We wish to thank Peter Munro PhD for his assistance with optic nerve sectioning. This study was supported by the Medical Research Council (G0901303), and in part by the Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, the Helen Hamlyn Trust, Fight for Sight, and Moorfields special trustess,.

Etica dichiarazione: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC), e sono stati approvati in accordo con le linee guida Regno Unito home office ( <a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">http://goo.gl/FLkirW</a> , ultimo accesso il 10 giugno , 2014) e la Dichiarazione ARVO per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research ( <a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">http://goo.gl/4LFOjD</a> , ultimo accesso il 10 giugno 2014). 1. ipertensione oculare Induzione <ol><li> Indurre glaucoma sperimentale elevando la pressione intraoculare (IOP) tramite iniezione unilaterale di microsfere paramagnetici nella camera anteriore di Brown Norvegia ratti, basata sul metodo di Samsel et al. 3 Altri ratti pigmentati possono essere adatti, anche se questi dovrebbero essere convalidata primo dall&#39;utente. </li><li> Casa 250-300 g femminileex-allevatore Brown Norvegia ratti in un ambiente di scarsa illuminazione costante (40-60 lux) per ridurre al minimo le fluttuazioni diurne in IOP 7, con l&#39;accesso a cibo e acqua ad libitum. </li><li> Prendere le misure IOP di base in animali svegli 8 prima anestesia e iniezione tallone, utilizzando un tonometro rimbalzo tarato per l&#39;uso negli occhi di ratto 9. IOP è preso come media di cinque letture. </li><li> Anaesthetize ratti con 37,5 mg / kg di ketamina, e 0,25 mg / kg medetomidina cloridrato consegnato per via intraperitoneale. Confermare profondità dell&#39;anestesia testando i riflessi del piede posteriore dell&#39;animale, prima dell&#39;applicazione di iodio povidone (vedi punto 1.5), e l&#39;iniezione tallone (vedi punto 1.8). Amministrare 0.5% proparacaina cloridrato per l&#39;analgesia. NOTA: Non dilatare la pupilla, in ogni fase. Questo aiuterà le perline per stabilirsi meglio nel dell&#39;angolo iridocorneale, e prevenire vincolante alla lente. Applicare pomata oculare contro l&#39;essiccamento della cornea su un-operato occhio controlaterale. </li><li> Wcenere l&#39;occhio operativa con 5% povidone iodio in acqua 10 5 min prima dell&#39;iniezione. </li><li> Dopo 5 minuti, stoppino lo iodio povidone off con garza sterile, e lavare l&#39;occhio con soluzione salina sterile allo 0,9%. Mantenere l&#39;occhio umido durante l&#39;anestesia con l&#39;applicazione regolare di soluzione salina sterile. </li><li> Posizionare un magnete toroidale intorno all&#39;occhio. </li><li> Iniettare 25 ml di una soluzione contenente 30 mg / ml di gamma-irradiazione sterilizzato 8 micron microsfere magnetiche in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) nella camera anteriore, utilizzando un ago smussato 33 G. <ol><li> Per preparare perline, lavare da ri-sospensione, poi centrifugazione 3 volte a 10.000 xg per 5 minuti con 1 ml HBSS, prima di fare la 30 mg / ml soluzione definitiva. Mantenere condizioni di sterilità in tutto. </li><li> Per l&#39;iniezione, fare attenzione ad evitare di inserire l&#39;ago l&#39;iride, per ridurre al minimo il rischio di traumi iris. Ciò può essere evitato orientando l&#39;ago tangente alla superficie corneale, come paralleladell&#39;iride possibile. Questo aiuterà anche a ridurre al minimo la perdita di tallone dal sito di iniezione. NOTA: Iniettare perle a un ritmo rapido per garantire una distribuzione uniforme intorno all&#39;angolo iridocorneale, che è fondamentale per aumentare IOP. Inoltre, negozio perline, aghi e anelli magnetici separatamente in modo che le perle non formano i cluster, che li rende difficili da caricare nella siringa e iniettare, e l&#39;ago non diventa magnetizzato. </li></ol></li><li> Lasciare l&#39;ago in posizione per 1 minuto dopo l&#39;iniezione al fine di garantire che le microsfere sistemazione in angolo iridocorneale impedire il drenaggio acquosa dal trabecolato. Leggermente angolo l&#39;ago dopo le perline hanno inizialmente risolto per consentire alcune perdite di acquosa, per ridurre al minimo aumenti transitori IOP. Al termine dell&#39;intervento lavare l&#39;ago attraverso con il primo tampone fosfato salino (PBS), poi 70% di etanolo, seguita da acqua distillata, per garantire l&#39;uso continuato dell&#39;ago in procedure separate. In alternativa, si potrebbe utilizzareaghi monouso se la combinazione calibro e la siringa corretta è disponibile. Optional: aghi possono essere affilano con una beveller per prolungare il loro utilizzo. </li><li> A questo punto, se necessario, rimuovere il magnete, e usarlo per disegnare perle in aree di copertura incompleta. </li><li> Lasciare il magnete in posizione intorno all&#39;occhio per altri 10 min dopo l&#39;iniezione per assicurare perline stabilirsi bene nel dell&#39;angolo iridocorneale. </li><li> Anestesia Reverse con 0,25 mg / kg atipemezole cloridrato. </li><li> Amministrare cloramfenicolo, o altro pomata antibiotica, per esempio gentamicina o terramycin topica per prevenire l&#39;infezione, e lo 0,5% proparacaina cloridrato per l&#39;analgesia. Lasciare gli animali a recuperare su una stuoia di calore fino a ritrovare il movimento, poi il trasferimento ad una scatola caldo e fornitura con alimentazione supplementare, come un integratore alimentare o dieta regolare inumidito fino al recupero è completo. Analgesia sistemica o locale deve essere somministrato agli animali che presentano segni di dolore 24 ore dopo l&#39;intervento chirurgico. Se These sintomi persistono nonostante il trattamento, gli animali devono essere abbattuti in modo umano. </li><li> Utilizzare l&#39;occhio controlaterale come controllo non operato. </li><li> Prendere le misure IOP ogni 2-3 giorni dopo la somministrazione tallone, e ogni 2-3 giorni successivi con un tonometro rimbalzo tarato per l&#39;uso negli occhi di ratto 9. </li><li> I criteri per l&#39;inclusione occhi a studi possono essere: se 1) la IOP è elevata al di sopra della pressione di controllo controlaterale di 5 mmHg, e 2) non superiore a 60 mmHg. </li><li> Occhi dove la pressione torna a basale (di solito da 1 settimana dopo l&#39;iniezione) non devono essere inclusi negli studi, tuttavia è possibile re-iniettare perline in occhi che non riescono a sviluppare l&#39;alta pressione intraoculare, se desiderato. </li><li> Euthanize animali di CO 2 asfissia alla fine dell&#39;esperimento. </li><li> Sezionare occhi e nervi ottici, e fissare nel 4% paraformaldeide (PFA) durante la notte per ulteriori analisi istologica. </li></ol> 2. Valutare danni alla retina Neuron Uso TUNEL STaining <ol><li> Per quantificare cellule apoptotiche in tutto il monte retinasuse test deossinucleotidil terminale transferasi-mediata dUTP nick-etichettatura (TUNEL), secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Sezionare la retina dalla oculare, lavare per 3 x 5 min in 0,3% Triton X-100 in tampone fosfato (PBS-T). </li><li> Permeabilize il tessuto in 3% T-PBS per 2 ore. </li><li> Pre-equilibrare retine in Equilibration tampone per 10 minuti, prima di incubazione in soluzione di reazione TUNEL per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Lavare il tessuto da 3 x 5 min a 0,3% T-PBS, sciacquare in 0.3% T-PBS contenente 5 micron DAPI, e TV a montare in supporti di montaggio. </li><li> Per quantificare TUNEL nuclei positivi utilizzano un microscopio confocale a prendere 10 micron z-stack attraverso lo strato di cellule gangliari a 20X di ingrandimento. Prendere 3 immagini su ciascuno dei 4 petali, in siti vicino al nervo ottico, in media periferia, e alla periferia lontano della retina, dando un totale di 12 immagini per tutta mount, il campionamento di circa 7.000 cellule. Criteri morfologici discriminati cellule non neuronali (endoteliale e gliali) dalle cellule neuronali. </li><li> Selezionare le aree per l&#39;imaging utilizzando solo il canale DAPI, e gli investigatori maschera di gruppi di trattamento. </li></ol> 3. Valutare danno del nervo ottico Utilizzando Toluidine Blu colorazione <ol><li> Fissare nervi ottici durante la notte in soluzione di Karnovsky a 4 ° C. </li><li> Trattare campioni per 2 ore a 1% (w / v) di osmio tetrossido e poi disidratato in 100% di etanolo. </li><li> Incubare nervi ottici in ossido di propilene per 30 min, e posizionare in una miscela 50:50 di ossido di propilene: overnight araldite. </li><li> Cambiare questa soluzione a 100% araldite, seguita da incubazione per una notte a 60 ° C. </li><li> Cut semisottile sezioni (0,75 millimetri di spessore) e macchia con l&#39;1% di toluidina blu / di borace (TB) in etanolo al 50% prima di esame al microscopio ottico. </li></ol> 4. Analisi statistica <ol><li> Eseguire ana statistichelisa utilizzando un apposito software di statistiche. Un ANOVA a due vie con test post-hoc di Newman-Keul può essere utilizzata per calcolare la significatività statistica per IOP cambia nel tempo. </li><li> Un valore p inferiore a 0,05 può essere considerato significativo. </li></ol>

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	<li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020.">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li><li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma:+a+review.">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li><li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres.">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li><li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+glaucoma+in+DBA/2J+mice:+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration.">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li><li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat.">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li><li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats.">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li><li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat.">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li><li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats.">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li><li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer.">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li><li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+application+of+povidone-iodine.">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li><li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage.">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li><li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma.">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li></ol>

David T. Shima is an employee of Hofmann-La Roche, Switzerland. The remaining authors declare they have no competing financial interests.

Qui mostriamo un metodo per indurre elevata IOP nel ratto, iniettando microsfere magnetiche nella camera anteriore dell&#39;occhio. Questo metodo è semplice da portare a termine, e richiede poca perizia chirurgica, o ore di pratica e raffinatezza. Inoltre, il procedimento è efficace; raramente richiede più di una singola iniezione di perline di indurre una forte, robusto aumento della pressione (circa il 10% tasso di reiniezione). Questo può fornire un vantaggio rispetto ai metodi inducibili esistenti, come la vena episceral tecnicamente impegnativo sclerosi 11 modelli, o laser protocollo fotocoagulazione 6, che può richiedere più procedure da mantenere sollevate IOP. Affinché il metodo per avere successo tuttavia, ci sono alcuni piccoli passi critici che devono essere prese. In primo luogo, è utile utilizzare un magnete a forma toroidale per disegnare perline in angolazione iridocorneale. Questo passo è una modifica del protocollo originale, where le perline sono state iniettate nella camera anteriore, e poi spostati a mano libera intorno all&#39;occhio 3. Utilizzando un magnete toroidale significa che microsfere dovrebbero risolvere in modo uniforme in tutto l&#39;angolo, richiedendo il minimo redistribuzione manuale. In secondo luogo, il tasso di iniezione deve essere veloce - troppo lento e le perline si accumula prevalentemente su un lato dell&#39;angolo, con conseguente copertura incompleta e potenzialmente nessun aumento di pressione. In generale però, il metodo è abbastanza semplice che l&#39;utente potrebbe facilmente apportare modifiche al protocollo, ad esempio variando la dimensione o volume delle particelle di microsfere, forse per tentare di alterare il grado di elevazione IOP. Tuttavia, uno svantaggio potenziale del metodo è che si ha poco controllo sulla misura della ipertensione, che in circa 5-10% dei casi osservati salito sopra 60 mmHg. Aumenti eccessivi di IOP può essere molto distruttivo per tessuto retinico, e può rendere lo studio dei meccanismi e biologia di morte cellulare sfidare. Tuttavia, il metodo produce una patologia neuronale consistente, sia nella retina e nervo ottico, che può essere manipolato farmacologicamente 12. Questo può rendere il modello interessante per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento del glaucoma. Inoltre, poiché le perle sono diretti in angolo iridocorneale, questo lascia l&#39;asse visivo gratuito per l&#39;imaging dal vivo del disco retina o ottico. Prevediamo che questo modello sarà adattato e utilizzato per applicazioni future in altre specie, tra cui mouse.

Glaucoma primario è una malattia degli occhi devastante che colpisce circa 60,5 milioni di persone in tutto il mondo 1, che può portare alla perdita della vista vita che alterano e cecità 2. La ricerca sui meccanismi della malattia, e lo sviluppo di nuove terapie per il glaucoma, dipendono buoni modelli della malattia che ricapitolano alcune delle caratteristiche della patologia. Presentiamo qui un modello di ratto glaucoma basato sul metodo di Samsel et al. 3 L&#39;obiettivo generale di questa tecnica è quello di aumentare la pressione intraoculare (IOP) nell&#39;occhio iniettando microsfere magnetiche nella camera anteriore, e utilizzando un anello magnetico, diretta li in angolo iridocorneale. Questo impedisce deflusso acquosa, che aumenta IOP, con conseguente danno neuronale e perdita di cellule. Il protocollo è stato sviluppato per tentare di fornire un semplice modello inducibile del glaucoma. Questo protocollo può avere alcuni vantaggirispetto alle tecniche esistenti. Modelli genetici come topi DBA / 2J sono disponibili, che non richiedono procedure di avvio; tuttavia questi possono avere un esordio imprevedibile di progressione della malattia 4. Al contrario, i modelli inducibili, molti dei quali si basano su chirurgicamente elevando IOP nei roditori, hanno il vantaggio che l&#39;iniziazione può essere controllata dall&#39;utilizzatore. Alcuni di questi metodi possono avere inconvenienti della loro tuttavia, compreso tecnicamente impegnativo 5, e possono richiedere più procedure per mantenere elevata IOP 6. Al contrario, il metodo inducibile descritto in questo manoscritto è una tecnica semplice, efficace e riproducibile che produce stabili, robusti aumenti di pressione, con minima necessità di reiniezione. Inoltre, esso non comporta attrezzature costose, e richiede solo abilità chirurgiche di base per eseguire. Questo protocollo può essere appropriato per i lettori che stanno cercando di creare una inducibile tecnicamente meno impegnativaModello glaucoma nel loro laboratorio.

<table><tbody><tr><td>250 - 300g female Brown Norway ex-breeder rats</td><td>Harlan UK</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Tonolab Rebound Tonometer</td><td>Tiolat</td><td>TV02</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (ketamine)</td><td>Fort Dodge Animal health</td><td>BN1000118</td><td>37.5 mg/kg</td></tr><tr><td>Domitor (medetomidine hydrochloride)</td><td>Orion Pharma</td><td>140-999</td><td>0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>Povidone iodine</td><td>Ecolab</td><td>BN4369LE10</td><td>5% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Minim&#039;s Saline Solution</td><td>Bausch and Lomb</td><td>PL00033/5017</td><td></td></tr><tr><td>Toroidal magnet</td><td>Supermagnete</td><td>R-10-07-03-N</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Microspheres</td><td>Bangs Laboratories</td><td>UMC4N/9692</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>33 G beveled needle</td><td>Hamilton</td><td>7747-01</td><td>Custom needle</td></tr><tr><td>Luer tip syringe</td><td>Hamilton</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan (atipemezole hydrochloride )</td><td>Orion Pharma</td><td>141-003</td><td>0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>Chloramphenicol ointment</td><td>Medicom</td><td>18956-0005</td><td></td></tr><tr><td>TUNEL staining kit</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

Iniezione di perline magnetiche nel angolo iridocorneale costantemente indotto un aumento prolungato e robusto in pressione (figura 1), che era facilmente osservabile al primo punto temporale, 3 giorni dopo l&#39;iniezione. Inoltre, l&#39;aumento della pressione è stata mantenuta per tutta la durata dell&#39;esperimento, e sebbene il nostro corso tempo finito a 18 giorni dopo l&#39;iniezione, altri hanno riportato che la pressione persiste a lungo termine 3. La media IOP media sulla lunghezza della esperimento di controllo, occhi non-bead-iniettati era 19,7 ± 0,3 mmHg, rispetto a 40,5 ± 2,8 mmHg per occhi branello-iniettato (P &lt;0.001). Inoltre, picco IOP è aumentato da 22.8 ± 0.3 mmHg a 49,9 ± 2,3 mmHg. Per determinare se l&#39;elevazione della PIO porta alla morte delle cellule gangliari retiniche, abbiamo effettuato TUNEL sulla retina, e istologia su sezioni trasversali del nervo ottico (Figura 2). In retina<html> abbiamo osservato un aumento della colorazione TUNEL (Figura 2A) in occhi tallone-iniettata con elevata pressione intraoculare. Il numero di nuclei apoptotici aumentato di circa 15 volte, da 1,6 ± 0,5 cellule nei controlli controlaterali, a 24,5 ± 0,5 cellule retine ipertesi (Figura 2B; P &lt;0.05). Inoltre, negli occhi in cui biglie magnetiche sono state iniettate ma pressione non è aumentato (probabilmente a causa del blocco incompleta dell&#39;angolo iridocorneale), il numero di cellule TUNEL-positivi non erano significativamente differenti da quelli dei controlli uninjected (P&gt; 0,05). Questo suggerisce che la morte cellulare era legato a pressione aumenta, non causa tossicità diretta delle microsfere magnetiche. Infine, abbiamo studiato la patologia del nervo ottico nel modello glaucoma, e visto accumulo di blu di toluidina in molti degli assoni, indicando la degenerazione di questi processi cellulari (Figura 2C). ure 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. aumento della pressione intraoculare con microsfere magnetiche. Iniezione di microsfere magnetiche nella camera anteriore indotto un robusto, significativo aumento della pressione intraoculare (IOP) in confronto al controllo controlaterale, occhi non iniettati. Unità asse Y = millimetri di mercurio (mmHg). Dati = media ± SEM. * = P &lt;0.001; N = 12. Questo dato è stato modificato da Foxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" /> Figura 2. Elevazione della IOP tramite iniezione di microsfere magnetiche in angolo iridocorneale, indotta morte neuronale nello strato di cellule gangliari (GCL). (A) Immagini rappresentative della retine di controllo (a sinistra) e glaucoma (a destra) gli occhi macchiati di nuclei apoptotici da TUNEL (verde;frecce bianche) e DAPI (blu), che indica il numero di nuclei apoptotici aumentato rosa IOP. (B) Quantificazione delle cellule positive TUNEL in GCL, mostrando che gli occhi con elevata IOP (al centro), avevano cellule significativamente più apoptotici rispetto a (a sinistra). Al contrario, negli occhi perline-iniettata in cui la pressione non ha aumento (a destra), è stato osservato alcun aumento significativo TUNEL colorazione. Dati = media ± SEM. * = P &lt;0.05; N = 7 - 8 (C) Immagini rappresentative della colorazione ottico nervo, dimostrando un aumento toluidina blu accumulo (frecce nere) in assoni danneggiati da glaucoma (a destra), ma non il controllo occhi (a sinistra).. Bar scale = 50 micron. Questa cifra è stata modificata da Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

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Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Experimental Glaucoma indotta da iniezione oculare di microsfere magnetiche

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.1K Views.  University College London Institute of Ophthalmology. We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Video: Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Un modello di topo indotta da laser di cronica ipertensione oculare per caratterizzare difetti visivi

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

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In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

In vivo imaging di Optic Nerve Fiber Integrity by MRI Contrast-Enhanced nei topi

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Neuroscienze

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

Un magnetica microperla occlusione modello per indurre ipertensione oculare-Dependent Glaucoma nei topi

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma inducono Procedura in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di ratto e tutto il montaggio Retina Preparazione

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

A Reversible Silicon Oil-Induced Ocular Hypertension Model in Mice

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing stable IOP elevation in mice that mimics the post-operative complication of using silicone oil (SO) as a tamponade agent in human vitreoretinal surgery. In this protocol, SO is injected into the anterior chamber of the mouse eye to block the pupil and prevent inflow of aqueous humor. The posterior chamber accumulates aqueous humor and this in turn increases the IOP of the posterior segment. A single SO injection produces reliable, sufficient, and stable IOP elevation, which induces significant glaucomatous neurodegeneration. This model is a true replicate of secondary glaucoma in the eye clinic. To further mimic the clinical setting, SO can be removed from the anterior chamber to reopen the drainage pathway and allow inflow of aqueous humor, which is drained through the trabecular meshwork (TM) at the angle of the anterior chamber. Because IOP quickly returns to normal, the model can be used to test the effect of lowering IOP on glaucomatous retinal ganglion cells. This method is straightforward, does not require special equipment or repeat procedures, closely simulates clinical situations, and may be applicable to diverse animal species. However, minor modifications may be required.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse eyes by intracameral injection of silicone oil and the procedure for silicone oil removal from the anterior chamber to return elevated intraocular pressure to normal.

Un modello di ipertensione oculare indotta da olio di silicone reversibile nei topi

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

Source: Gossman, C. A. et al. <a href="https://app.jove.com/v/53831">Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm&#39;s canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

Una tecnica di iniezione di soluzione salina ipertonica per indurre il glaucoma nei ratti

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction In a Mouse Model

Source: Bunker, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52400">Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized rat undergoes an ocular procedure where magnetic beads are injected into the anterior chamber under a magnetic field to block the iridocorneal angle. This blockage obstructs the trabecular meshwork, preventing aqueous humor drainage and leading to increased intraocular pressure, damaging the retinal ganglion cells and optic nerve. This develops a glaucoma-like condition.

Source: Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized ...

Neurodegenerative Diseases

Inducing Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction with Magnetic Beads

After anesthetizing the rats, apply ocular ointment to the unoperated contralateral eye to keep it moist during anesthesia. Apply 0.5% pro procaine hydrochloride local anesthetic to the operative eye. Next, wash this eye with 5% povidone iodine in water. After 5 minutes, wick off the povidone iodine and wash the eye with 0.9% sterile saline solution.
Keep the eye moist during anesthesia with regular application of sterile saline. Now, place a toroidal magnet around the eye. To minimize the risk of iris trauma and minimize bead loss, orient the needle tangential to the corneal surface as parallel to the iris as possible. Proceed to inject 25 microliters of 30 milligrams per millimeter gamma irradiated magnetic microspheres into the anterior chamber.
Leave the needle in place for one minute post-injection, to ensure that beads settle into the iridocorneal angle to impede aqueous drainage from the trabecular meshwork. Slightly angle the needle a few seconds after the beads have initially settled to allow some leakage of aqueous, and to minimize transient increases in intraocular pressure.
To ensure continued use of the needle in separate procedures, flush the needle with PBS, then 70% ethanol, followed by distilled water. At this stage, if necessary, remove the magnet and use it to draw beads into areas of incomplete coverage. Leave the magnet in place around the eye for a further 10 minutes post-injection, to ensure beads settle well into the iridocorneal angle.