」としてデータを表示します。 </li><li>所望の選択を左クリックして、「サイト」セクションからのサイトのいずれかを選択します。選択して下の &quot;...送信された「&quot;波長： &quot;。右96ウェルプレートテンプレートでよくターゲットをクリックして、「ロードイメージ」をクリックしてください。 </li><li> &quot;アプリ&quot;とし、 &quot;トラック·オブジェクト」をクリックすることで、細胞を追跡します。 </li><li> 例えば 、Microsoft Excelのデータをエクスポートする形式を選択して「ダイナミックデータエクスチェンジ（DDE）」を使用してください。 </li><li>起源、デルタxとデルタyに例えば輸出、 経過時間、オブジェクト番号、距離、時間間隔、速度、絶対角度、距離に追跡データを選択する。 </li><li>標的細胞上の「Ctrlキー+左クリック」で関心の各セルにタグをつける。 </li><li>トラック細胞。必要に応じて、停止/「ESC」キーを用いて細胞の不適切な追跡を変更し、設定を調整します。 </li><li>細胞追跡が完了したら、「ログデータ」を使用してデータを保存します。 </li></ol>

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成体間葉系幹細胞（MSC）は、細胞および遺伝子送達に基づく治療を組み合わせる実験戦略の開発のための魅力的な細胞型である。 MSCは17,18のパラダイム/差別適切な誘導と神 ​​経細胞とグリア系統に分化転換、中胚葉系統の細胞に分化することができる多能性であり、かなりの可塑性を表示する。また、MSCは、神経変性状態19を含む多数の障害について、前臨床試験に移植し、有効であることが証明されました。 MSCの治療効果は十分に起因20有益な抗増殖性、抗炎症性および抗アポトーシス活性には公知である。 MSCはまた、おそらく、損傷または疾患21の部位に移植後のナイーブのMSCに関連付けられた神経保護の質に寄与する、種々の神経栄養および成長因子を産生および分泌することが知られている。 IMPOrtantly、MSCは、遺伝的に結合された細胞および遺伝子療法ベースのアプリケーションのための神経栄養因子の持続送達のために修飾することができ、CNS 11,19,22に対する損傷または疾患の多くの動物モデルにおいて使用されている。 組み合わせた細胞および遺伝子療法ベースの戦略を開発するには、細胞の健康状態を注意深くインビトロそれらの広範な使用の前に、特にインビボ適用において評価することが重要である。コンセプトの証明として、我々は高いコンテンツスクリーニング（HCS）のアプローチを用いて、細胞の健康とフィットネス上の遺伝子改変の影響を研究するために設計さと制御MSCラインの複数の集団を調査した。一般的には、HCSは、細胞画像ベースのハイスループットスクリーニング14を指す。このスクリーニングアプローチは、空間の複数のレベル（日ミリ秒）（細胞内への細胞）および時間的なRESでの細胞表現型の定量的評価を可能にするさまざまな実験条件間でolution。細胞増殖、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現、細胞死、及び細胞運動/移動：このアプローチを用いて、我々は次のパラメータに基質選択の可能性の違いにアクセス。実験は、96ウェル細胞培養プレートフォーマットで設計した。単板の中で、私たちが日常的レンチウイルス形質導入細胞の異なるMSC集団の各パラメータに関して、可能な基板関連の違いを調査し、オリジナルと設計のMSC、非形質導入MSCを比較した。これは、直接タイムラプスデジタルイメージングを行うことにより、ヨウ化プロピジウム染色を用いKi67の免疫標識、生/死細胞生存率アッセイを使用して、細胞増殖のようなインビトロアッセイのバッテリ、および、細胞の挙動と異なるMSC亜型の結果を比較するための手段を提供。 1はまた、個々のワットから収集馴化培地サンプルにELISA法を実行することができます。このHCSの延長として定量的神経栄養因子の分泌を決定するためのエル。異なるMSCサブタイプからの条件培地もまた、分泌因子11,23の生物学的活性を決定するためのin vitroバイオアッセイにおいて使用することができる。 HCSプラットフォームのこのタイプは、一次ニューロン培養神経幹細胞株24からの神経突起伸長のインビトロ測定のために使用することができる。全体として、我々の結果は、遺伝的に改変されたMSCの亜集団は、非修飾のMSCと比較して類似した挙動を示すことを実証した。細胞増殖および細胞遊走に対する多様な培養基質の影響は劇的にMSC亜型間で異なるだけでなく、培養基質ではなかった。このように、試験された細胞外マトリックス基質は、これらの異なる設計されたMSCのための細胞の挙動のこれらの側面の調節に重要な役割を果たしているようには見えなかった。 この研究は、differen分析するためのHCSシステムの使用を示す細胞の挙動の側面をトン。しかしながら、画像解析に関連する制限に遭遇することは珍しいことではない。機会に、蛍光画像を分析しながら、それが免疫標識または陽性に染色/標識のように染色した細胞をカウントされるであろう上記の正確な閾値を決定することがやや困難であった。したがって、主観的なバイアスを最小にするために、閾値の決定は、対照と比較して（蛍光イメージングのための陰性対照は、一次または二次抗体の省略によって、すべての処理中に並行して実施した）に依存した。別の制限は、時間の経過デジタル画像を使用して、細胞移動の解析中に発生しました。いくつかのケースでは、イメージングソフトウェアは、実際には非常に短い距離を移行細胞対細胞のランダムなブラウン運動を区別することができなかった。追加の制限が解析ソフトウェアはmultipの存在を区別することができませんでした状況で明らかであった一互いに非常に近接ル細胞。この制限を克服するために、分析ではなく、完全に自動化された分析の間に手動のセル選択を必要とした。細胞播種密度はまた、互いから分離して成長する細胞に対する塊中で増殖するより大きな嗜好を示す細胞の集団間の細胞遊走データスキューをもたらすことができる。違いこれらのタイプは、おそらく部分的には、細胞 - 細胞の環境に対する細胞 - 基質の反射である。 画像を取得し、データ分析を実行するためにHCSシステムを使用して、複数のセルパラメータを評価するための効率的かつ迅速な手段を提供する。また、30の異なる条件（6基質と5種類のMSCのサブタイプ）のためのタイムラプスデジタルビデオは、日常的に環境室を使用しながら、時間から日間（48時間）の範囲の期間に取得した。このデータは、その後、別のECM上で種々の細胞株を横切る細胞の移動速度の差を計算し、決定するために使用された分子。 本報告書では、細胞の健康と機能を評価するために、高コンテンツスクリーニングプラットフォームの実装を強調している。このタイプの分析は、有向細胞成長および神経再生を促進するために、細胞型、ならびにポリマー基板を設計するための合理的な戦略を開発するために有用である。これは、細胞移植戦略を用いてインビボ前臨床研究における従来広範囲の治療因子の幹細胞ベースの送達の応用に向けて不可欠なステップである。

神経系障害の治療のために有用な治療法を実施するの主な問題は、さらに変性を防止し、また、機能の回復を促進する効果的な方法を開発することである。革新的な戦略は、移植前に神経保護因子の産生のために、遺伝子操作幹細胞のex vivoである。遺伝子治療のタイプと結合し、細胞ベースの治療法の組み合わせは、神経系の疾患または損傷誘発性神経細胞死の治療のための強力な方法を提供する。 神経栄養因子は、成熟した神経細胞の成長と発達ニューロンの生存だけでなく、メンテナンスや可塑性のために必須である。多くの研究は、中枢および末梢神経系（CNSおよびPNS）のニューロンの初期の成長および分化を促進する神経栄養因子の重要な役割を実証しており、それらはまた、 インビトロおよび内再生を刺激することができる神経損傷1のニマルモデル。脳由来神経栄養因子（BDNF）は、高度にCNSで発現され、神経発生、シナプス可塑性および修理2の調節に重要な役割を果たしている。グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）は、ドーパミン作動性及び運動ニューロン3を含む神経細胞の多くのタイプの生存を促進する。したがって、神経修復のための重要な戦略は、神経系の損傷したまたは罹患した領域に神経栄養因子の外因性の供給源を提供することにある。 多能性骨髄由来の間葉系幹細胞（MSC）は、損傷または罹患した神経系を治療するための治療用タンパク質の送達のための大きな可能性を保持する。彼らは、2）多能能力、3）少し倫理的な問題、4離およびメンテナンス1）相対的な容易さを含む多くの利点を有するので、MSCの移植は、患者の互換性の細胞ベースの治療法を開発するための努力に大きな注目を集めている）移植と自家移植の4,5のため5）潜在的な以下の生き残りと移行する機能。有望な結果は、脊髄損傷6,7、ストローク8,9、ミエリン欠損10、及び網膜変性11-13を含む様々な神経変性状態の数の動物モデルにおけるナイーブおよび遺伝子操作されたMSCの使用が報告されている。遺伝子操作された幹細胞からの神経栄養因子の送達と細胞移植を結合する新規かつ重要な神経修復のストラテジーである。 細胞ベースの治療因子の送達システムを開発する上で必須のステップでは、操作された細胞の正常な健康状態を決定することである。このように、本研究の主な目的は、遺伝子操作された成体幹細胞の一般的な成長パラメータを評価することであった。急速に複数のセルパラメータを評価するための重要なアプローチは、細胞の画像に基づくハイスループットscreeninを使用することであるG（HTS）、しばしば高いコンテンツスクリーニング（HCS）手順14と呼ばれる。この技術は、自動化された画像取得および解析を可能にし、このアプローチは、幹細胞研究用途に特に適している。本プロジェクトでは、HCSシステムを採用した遺伝子操作した成体幹細胞と細胞基質の好みや細胞機能の迅速な特性評価と最適化が可能プロファイリングプラットフォームを開発しました。

<table><tbody><tr><td>96 well plates</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>96 well plates selected for use in ImageXpress</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td><td>Abcam (Cambridge, MA)</td><td>Ab16667</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Collagen type I</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>C7661</td><td>Collagen from rat tail</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td><td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&amp;nbsp;</td><td>711-165-152</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>ECL(Entactin-Collagen-Laminin)</td><td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td><td>08-110</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Equine serum</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chemistry Store (Ames, IA)</td><td>12003510</td><td>100%, 200 proof</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>CB-40008</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>P285</td><td>For PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>P288</td><td>For PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Laminine (mouse)</td><td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice</td><td>Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)</td><td></td><td>Isolated from bone marrow</td></tr><tr><td>Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td><td>These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal donkey serum (NDS)</td><td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&amp;nbsp;</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>O4042</td><td>4% PFA in 0.1 M PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide (PI)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.05% (EDTA 1x)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>12440&amp;ndash;046</td><td></td></tr><tr><td>Hybridoma-qualified FBS</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Equine serum</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td><td>ImageXpress micro</td><td>High content screening system</td></tr><tr><td>MetaXpress 4.0</td><td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td><td>MetaXpress 4.0</td><td>Image acquisition and analysis software</td></tr></tbody></table>

high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

MSCの成長パラメータは、異なる基板上のMSCの異なる集団を培養することによって調べた。 MSCのサブタイプ（MSCは、GFP-MSCは、BDNF-GFP-MSCは、GDNF-GFP-MSCを、及びBDNF / GDNF-GFP-MSCの）5つの異なる集団は異なるでプレコーティングした96ウェル組織培養プレートに播種した図1に示すように、基板は、培養の4日後、プレートを固定し、免疫標識および/ ​​または適切な試薬を用いて染色した後、HCSシステムを用いて検査し、画像取得及び解析ソフトウェアプログラムを用いて行われた分析。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> 図1：実験計画のために96ウェルプレートテンプレート 96ウェルプレート、種々の基材、ウェルをコーティングしたテンプレートに示すように操作された幹細胞を播種した。は 。例として、唯一のwel行BFにおけるlsがこの実験に使用した。列A、GおよびHは空のままにした。略語 - MSCは：間葉系幹細胞; GFP-MSCは：緑色蛍光タンパク質を発現するMSCを。 BDNF-GFP-MSCの：脳由来神経栄養因子-GFPを発現するMSCを。 GDNF-GFP-MSCの。グリア細胞由来神経栄養因子-GFPを発現するMSCを。 BDNF / GDNF-GFP-MSCの。 BDNFおよびGDNF- GFP発現MSCを。 ECL：エンタクチンコラーゲンIV-ラミニン）。 DAPI対比続く抗Ki67の免疫標識は、異なる基板が操作されたMSC（ 図2A）の異なる集団の増殖に影響を与えたかどうかを評価するために使用した。のKi67抗原の発現は、細胞周期のG 1、S、G 2及びM後期段階の間に優先的に発生し、休止期にある細胞（G 0）が検出されなかったので、増殖15に対する細胞マーカーとして有用である。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）は、一般的に使用されるニューあるDNA 16の領域にに結合すると青色の蛍光を発する明確な染色体対比。フィールド内の細胞の総数は、DAPI染色された核の数を数えることによって決定することができる。 図2Bに示されるように増殖したMSCの割合のばらつきがあったが、全ての基板にもかかわらず、MSCサブタイプのそれぞれについて、かなりの細胞増殖を支持した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> 図2：Ki67の細胞増殖アッセイ。 Ki67の免疫標識の（A）合併、二重蛍光画像（赤）およびDAPI（青色）核染色。 MSCの多くは、Ki67抗体（赤）で免疫標識した。 Ki67についてのパーセンテージを示すスケールバー=50μmである。（B）棒グラフは、ポリスチレン（PS）、ポリ-L-リジン（PLL）、フィブロネクチン、コラーゲン上で増殖させたMSCのサブタイプを免疫標識私は、ラミニン、またはエンタクチン-コラーゲンIV-ラミニン、in vitroで 5日間（ECL）基質（DIV）を入力します。 Nは、一つの実験を=。各バーは、各条件のための2つのウェルから8画像化サイトから平均プールされたデータを表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ヨウ化プロピジウム（PI）染色は、異なる基質が細胞生存率（ 図3）の影響を受けるかどうかを評価するために使用した。ヨウ化プロピジウムは、一般的に使用される赤色蛍光核染色体の対比である。ヨウ化プロピジウムは、膜非透過性であり、一般的に、生細胞から排除され、したがって、集団中の死細胞を検出するのに有用である。フィールド内のすべてのセルを識別するようDAPIなどの一般的な核のラベルと組み合わされた場合、与えられた条件の中の死細胞の割合を決定することができる。 PI陽性細胞の割合は、（試験した全ての基板上に低かった図3）。 PI試薬の陽性対照として、MSCを含む、いくつかのウェルは、70％エタノール中で、図3B及び図3Cに示すように、PI標識細胞の高い割合をもたらし、ほとんどの細胞を死滅させることが知られている条件でインキュベートした（エタノール、正扱わコントロール）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> 図3：ヨウ化プロピジウムは、細胞死アッセイ。 （A）合併、ヨウ化プロピジウム（赤）およびDAPI（青）染色のための二重蛍光画像。生存細胞の全ての核をDAPI（青色）で染色されたが、全くヨウ化プロピジウム染色はMSCが検出されなかった。（B）実質的に全てのMSCは、70％エタノールに暴露した後、ヨウ化プロピジウムで染色した。 A中のスケールバー、B =100μmである。ヨウ化プロピジウム（PI）のパーセンテージを示す（C）棒グラフは、染色されたMSCのサブタイプポリスチレン（PS）、ポリ-L-リジン（PLL）、フィブロネクチン、 インビトロ （DIV） で 5日間コラーゲンタイプI、ラミニン、またはエンタクチン、コラーゲンIV、ラミニン（ECL）基板上に成長させた。■。エタノール制御：この状態は、PI染色試薬の陽性対照として役立った。 PI染色以下のエタノール処理を施しほとんどの細胞は死んでいるので、積極的にPI試薬について染色である。 Nは、一つの実験を=。各バーは、各条件のための2つのウェルから8画像化サイトから平均プールされたデータを表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 操作されたMSCの挙動に対する異なる基質の可能性のある影響を調べるために、細胞遊走は、（ 補足ビデオ1を参照）HCSシステムにタイムラプスデジタル顕微鏡および透過光/環境チャンバシステムを用いて分析した。複数のサイト/ウェルタイムラプスを画像化した画像取得及び解析ソフトウェアプログラムを使用して異なる基板上に成長したMSCの異なる亜集団のための細胞移動速度を計算するために使用される。 図4（c）に示すように、一般に、MSCの全てのサブタイプは、細胞外マトリックスでコーティングされた表面（フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンおよびECL）非コートポリスチレン表面上の最も遅い最速移動速度を示した。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> 図4：細胞追跡および移行 MSCは、画像収集及び分析ソフトウェアで追跡。 29時間後、タイムラプスイメージングセッションの終了時でのタイムラプスイメージング及び（B）の（A）は、開始からの透過光と蛍光画像のオーバーレイされた画像は、（ 補足ビデオ1を参照のこと）。細胞遊走トラック着色李によって示されのNE。スケールバー：ポリスチレン（PS）、ポリ-L-リジン（PLL）、フィブロネクチン、I型コラーゲン、ラミニン上で増殖させたMSCの亜型についての平均移動速度を示す50μmの（C）バーグラフ（ミクロン/時間で表される）、またはエンタクチン-コラーゲンIV-ラミニン、in vitroで 2日間（ECL）基質（DIV）。 Nは、一つの実験を=。各バーは、各条件のための2つのウェルから少なくとも10撮像されたセルの平均を表している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> まとめると、これらの結果は、遺伝子操作されたMSCのこれらの亜集団は、類似の増殖特性を表示するという予備的証拠を提供する。これらの結果は、これらのMSCの遺伝子改変を仲介するレンチウイルスは、このスクリーニングプラットフォームを用いて調べ成長パラメータには劇的な検出可能な有害な作用を誘発しないことを説得力のある証拠を提供する。 補足ビデオ画像取得と解析ソフトウェアプログラムを使用して、MSCの追跡の1。タイムラプスデジタルビデオ。 [1（緑のトラッキングライン）として示され、2（ブルートラッキングライン）] 2のMSCの移行パスのが示されている。ビデオは29時間の期間中に捕獲した。画像は5分ごとに捕獲された。 GFPを発現するMSCの蛍光画像は、ビデオの調製においてタイムラプスイメージングのために使用した。 =50μmのキャリブレーションバー。このタイプの分析は、細胞移動および細胞分裂を含む、細胞の挙動を研究するために有用である。

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High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

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Research

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Medicine

10.8K ビュー.  Iowa State University. This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

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Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

発生生物学

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

神経科学

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the mature Schwann cell fate. We subjected rat and human MSCs to transient hypoxic conditions (1% oxygen for 16 h) followed by expansion as neurospheres upon low-attachment substratum with epidermal growth factor (EGF)/basic fibroblast growth factor (bFGF) supplementation. Neurospheres were seeded onto poly-D-lysine/laminin-coated tissue culture plastic and cultured in a gliogenic cocktail containing &#946;-Heregulin, bFGF, and platelet-derived growth factor (PDGF) to generate Schwann cell-like cells (SCLCs). SCLCs were directed to fate commitment via coculture for 2 weeks with purified dorsal root ganglia (DRG) neurons obtained from E14-15 pregnant Sprague Dawley rats. Mature Schwann cells demonstrate persistence in S100&#946;/p75 expression and can form myelin segments. Cells generated in this manner have potential applications in autologous cell transplantation following spinal cord injury, as well as in disease modeling.

Marrow stromal cells (MSCs) with neural potential exist within the bone marrow. Our protocol enriches this population of cells via hypoxic preconditioning and thereafter directs them to become mature Schwann cells.

成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

マウスモデルにおける膠芽細胞腫に対する治療用幹細胞の鼻腔内送達

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

医学

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.

人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other therapeutic strategies, there is currently no cure available for the injured or diseased brain. Cell replacement appears as a promising therapeutic strategy for neurodegenerative conditions. To this day, neural stem cells (NSCs) have been successfully generated from fetal tissues, human embryonic cells (ES) or induced pluripotent stem cells (iPSC). A process of dedifferentiation was initiated by activation of the novel human GPI-linked glycoprotein, which leads to generation of pluripotent stem cells. These blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) differentiate in vitro into cells with a neural phenotype as shown by brightfield and immunofluorescence microscopy. Ultrastructural analysis of these cells by means of electron microscopy confirms their primitive structure as well as neuronal-like morphology and subcellular characteristics.

We present a genetically modified-free (GM-free) method to obtain cells with a neuronal phenotype from reprogrammed peripheral blood cells. Activation of a signaling pathway linked to novel human GPI-linked protein reveals an efficient GM-free method for obtaining human pluripotent stem cells.

血液由来神経細胞のGMフリー生成

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance between in vitro simplification and recreating the complex in vivo environment, along with the main aim, shared by all screening strategies, of obtaining robust and reliable data, highly predictive for in vivo translation.
In the field of demyelinating diseases, the majority of drug screening strategies are based on immortalized cell lines or pure cultures of isolated primary oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from newborn animals, leading to strong biases due to the lack of age-related differences and of any real pathological condition or complexity.
Here we show the setup of an in vitro system aimed at modeling the physiological differentiation/maturation of neural stem cell (NSC)-derived OPCs, easily manipulated to mimic pathological conditions typical of demyelinating diseases. Moreover, the method includes isolation from fetal and adult brains, giving a system which dynamically differentiates from OPCs to mature oligodendrocytes (OLs) in a spontaneous co-culture which also includes astrocytes. This model physiologically resembles the thyroid hormone-mediated myelination and myelin repair process, allowing the addition of pathological interferents which model disease mechanisms. We show how to mimic the two main components of demyelinating diseases (i.e., hypoxia/ischemia and inflammation), recreating their effect on developmental myelination and adult myelin repair and taking all the cell components of the system into account throughout, while focusing on differentiating OPCs.
This spontaneous mixed model, coupled with cell-based high-content screening technologies, allows the development of a robust and reliable drug screening system for therapeutic strategies aimed at combating the pathological processes involved in demyelination and at inducing remyelination.

We describe the production of mixed cultures of astrocytes and oligodendrocyte precursor cells derived from fetal or adult neural stem cells differentiating into mature oligodendrocytes, and in vitro modeling of noxious stimuli. The coupling with a cell-based high-content screening technique builds a reliable and robust drug screening system.

胎児および成人神経幹細胞由来オリゴデンドロビテ前駆細胞培養の高含有スクリーニング分化と成熟解析

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely impacts the study of cell type specific contributions to disease. Moreover, animal models usually do not reflect variability in mutations and disease courses seen in human patients. Reprogramming methods for generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized patient specific research and created valuable tools for studying disease mechanisms. However, iPSC technology has disadvantages such as time, labor commitment, clonal selectivity and loss of epigenetic markers. Recent modifications of these methods allow more direct generation of cell lineages or specific cell types, bypassing clonal isolation or a pluripotent stem cell state. We have developed a rapid direct conversion method to generate induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) from skin fibroblasts utilizing retroviral vectors in combination with neuralizing media. The iNPCs can be differentiated into neurons (iNs) oligodendrocytes (iOs) and astrocytes (iAs). iAs production facilitates rapid drug and disease mechanism testing as differentiation from iNPCs only takes 5 days. Moreover, iAs are easy to work with and are generated in pure populations at large numbers. We developed a highly reproducible co-culture assay using mouse GFP+ neurons and patient derived iAs to evaluate potential therapeutic strategies for numerous neurological and neurodegenerative disorders. Importantly, the iA assays are scalable to 384-well format facilitating the evaluation of multiple small molecules in one plate. This approach allows simultaneous therapeutic evaluation of multiple patient cell lines with diverse genetic background. Easy production and storage of iAs and capacity to screen multiple compounds in one assay renders this methodology adaptable for personalized medicine.

We describe a protocol to reprogram human skin-derived fibroblasts into induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs), and their subsequent differentiation into induced Astrocytes (iAs). This method leads to fast and reproducible generation of iNPCs and iAs in large quantities.

線維芽細胞からニューロン前駆細胞への直接変換とアストロサイトへの分化を用いた神経疾患のインビトロモデリング

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...