We wish to thank Peter Munro PhD for his assistance with optic nerve sectioning. This study was supported by the Medical Research Council (G0901303), and in part by the Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, the Helen Hamlyn Trust, Fight for Sight, and Moorfields special trustess,.

הצהרת אתיקה: כל הניסויים בבעלי החיים שנערכו בהתאם לועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC), ואושרו בהסכם עם הנחיות משרד פן בריטניה <a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">(http://goo.gl/FLkirW,</a> גישה 10 ביוני האחרון , 2014) והצהרת Arvo לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר Vision <a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">(http://goo.gl/4LFOjD,</a> הגישה האחרונה 10 ביוני, 2014). 1. Ocular Hypertension אינדוקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לגלאוקומה ניסיונית על ידי הרמת לחץ התוך עיני (IOP) באמצעות הזרקה חד-צדדית של microspheres פאראמגנטיים לתוך התא הקדמי של חולדות בראון נורבגיה, המבוסס על השיטה של et al Samsel. 3 חולדות פיגמנט אחרות עשויות להיות מתאימות, אם כי אלה היו צריכים להיות מאומתים ראשון על ידי המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקבת g 250-300 הביתחולדות לשעבר מגדל בראון נורבגיה במתמדת תאורה נמוכה סביבה (40-60 סוויטה דה לוקס) כדי למזער את התנודות יומי בלחץ התוך העיני 7, עם גישה כלרצונך מזון ומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקחת מידות IOP בסיסיות בבעלי חיים ער 8 לפני ההרדמה והזרקת חרוז, באמצעות tonometer ריבאונד מכויל לשימוש בעיני העכברוש 9. IOP הוא נלקח כממוצע של חמש קריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש חולדות עם 37.5 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין, ו0.25 מ&quot;ג / קילוגרם medetomidine hydrochloride נמסר intraperitoneally. לאשר עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקסים הרגל האחורית של החיה, לפני Povidone יישום יוד (ראה שלב 1.5), והזרקת חרוז (ראה שלב 1.8). לנהל 0.5% hydrochloride proparacaine לשיכוך כאבים. הערה: אל להרחיב את התלמיד בכל שלב. זה יעזור לי חרוזים להתיישב טובים יותר לזווית iridocorneal, ולמנוע מחייבים את העדשה. החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של קרנית בעין הנגדית המופעל un. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Wאפר עין האופרטיבית עם 5% יוד povidone במים 10 דקות 5 לפני הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות, פתיל יוד povidone את השימוש בגזה סטרילית, ולשטוף את העיניים עם 0.9% תמיסת מלח סטרילית. שמור את העיניים לחות במהלך הרדמה עם יישום רגיל של תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מגנט טבעתי סביב העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 25 μl של תמיסה המכילה 30 מ&quot;ג / מיליליטר של גמא-הקרנה מעוקרת 8 מיקרומטר microspheres המגנטי בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) ללשכה הקדמית, באמצעות מחט משופעת 33 G. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין חרוזים, לשטוף מחדש על ידי מתלים, אז צנטריפוגה 3 פעמים ב10,000 XG למשך 5 דקות עם 1 מיליליטר HBSS, לפני קבלת 30 מ&quot;ג / מיליליטר הפתרון הסופי. לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקה, להיות זהיר, כדי למנוע החדרת המחט לאיריס, כדי למזער את הסיכון של טראומת קשתית. זה ניתן למנוע על ידי orientating המחט משיקה למשטח קרני, כמקביל לאיריס ככל האפשר. זה גם יעזור לי כדי להקטין את איבוד חרוז מאתר ההזרקה. הערה: הזרק חרוזים בקצב מהיר כדי להבטיח חלוקה שווה סביב זווית iridocorneal, שהוא קריטי להעלאת לחץ תוך עיני. בנוסף, חרוזים חנות, מחטים וטבעות מגנטיות בנפרד, כך שהחרוזים לא יוצרים אשכולות, מה שהופך אותם קשה לטעון לתוך המזרק ולהזריק, והמחט אינה הופכת להיות ממוגנטת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המחט במקום 1 דקות לאחר הזרקה על מנת להבטיח כי חרוזים להתיישב לתוך זווית iridocorneal לעכב ניקוז המימי מmeshwork trabecular. מעט זווית המחט לאחר חרוזים יש בתחילה התיישבה כדי לאפשר זליגה מסוימת של מימית, כדי למזער את העלייה חולפת בלחץ התוך עיני. בסופו של הניתוח לשטוף את המחט דרך עם פוספט הראשון שנאגרו (PBS), ולאחר מכן 70% אתנול, ואחריו מים מזוקקים, על מנת להבטיח את משך שימוש במחט בהליכים נפרדים. לחלופין, אפשר להשתמש במחטים חד פעמיות אם שילוב מד והמזרק הנכון זמין. אופציונליות: מחטים עשויות להיות מחודדות באמצעות beveller להאריך את השימוש בם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה במידת צורך, להסיר את המגנט, ולהשתמש בו כדי לצייר חרוזים לתחומי כיסוי חלקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המגנט במקום סביב העין ללאחר הזרקה 10 דקות נוספת כדי להבטיח חרוזים להתיישב גם לזווית iridocorneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה הפוכה באמצעות 0.25 מ&quot;ג / קילוגרם hydrochloride atipemezole. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל כלורמפניקול, או משחה אנטיביוטית אחרת, למשל gentamycin או טרמיצין topically כדי למנוע זיהום, ושל 0.5% hydrochloride proparacaine לשיכוך כאבים. השאר בעלי חיים להתאושש על מחצלת חום עד שהן חוזרים לתנועה, ולאחר מכן להעביר לתיבה חמה ואספקה ​​עם תזונה נוספת, כגון תוסף מזון או דיאטה רגילה טבולה עד להחלמה מלאה. שיכוך כאבים מערכתיים או מקומיים יש לתת לבעלי חיים בו מוצגות סימנים של כאב 24 שעות לאחר ניתוח. אם thesסימפטומים דואר להתמיד למרות טיפול, בעלי החיים צריכים להיות שלוקטו בצורה אנושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעין הנגדית כשליטת unoperated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מדידות לחצו תוך עיניות כל 2-3 ימים לאחר מתן חרוז, וכל 2-3 ימים לאחר מכן באמצעות tonometer ריבאונד מכויל לשימוש בעיני העכברוש 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקריטריונים להכללת עיניים בלימודים יכולים להיות: אם 1) IOP מוגבה מעל הלחץ הנגדי על ידי שליטת 5 מ&quot;מ כספית, ו -2) לא יעלו על 60 מ&quot;מ כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיניים שבו חוזר לנקודת התחלת הלחץ (בדרך כלל על ידי לאחר הזרקת שבוע 1) לא צריך להיות כלולה בלימודים, אך זה אפשרי חרוזים מחדש להזריק בעיניים שאינם מצליחים לפתח גבוה IOP אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים על ידי CO 2 מחנק בסוף הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העיניים ועצבי ראייה, ולתקן בparaformaldehyde 4% (PFA) לילה לניתוח היסטולוגית נוסף. </li></ol> 2. הערכת נזק לרשתית Neuron שימוש TUNEL Staining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת תאים אפופטוטיים בהר שלם retinasuse assay dUTP ניק תיוג בתיווך transferase deoxynucleotidyl המסוף (TUNEL), על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הרשתית מכוס עין, לשטוף 3 x 5 דקות בשיעור של 0.3% Triton X-100 בפוספט שנאגרו מלוח (T-PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize הרקמה ב 3% T-PBS עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאזן רשתית באיזון הצפת למשך 10 דקות, לפני הדגירה בפתרון תגובת TUNEL עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה למשך 3 x 5 דקות בשיעור של 0.3% T-PBS, לשטוף בשיעור של 0.3% T-PBS המכיל 5 מיקרומטר DAPI, ושטוח הר בתקשורת הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת גרעינים חיוביים TUNEL להשתמש מיקרוסקופ confocal לקחת 10 מיקרומטר Z- ערימות דרך שכבת תא גנגליון בהגדלה 20X. קח 3 תמונות בכל אחד 4 עלי הכותרת, באתרים קרובים לעצב הראייה, באמצע הפריפריה-, ובפריפריה הרחוקה של הרשתית, נותן סך של 12 תמונות לכל mount, דגימה כ -7,000 תאים. קריטריונים מורפולוגיים מופלים שאינו עצבי (אנדותל וגליה) תאים מהתאים עצביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורי בחירה להדמיה באמצעות רק ערוץ DAPI, וחוקרי מסכה לקבוצות טיפול. </li></ol> 3. הערכת נזק לעצב הראייה באמצעות toluidine הכחול מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את עצבי ראייה הלילה בפתרון של Karnovsky ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את הדגימות עבור שעה 2 ב 1% (w / v) tetroxide אוסמיום ולאחר מכן ליבש באתנול 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עצבי ראייה בפרופילן אוקסיד למשך 30 דקות, ואת המקום בתערובת 50:50 של פרופילן אוקסיד: לילה araldite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את הפתרון הזה ל -100 araldite%, ואחריו דגירה הלילה בשעה 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטעי Cut semithin (0.75 מ&quot;מ עובי) וכתם עם toluidine 1% כחולים / בורקס (TB) ב 50% אתנול לפני הבדיקה על ידי מיקרוסקופ אור. </li></ol> 4. ניתוח סטטיסטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ana הסטטיסטיlyses באמצעות חבילת תוכנת סטטיסטיקה מתאימה. דו כיוונית ANOVA עם מבחן פוסט הוק-של ניומן-קאול ניתן להשתמש כדי לחשב מובהקות סטטיסטיות לIOP משתנה על פני זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערך p של פחות מ 0.05 עשוי להיחשב משמעותי. </li></ol>

<ol>
	<li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020.">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li><li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma:+a+review.">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li><li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres.">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li><li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+glaucoma+in+DBA/2J+mice:+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration.">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li><li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat.">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li><li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats.">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li><li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat.">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li><li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats.">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li><li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer.">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li><li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+application+of+povidone-iodine.">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li><li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage.">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li><li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma.">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li></ol>

David T. Shima is an employee of Hofmann-La Roche, Switzerland. The remaining authors declare they have no competing financial interests.

כאן אנו מדגימים שיטה לגרימת IOP הגבוה בחולדה, על ידי הזרקת microspheres המגנטי לתוך התא הקדמי של העין. שיטה זו היא פשוטה לביצוע, ודורשת מומחיות כירורגית קטנה, או שעות של תרגול ועידון. יתר על כן, ההליך הוא אפקטיבי; לעתים רחוקות דורש יותר מאשר זריקה אחת של חרוזים כדי לגרום לעלייה חזקה, חזקה בלחץ (reinjection שיעור של כ -10%). זה עשוי לספק יתרון על פני שיטות מושרה קיימות, כגון וריד episceral המאתגר מבחינה טכנית טרשת נפוצה מודל 11, או פרוטוקול photocoagulation לייזר 6, אשר יכול לדרוש הליכים מרובים כדי לשמור העלו IOP. על מנת שהשיטה כדי להצליח עם זאת, יש כמה קריטי צעדים קטנים שיש לנקוט. ראשית כדאי להשתמש במגנט בצורה טבעתי לצייר חרוזים לזווית iridocorneal. צעד זה הוא שינוי של הפרוטוקול המקורי, wherדואר חרוזים הוזרקו לתוך התא הקדמי, ולאחר מכן עברו ביד חופשית סביב העין 3. באמצעות מגנט טבעתי אומר שmicrospheres צריך להתיישב באופן שווה סביב הזווית, הדורש חלוקה מחדש ידנית מינימאלית. שנית, שיעור ההזרקה צריך להיות מהיר - איטי מדי והחרוזים בעיקר יצטברו בצד אחד של הזווית, שהובילו לכיסוי חלקי, ובאופן פוטנציאלי אין עלייה בלחץ. באופן כללי אם כי, השיטה היא פשוטה מספיק שהמשתמש יכול בקלות לבצע שינויים בפרוטוקול, כגון שינוי הגודל או הנפח של חלקיקי microsphere, אולי כדי לנסות לשנות את מידת גובה IOP. עם זאת, חסרון פוטנציאלי אחד של השיטה הוא שיש אחד מעט שליטה על היקף יתר לחץ דם, אשר בכ 5-10% מהמקרים שצפינו עלה מעל 60 מ&quot;מ כספית. עלייה מוגזמת בIOP יכולה להיות מאוד הרסנית לרקמת רשתית, ועלולה להפוך את חקר המנגנונים ויומשעמם של מוות של תאים מאתגרים. עם זאת, השיטה מייצרת פתולוגיה עצבית עקבית, הן בעצב הרשתית ואופטי, שניתן להשפיע פרמקולוגית 12. זה עלול להפוך את המודל אטרקטיבי לפיתוח תרופות חדשניות לטיפול בגלאוקומה. בנוסף, מאחר שהחרוזים מופנים לזווית iridocorneal, זה משאיר חזותי הציר חופשי להדמית חיה של דיסק הרשתית או אופטי. אנו צופים כי מודל זה יותאם ומשמש ליישומים עתידיים במינים אחרים, כוללים עכבר.

גלאוקומה ראשונית היא מחלה הרסנית עין משפיעה על 60.5 מיליון אנשים מוערכים ברחבי העולם 1, מה שעלול להוביל לאובדן ראיית חי שינוי ועיוורון 2. מחקר על מנגנוני המחלה, ופיתוח תרופות חדשניות לגלאוקומה, תלויים בדגמים טובים של המחלה אשר לשחזר כמה מסימני ההיכר של פתולוגיה. אנו מציגים כאן מודל גלאוקומה עכברוש על פי השיטה של et al Samsel. 3 המטרה הכוללת של שיטה זו היא להגביר את לחץ התוך עיני (IOP) בעיניים על ידי הזרקת microspheres המגנטי ללשכה הקדמית, ומשתמש בטבעת מגנטית, ישיר אותם לזווית iridocorneal. זה פוגע ביצוא ימי, אשר מגדיל את לחץ התוך עיני, שהוביל לניזק עצבי ואובדן תא. הפרוטוקול פותח כדי לנסות לספק מודל פשוט, מושרה של גלאוקומה. פרוטוקול זה יכול להיות כמה יתרונותעל טכניקות קיימות. מודלים עכבר גנטיים כגון DBA / י 2 זמינים, שאינו דורשים הליכים ליזום; עם זאת אלה עשויים להיות תחילתה צפויה של התקדמות המחלה 4. בניגוד לכך, מודלים מושרה, שרובם מסתמכים על ניתוח הרמת IOP במכרסמים, יש את היתרון שייזום יכול להיות נשלט על ידי המשתמש. חלק מהשיטות הללו יכול להיות חסרונות משלהם לעומת זאת, כולל להיות מאתגרים מבחינה טכנית 5, ויכול לדרוש הליכים מרובים כדי לשמור על לחץ תוך עיני מוגבר 6. בניגוד לכך, השיטה מושרה המפורטת בכתב היד הזה היא טכניקה פשוטה, יעילה, ושחזור שמייצרת עליות יציבים, חזקות בלחץ, עם צורך מינימאלי לreinjection. בנוסף, הוא אינו כרוך בציוד יקר, ורק דורש מיומנויות כירורגיות בסיסיות לביצוע. פרוטוקול זה יכול להיות מתאים לקוראים שמחפשים להגדיר פחות תובעני מבחינה טכנית מושרהמודל גלאוקומה במעבדה שלהם.

<table><tbody><tr><td>250 - 300g female Brown Norway ex-breeder rats</td><td>Harlan UK</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Tonolab Rebound Tonometer</td><td>Tiolat</td><td>TV02</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (ketamine)</td><td>Fort Dodge Animal health</td><td>BN1000118</td><td>37.5 mg/kg</td></tr><tr><td>Domitor (medetomidine hydrochloride)</td><td>Orion Pharma</td><td>140-999</td><td>0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>Povidone iodine</td><td>Ecolab</td><td>BN4369LE10</td><td>5% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Minim&#039;s Saline Solution</td><td>Bausch and Lomb</td><td>PL00033/5017</td><td></td></tr><tr><td>Toroidal magnet</td><td>Supermagnete</td><td>R-10-07-03-N</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Microspheres</td><td>Bangs Laboratories</td><td>UMC4N/9692</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>33 G beveled needle</td><td>Hamilton</td><td>7747-01</td><td>Custom needle</td></tr><tr><td>Luer tip syringe</td><td>Hamilton</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan (atipemezole hydrochloride )</td><td>Orion Pharma</td><td>141-003</td><td>0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>Chloramphenicol ointment</td><td>Medicom</td><td>18956-0005</td><td></td></tr><tr><td>TUNEL staining kit</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

הזרקה של חרוזים מגנטיים לזווית iridocorneal מושרה באופן עקבי עלייה ממושכת ויציבה בלחץ (איור 1), שהייתה לצפות בקלות בנקודת הזמן הראשונה, 3 ימים לאחר ההזרקה. יתר על כן, העלייה בלחץ נשמרה לאורך תקופת הניסוי, ועל אף שכמובן הזמן שלנו סיימו בגיל 18 ימים לאחר הזרקה, אחרים דיווחו כי לחץ נמשך לטווח ארוך 3. IOP הממוצע בממוצע לכל אורכו של הניסוי לשליטה, עיניים הזריקו-לא-חרוז הייתה 19.7 ± 0.3 מ&quot;מ כספית, לעומת 40.5 ± 2.8 מ&quot;מ כספית לעיניים-הזריק חרוז (P &lt;0.001). בנוסף, שיא לחץ תוך עיני מוגבר מ22.8 ± 0.3 מ&quot;מ כספית ל49.9 ± 2.3 מ&quot;מ כספית. כדי לקבוע אם ההעלאה בIOP מובילה למוות של תאי הגנגליון ברשתית, ביצענו צביעת TUNEL על רשתית, והיסטולוגיה על סעיפי עצב ראייה רוחביים (איור 2). ברשתית<html> צפינו עלייה בצביעת TUNEL (איור 2 א) בעיניים מוזרק חרוז עם IOP הגבוה. מספר הגרעינים אפופטוטיים עלה כ -15 מתקפלים, מ -1.6 ± 0.5 תאים בבקרה הנגדית, ל24.5 ± 0.5 תאים ברשתית עם יתר לחץ דם (איור 2; P &lt;0.05). יתר על כן, בעיניים שבחרוזים מגנטיים הוזרקו אבל לחץ לא גדל (כנראה עקב חסימה חלקית של זווית iridocorneal), מספרם של תאי TUNEL חיוביים לא היו שונה באופן משמעותי מאלה של בקרות uninjected (P&gt; 0.05). הדבר מצביע על כך המוות של תאים היה קשור לעלייה בלחץ, לא בשל רעילות ישירה של microspheres המגנטי. לבסוף, חקרנו פתולוגיה עצב ראייה במודל הגלאוקומה, וראיתי הצטברות של toluidine כחול ברבים מהאקסונים, המצביעים על ניוון של תהליכים אלה סלולריים (איור 2 ג). &quot;Src =&quot; יור 1 &quot;/&gt; / קבצים / ftp_upload / 52,400 / 52400fig1highres.jpg איור 1. העלאת לחץ התוך עיני באמצעות microspheres המגנטי. הזרקה של microspheres המגנטי ללשכה הקדמית מושרה עלייה חזקה, משמעותית בלחץ התוך עיני (IOP) בהשוואה לשליטה הנגדית, עיניים-מוזרק אינם. יחידות ציר Y = מילימטר כספית (ממ&quot;כ). = נתונים ממוצע ± SEM. * = P &lt;0.001; = 12. דמות N זה שונה מFoxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1,379-1,390. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" /> איור 2. העלאת IOP על ידי הזרקה של microspheres המגנטי לזווית iridocorneal, הנגרמת מוות עצבי בשכבת תא גנגליון (GCL). (א) נציג תמונות של רשתית משליטה (משמאל) וגלאוקומה (מימין) העיניים מוכתמות לגרעינים אפופטוטיים ידי TUNEL (ירוק;חצים לבנים) וDAPI (כחול), המציינים את מספר הגרעינים אפופטוטיים מוגבר כIOP עלה. (ב) כימות של תאים חיוביים TUNEL בGCL, מראים כי עיניים עם IOP הגבוה (באמצע), היו תאים באופן משמעותי יותר אפופטוטיים בהשוואה ל שליטה (משמאל). בניגוד לכך, בעיניים מוזרק חרוז שבו לחץ לא עלה (מימין), ללא גידול משמעותי בהכתמת TUNEL נצפה. = נתונים ממוצע ± SEM. * = P &lt;0.05; N = 7 - 8 (ג) נציג תמונות של צביעת עצב ראייה, דגי עלייה בהצטברות כחולה toluidine (חיצים שחורים) באקסונים פגועים מהגלאוקומה (מימין), אבל עיניים לא שולטות (משמאל).. ברים סולם = 50 מיקרומטר. נתון זה שונה מאל Foxton et., Am. J. Pathol 182 (4):. 1,379-1,390.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres at JoVE.com

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

ניסוי הגלאוקומה נגרמת על ידי הזרקת Ocular של מיקרוסכמות מגנטית

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

experimental-glaucoma-induced-ocular-injection-magnetic

Research

JoVE Journal

Medicine

17.1K Views.  University College London Institute of Ophthalmology. We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Video: Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

מודל עכבר לייזר המושרה של לחץ תוך עיני מוגבר כרוני לאפיון פגמים חזותיים

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

בהדמית vivo של יושרה סיבי עצב הראייה על ידי contrast-enhanced MRI בעכברים

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Neuroscience

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

לחסימה Microbead מגנטי דגם כדי לגרום Ocular Hypertension-Dependent גלאוקומה עכברים

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em&gt; In vivo</em&gt; מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

דגם של גלאוקומה המושרה על ידי תפרים Circumlimbal אצל חולדות ועכברים

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

A Reversible Silicon Oil-Induced Ocular Hypertension Model in Mice

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing stable IOP elevation in mice that mimics the post-operative complication of using silicone oil (SO) as a tamponade agent in human vitreoretinal surgery. In this protocol, SO is injected into the anterior chamber of the mouse eye to block the pupil and prevent inflow of aqueous humor. The posterior chamber accumulates aqueous humor and this in turn increases the IOP of the posterior segment. A single SO injection produces reliable, sufficient, and stable IOP elevation, which induces significant glaucomatous neurodegeneration. This model is a true replicate of secondary glaucoma in the eye clinic. To further mimic the clinical setting, SO can be removed from the anterior chamber to reopen the drainage pathway and allow inflow of aqueous humor, which is drained through the trabecular meshwork (TM) at the angle of the anterior chamber. Because IOP quickly returns to normal, the model can be used to test the effect of lowering IOP on glaucomatous retinal ganglion cells. This method is straightforward, does not require special equipment or repeat procedures, closely simulates clinical situations, and may be applicable to diverse animal species. However, minor modifications may be required.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse eyes by intracameral injection of silicone oil and the procedure for silicone oil removal from the anterior chamber to return elevated intraocular pressure to normal.

סיליקון הפיך שמן המושרה מודל יתר לחץ דם בעכברים

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

Source: Gossman, C. A. et al. <a href="https://app.jove.com/v/53831">Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm&#39;s canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

טכניקת הזרקת מי מלח היפרטוניים לגרימת גלאוקומה בחולדות

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction In a Mouse Model

Source: Bunker, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52400">Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized rat undergoes an ocular procedure where magnetic beads are injected into the anterior chamber under a magnetic field to block the iridocorneal angle. This blockage obstructs the trabecular meshwork, preventing aqueous humor drainage and leading to increased intraocular pressure, damaging the retinal ganglion cells and optic nerve. This develops a glaucoma-like condition.

Source: Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized ...

Neurodegenerative Diseases

Inducing Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction with Magnetic Beads

After anesthetizing the rats, apply ocular ointment to the unoperated contralateral eye to keep it moist during anesthesia. Apply 0.5% pro procaine hydrochloride local anesthetic to the operative eye. Next, wash this eye with 5% povidone iodine in water. After 5 minutes, wick off the povidone iodine and wash the eye with 0.9% sterile saline solution.
Keep the eye moist during anesthesia with regular application of sterile saline. Now, place a toroidal magnet around the eye. To minimize the risk of iris trauma and minimize bead loss, orient the needle tangential to the corneal surface as parallel to the iris as possible. Proceed to inject 25 microliters of 30 milligrams per millimeter gamma irradiated magnetic microspheres into the anterior chamber.
Leave the needle in place for one minute post-injection, to ensure that beads settle into the iridocorneal angle to impede aqueous drainage from the trabecular meshwork. Slightly angle the needle a few seconds after the beads have initially settled to allow some leakage of aqueous, and to minimize transient increases in intraocular pressure.
To ensure continued use of the needle in separate procedures, flush the needle with PBS, then 70% ethanol, followed by distilled water. At this stage, if necessary, remove the magnet and use it to draw beads into areas of incomplete coverage. Leave the magnet in place around the eye for a further 10 minutes post-injection, to ensure beads settle well into the iridocorneal angle.