We wish to thank Peter Munro PhD for his assistance with optic nerve sectioning. This study was supported by the Medical Research Council (G0901303), and in part by the Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, the Helen Hamlyn Trust, Fight for Sight, and Moorfields special trustess,.

Declaración de Ética: Todos los experimentos con animales se han realizado de acuerdo con el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC), y fueron aprobados de acuerdo con las directrices del Reino Unido Home Office ( <a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">http://goo.gl/FLkirW</a> , consultado el pasado 10 de junio , 2014) y la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research ( <a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">http://goo.gl/4LFOjD</a> , consultado el pasado 10 de junio, 2014). 1. Hipertensión Ocular Inducción <ol><li> Inducir glaucoma experimental mediante la elevación de la presión intraocular (PIO) a través de la inyección unilateral de microesferas paramagnéticas en la cámara anterior de las ratas Brown Norway, basado en el método de Samsel et al. 3 Otros ratas pigmentadas pueden ser adecuados, aunque éstos tendrían que ser validado primero por el usuario. </li><li> Casa 250-300 g femeninoratas ex criador Brown Norway en un ambiente con poca luz constante (40-60 lux) para minimizar las fluctuaciones diurnas de la PIO 7, con el acceso a alimentos y agua ad libitum. </li><li> Tomar mediciones de la PIO de línea base en animales despiertos 8 antes de la anestesia y la inyección del grano, usando un tonómetro de rebote calibrada para su uso en el ojo de rata 9. IOP se toma como la media de cinco lecturas. </li><li> Anestesiar ratas con 37,5 mg / kg de ketamina, y 0,25 mg / kg de medetomidina clorhidrato entregado por vía intraperitoneal. Confirmar profundidad de la anestesia mediante el ensayo reflejos del pie trasero de animales, antes de la aplicación povidona yodo (véase el paso 1.5), y la inyección de talón (véase el paso 1.8). Administrar 0,5% de clorhidrato de proparacaína para la analgesia. NOTA: No dilatar la pupila en cualquier etapa. Esto ayudará a que las perlas se asientan mejor en el ángulo iridocorneal, y evitar la unión a la lente. Aplique una pomada ocular para prevenir la sequedad de la córnea en el ojo contralateral no operado. </li><li> Wcenizas del ojo operativa con 5% de yodo povidona en agua 10 5 min antes de la inyección. </li><li> Después de 5 min, Wick la povidona yodada fuera usando una gasa estéril, y lavar el ojo con solución salina estéril al 0,9%. Mantenga el ojo húmedo durante la anestesia con la aplicación regular de solución salina estéril. </li><li> Coloque un imán toroidal alrededor del ojo. </li><li> Inyectar 25 l de una solución que contiene 30 mg / ml de irradiación gamma esterilizado 8 micras microesferas magnéticas en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en la cámara anterior, utilizando una aguja biselada 33 G. <ol><li> Para preparar perlas, lavar por la re-suspensión, centrifugando a continuación 3 veces a 10.000 xg durante 5 min con 1 ml de HBSS, antes de hacer el / ml solución 30 mg final. Mantener condiciones estériles en todo. </li><li> Para la inyección, tener cuidado de evitar la inserción de la aguja para el iris, para minimizar el riesgo de trauma iris. Esto se puede prevenir orientando la aguja tangencial a la superficie de la córnea, como paralelo ael iris como sea posible. Esto también ayudará a minimizar la pérdida de talón desde el sitio de inyección. NOTA: Inyectar cuentas a un ritmo rápido para asegurar una distribución uniforme en todo el ángulo iridocorneal, que es fundamental para elevar la PIO. Además, los granos de tiendas, agujas y anillos magnéticos por separado de modo que las perlas no forman agrupaciones, haciéndolos difíciles de cargar en la jeringa e inyectar, y la aguja no se magnetizan. </li></ol></li><li> Deje la aguja en su lugar durante 1 min después de la inyección para asegurar que los granos se depositan en el ángulo iridocorneal para impedir el drenaje acuoso de la malla trabecular. Ligeramente ángulo de la aguja después de las cuentas se han establecido inicialmente para permitir cierta fuga de acuoso, para minimizar los aumentos transitorios de la presión intraocular. Al final de la cirugía limpiar la aguja a través con la primera salina tamponada con fosfato (PBS), luego etanol al 70%, seguido de agua destilada, para asegurar el uso continuado de la aguja en procedimientos separados. Alternativamente, se podría usaragujas desechables si la combinación correcta de calibre y una jeringa está disponible. Opcional: agujas pueden ser afiladas utilizando un beveller para prolongar su uso. </li><li> En esta etapa, si es necesario, retire el imán, y lo utilizan para sacar cuentas en áreas de cobertura incompleta. </li><li> Deje el imán en su lugar alrededor de los ojos para un 10 minutos después de la inyección de más para garantizar los granos se asientan bien en el ángulo iridocorneal. </li><li> Anestesia inversa utilizando 0,25 mg / kg atipemezole clorhidrato. </li><li> Administrar cloranfenicol, u otro ungüento antibiótico, por ejemplo gentamicina o terramicina por vía tópica para prevenir la infección, y 0,5% de clorhidrato de proparacaína para la analgesia. Deje a los animales para recuperar en una estera de calor hasta que recuperar el movimiento, a continuación, transferir a una caja caliente y de suministro con la nutrición adicional, tal como un suplemento alimenticio o dieta regular humedecido hasta que la recuperación es completa. Analgesia sistémica o local se debe dar a los animales que presenten signos de dolor de 24 horas después de la cirugía. Si thessíntomas e persisten a pesar del tratamiento, los animales deben ser sacrificados humanitariamente. </li><li> Utilice el ojo contralateral como control no operado. </li><li> Tomar mediciones de la PIO cada 2-3 días después de la administración de perlas, y cada 2-3 días a partir de entonces utilizando un tonómetro de rebote calibrada para su uso en el ojo de la rata 9. </li><li> Los criterios para la inclusión de los ojos en los estudios pueden ser: si 1) la PIO se eleva por encima de la presión de control contralateral por 5 mmHg, y 2) no excederá de 60 mmHg. </li><li> Ojos, donde la presión vuelve a la línea de base (generalmente por 1 semana después de la inyección) no deben ser incluidos en los estudios, sin embargo, es posible volver a inyectar los granos en los ojos que no logran desarrollar una PIO elevada si se desea. </li><li> La eutanasia a los animales por asfixia de CO 2 al final del experimento. </li><li> Diseccionar los ojos y los nervios ópticos, y fijar en el 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche para su posterior análisis histológico. </li></ol> 2. Evaluación de la retina Neurona daños Usando TUNEL STaining <ol><li> Para cuantificar las células apoptóticas en todo el montaje retinasuse el ensayo de deoxinucleotidil transferasa terminal mediada por dUTP nick-etiquetado (TUNEL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Diseccionar la retina de la copa para el ojo, para lavar 3 x 5 min en 0,3% de Triton X-100 en tampón fosfato salino (PBS-T). </li><li> Permeabilizar el tejido en 3% T-PBS durante 2 hr. </li><li> Pre-equilibrar retinas en tampón de equilibrio durante 10 min, antes de la incubación en solución de reacción TUNEL durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lave el tejido durante 3 x 5 min en 0,3% T-PBS, enjuague en 0,3% T-PBS que contenía 5 mM DAPI y montaje plana en los medios de montaje. </li><li> Para cuantificar los núcleos TUNEL positivas utilizan un microscopio confocal de tomar 10 micras z-pilas a través de la capa de células ganglionares de 20 aumentos. Tomar 3 imágenes en cada uno de los 4 pétalos, en sitios cercanos al nervio óptico, en la periferia media, y en la lejana periferia de la retina, dando un total de 12 imágenes por toda mount, el muestreo de aproximadamente 7.000 células. Criterios morfológicos discriminados células no neuronales (endotelial y glial) de las células neuronales. </li><li> Seleccione las áreas de imagen utilizando sólo el canal DAPI, y los investigadores de la máscara a los grupos de tratamiento. </li></ol> 3. La evaluación de daño del nervio óptico Usando azul de toluidina tinción <ol><li> Fijar nervios ópticos durante la noche en solución de Karnovsky a 4 ° C. </li><li> Tratar las muestras durante 2 horas en 1% (w / v) de tetróxido de osmio y luego deshidratar en etanol al 100%. </li><li> Incubar nervios ópticos en óxido de propileno durante 30 minutos, y el lugar en una mezcla 50:50 de óxido de propileno: durante la noche araldite. </li><li> Cambie esta solución a 100% araldite, seguido de incubación durante la noche a 60 ° C. </li><li> Cortar semifinas secciones (0,75 mm de espesor) y mancha con 1% de azul de toluidina / bórax (TB) en etanol al 50% antes del examen con el microscopio óptico. </li></ol> 4. Análisis estadístico <ol><li> Realizar ana estadísticalyses usando un paquete de software estadístico apropiado. Un ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Newman-Keul se puede utilizar para calcular la significación estadística para la PIO cambia con el tiempo. </li><li> Un valor de p menor de 0.05 puede ser considerado significativo. </li></ol>

<ol>
	<li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020.">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li><li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma:+a+review.">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li><li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres.">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li><li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+glaucoma+in+DBA/2J+mice:+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration.">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li><li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat.">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li><li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats.">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li><li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat.">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li><li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats.">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li><li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer.">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li><li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+application+of+povidone-iodine.">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li><li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage.">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li><li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma.">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li></ol>

David T. Shima is an employee of Hofmann-La Roche, Switzerland. The remaining authors declare they have no competing financial interests.

Aquí se demuestra un método para inducir la PIO elevada en la rata, mediante la inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior del ojo. Este método es fácil de llevar a cabo, y requiere poca experiencia quirúrgica, o las horas de práctica y refinamiento. Además, el procedimiento es eficaz; rara vez se requiere más que una sola inyección de perlas para inducir una fuerte subida, robusto en presión (aproximadamente el 10% de tasa de reinyección). Esto puede proporcionar una ventaja sobre los métodos inducibles existentes, como la vena episceral técnicamente difícil esclerosis 11 modelo, o protocolo de la fotocoagulación con láser 6, que puede requerir múltiples procedimientos para mantener planteadas PIO. Para que el método para tener éxito sin embargo, hay algunos pequeños pasos críticos que necesitan ser tomadas. En primer lugar, es útil utilizar un imán de forma toroidal para dibujar perlas en el ángulo iridocorneal. Este paso es una modificación del protocolo original, where las perlas se inyectan en la cámara anterior, y luego se trasladó a mano alzada alrededor del ojo 3. Usando un imán toroidal significa que las microesferas deben instalarse de manera uniforme en todo el ángulo, lo que requiere la redistribución manual mínima. En segundo lugar, la tasa de inyección debe ser rápido - demasiado lento y las perlas se acumulará predominantemente en un lado del ángulo, dando lugar a una cobertura incompleta, y potencialmente no aumento de presión. En términos generales, sin embargo, el método es lo suficientemente sencillo que el usuario podría fácilmente hacer modificaciones en el protocolo, tales como variando el tamaño o el volumen de las partículas de microesferas, tal vez para intentar alterar el grado de la elevación de la PIO. Sin embargo, un inconveniente potencial del método es que uno tiene poco control sobre la extensión de la hipertensión, que en aproximadamente el 5-10% de los casos se observó subió por encima de 60 mmHg. Alzas excesivas en la PIO puede ser muy destructivo para los tejidos de la retina, y pueden hacer que el estudio de los mecanismos y biología de la muerte celular desafiante. Sin embargo, el método produce una patología neuronal consistente, tanto en la retina y del nervio óptico, que puede ser manipulado farmacológicamente 12. Esto puede hacer que el modelo atractivo para el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento del glaucoma. Además, debido a que las perlas se dirigen en el ángulo iridocorneal, esto deja el eje visual libre para imágenes en vivo de la retina o de disco óptico. Anticipamos que este modelo será adaptado y utilizado para futuras aplicaciones en otras especies, incluyendo ratón.

El glaucoma primario es una enfermedad ocular devastadora que afecta a aproximadamente 60,5 millones de personas en todo el mundo 1, que puede conducir a la pérdida de la visión que altera la vida y la ceguera 2. La investigación sobre los mecanismos de la enfermedad, y el desarrollo de nuevas terapias para el glaucoma, dependen de buenos modelos de la enfermedad que recapitulan algunas de las señas de identidad de la patología. Presentamos aquí un modelo de glaucoma de rata basado en el método de Samsel et al. 3 El objetivo general de esta técnica es aumentar la presión intraocular (IOP) en el ojo mediante la inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior, y el uso de un anillo magnético, directa ellos en el ángulo iridocorneal. Esto impide el flujo del humor acuoso, lo que aumenta la PIO, que conduce a daño neuronal y pérdida de células. El protocolo se desarrolló para intentar proporcionar un modelo más simple, inducible de glaucoma. Este protocolo puede tener algunas ventajassobre las técnicas existentes. Modelos genéticos de ratón como el DBA / 2J están disponibles, que no requieren procedimientos para iniciar; sin embargo, estos pueden tener un inicio impredecible de progresión de la enfermedad 4. En contraste, los modelos inducibles, la mayoría de las cuales dependen de la elevación de la PIO quirúrgicamente en roedores, tienen la ventaja de que la iniciación se puede controlar por el usuario. Algunos de estos métodos pueden tener inconvenientes de su propio sin embargo, incluyendo ser técnicamente desafiante 5, y puede requerir múltiples procedimientos para mantener la PIO elevada 6. En contraste, el método inducible se detalla en este manuscrito es una técnica sencilla, eficaz y reproducible que produce estables, fuertes incrementos en la presión, con una necesidad mínima de reinyección. Además, no se trata de un equipo costoso, y sólo requiere de habilidades quirúrgicas básicas para llevar a cabo. Este protocolo puede ser apropiado para los lectores que buscan establecer un inducible técnicamente menos exigentemodelo de glaucoma en su laboratorio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:324px;">250-300g female Brown Norway ex-breeder rats</td>
			<td style="width:175px;">Harlan UK</td>
			<td style="width:119px;">203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Tonolab Rebound Tonometer</td>
			<td style="width:175px;">Tiolat</td>
			<td style="width:119px;">TV02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:324px;">Ketaset (Ketamine)</td>
			<td style="width:175px;">Fort Dodge Animal health</td>
			<td>BN1000118</td>
			<td>37.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Domitor (medetomidine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Orion Pharma</td>
			<td style="width:119px;">140-999</td>
			<td>0.25 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Povidone iodine</td>
			<td style="width:175px;">Ecolab</td>
			<td>BN4369LE10</td>
			<td>5% in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Minim&#39;s Saline Solution</td>
			<td style="width:175px;">Bausch and Lomb</td>
			<td>PL00033/5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Toroidal magnet</td>
			<td style="width:175px;">Supermagnete</td>
			<td>R-10-07-03-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Magnetic Microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Bangs Laboratories</td>
			<td>UMC4N/9692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">HBSS</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">33-guage bevelled needle</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td>7747-01</td>
			<td>Custom needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Luer tip syringe</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Antisedan (atipemezole hydrochloride )</td>
			<td style="width:175px;">Orion Pharma</td>
			<td style="width:119px;">141-003</td>
			<td>0.25 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Chloramphenicol ointment</td>
			<td style="width:175px;">Medicom</td>
			<td>18956-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">TUNEL staining kit</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G3250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Vectashield Mounting Media</td>
			<td style="width:175px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

La inyección de perlas magnéticas en el ángulo iridocorneal indujo consistentemente un aumento prolongado y robusto de la presión (Figura 1), que fue fácilmente observable en el primer punto de tiempo, 3 días después de la inyección. Además, el aumento de la presión se mantuvo durante toda la duración del experimento, y aunque nuestro curso de tiempo terminó a los 18 días después de la inyección, otros han informado de que la presión persiste a largo plazo 3. La PIO media promediada sobre la longitud total del experimento de control, los ojos inyectados de no-grano fue de 19,7 ± 0,3 mmHg, en comparación con 40,5 ± 2,8 mmHg para los ojos de perlas con inyección (P &lt;0,001). Además, el pico IOP aumentó de 22,8 ± 0,3 mmHg a 49,9 ± 2,3 mmHg. Para determinar si la elevación de la PIO conduce a la muerte de las células ganglionares de la retina, se realizó la tinción de TUNEL en retinas, y la histología en secciones transversales del nervio óptico (Figura 2). En la retina<html> se observó un aumento en la tinción de TUNEL (Figura 2A) en los ojos de talón-inyectados con PIO elevada. El número de núcleos apoptóticos aumentó aproximadamente 15 veces, de 1,6 ± 0,5 células en los controles contralaterales, a 24,5 ± 0,5 células en retinas hipertensos (Figura 2B; p &lt;0,05). Además, en ojos en los que se inyectaron perlas magnéticas pero la presión no aumentaron (probablemente debido a la obstrucción incompleta del ángulo iridocorneal), el número de células TUNEL positivas no fueron significativamente diferentes de los de los controles no inyectados (P&gt; 0,05). Esto sugiere que la muerte celular se relacionó con la presión aumenta, no debido a la toxicidad directa de las microesferas magnéticas. Finalmente, se investigó la patología del nervio óptico en el modelo de glaucoma, y vimos acumulación de azul de toluidina en muchos de los axones, lo que indica la degeneración de estos procesos celulares (Figura 2C). Ure 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Elevación de la presión intraocular utilizando microesferas magnéticas. La inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior indujo un aumento robusto, significativa en la presión intraocular (IOP) en comparación con el control contralateral, los ojos no inyectados. Unidades del eje Y = milímetros de mercurio (mmHg). Datos = media ± SEM. * = P &lt;0,001; N = 12. Esta cifra se ha modificado desde Foxton y otros, Am.. . J. Pathol 182 (4): 1379-1390. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" /> Figura 2. La elevación de la PIO mediante la inyección de microesferas magnéticas en el ángulo iridocorneal, inducida por la muerte neuronal en la capa de células ganglionares (GCL). (A) Imágenes representativas de retinas de control (izquierda) y glaucoma (derecha) ojos teñidos para núcleos apoptóticos por TUNEL (verde;flechas blancas) y DAPI (azul), indicando el número de núcleos apoptóticos aumentó a medida que aumentó la PIO. (B) Cuantificación de las células TUNEL positivas en la GCL, que muestran que los ojos con PIO elevada (en el centro), tenían significativamente más células apoptóticas en comparación con control (izquierda). En contraste, en los ojos de talón inyectado donde la presión no se levantó (derecha), no se observó ningún aumento significativo en la tinción de TUNEL. Datos = media ± SEM. * = P &lt;0,05; N = 7-8 (C) Imágenes representativas de tinción nervio óptico, lo que demuestra un aumento en la acumulación de azul de toluidina (flechas negras) en los axones dañados por el glaucoma (derecha), pero no tiene control ojos (izquierda).. Las barras de escala = 50 m. Esta cifra ha sido modificado desde Foxton et al., Am. . J. Pathol 182 (4): 1379-1390.

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Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Experimental glaucoma inducido por inyección ocular de microesferas magnéticas

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.9K vistas.  University College London Institute of Ophthalmology. We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Video: Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

Generación de microesferas de alginato para aplicaciones biomédicas

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Investigación

Medicina

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Un modelo de ratón inducida por láser de la hipertensión ocular crónica a Caracterizar los defectos visibles

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Desprendimiento de Retina modelo en roedores por inyección subretiniana de Hialuronato de Sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

Evaluación no invasiva de la cardiaca Anomalías en la miocarditis autoinmune experimental por Resonancia Magnética de imágenes de microscopía en el ratón

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

A Magnetic Microbead Oclusión Modelo para inducir hipertensión ocular dependiente de glaucoma en ratones

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to microperimetry (MY) in eyes affected by dry Age-related Macular Degeneration (AMD) over time through the production and secretion of growth factors (GFs) on surrounding tissue. Patients were randomly assigned to each study group. All patients were diagnosed with dry AMD and with BCVA equal to or greater than 1 logarithm of the minimum angle of resolution (logMAR). A suprachoroidal autologous graft by Limoli Retinal Restoration Technique (LRRT) was carried out on group A, which included 11 eyes from 11 patients. The technique was performed by implanting adipocytes, adipose-derived stem cells obtained from the stromal vascular fraction, and platelets from platelet-rich plasma in the suprachoroidal space. Conversely, group B, including 14 eyes of 14 patients, was used as a control group. For each patient, diagnosis was verified by confocal scanning laser ophthalmoscope and spectral domain-optical coherence tomography (SD-OCT). In group A, BCVA improved by 0.581 to 0.504 at 90 days and to 0.376 logMAR at 180 days (+32.20%) postoperatively. Furthermore, MY test increased by 11.44 dB to 12.59 dB at 180 days. The different cell types grafted behind the choroid were able to ensure constant GF secretion in the choroidal flow. Consequently, the results indicate that visual acuity (VA) in the grafted group can increase more than in the control group after six months.

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

The goal of this study is to assess whether the suprachoroidal graft of adipose-derived stem cells included in the stromal vascular fraction and platelets derived from platelet-rich plasma by the Limoli Retinal Restoration Technique can improve visual acuity and retinal sensitivity responses in eyes affected by dry age-related macular degeneration.

Terapia regenerativa por autoinjerto Suprachoroidal célula en Degeneración Macular seca relacionada con la edad: informe preliminar en Vivo

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased prevalence due to the rise of sedentary lifestyles and unhealthy eating habits. Thanks to animal models, basic research can investigate the mechanisms underlying pathological processes such as MetS. Here, we describe the methods used to develop an experimental rabbit model of diet-induced MetS and its assessment. After a period of acclimation, animals are fed a high-fat (10% hydrogenated coconut oil and 5% lard), high-sucrose (15% sucrose dissolved in water) diet for 28 weeks. During this period, several experimental procedures were performed to evaluate the different components of MetS: morphological and blood pressure measurements, glucose tolerance determination, and the analysis of several plasma markers. At the end of the experimental period, animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia with low HDL, high LDL, and an increase of triglyceride (TG) levels, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model allows new perspectives for understanding the underlying mechanisms in the progression of the disease, the detection of preclinical and clinical markers that allow the identification of patients at risk, or even the testing of new therapeutic approaches for the treatment of this complex pathology.

We describe methods to develop an experimental model of diet-induced metabolic syndrome (MetS) in rabbits using a high-fat, high-sucrose diet. Animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model will allow acquisition of knowledge underlying mechanisms of disease progression.

Un modelo Experimental del síndrome metabólico inducido por la dieta de conejo: consideraciones metodológicas, desarrollo y evaluación

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Un modelo de Glaucoma inducido por sutura de Circumlimbal en ratas y ratones

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for quality of life and health care costs. The lack of informative animal models that recapitulate its key features impedes the search for new therapeutic agents for DED. Available DED animal models have limited reproducibility and efficacy. A model is presented here in which DED is induced by injecting the mitogen concanavalin A (Con A) into the orbital lacrimal glands of rabbits. Innovative aspects of this model are the use of ultrasound (US) guidance to ensure optimal and reproducible injection of Con A into the inferior lacrimal gland; injection of Con A into all orbital lacrimal glands that limits compensatory production of tears; and use of periodic repeat injections of Con A that prolong the state of DED at will. DED and its response to test agents are monitored with a panel of parameters that assess tear production, the stability of the tear film, and the status of the corneal and conjunctival mucosa. They include tear osmolarity, tear break-up time, Schirmer&#39;s tear test, rose bengal staining, and tear lactoferrin levels. The induction of DED and the monitoring of its parameters are described in detail. This model is simple, robust, reproducible, and informative. This animal model is suitable for the study of tear physiology and of the pathophysiology of DED as well as for the assessment of the efficacy and safety of candidate agents for the treatment of DED.

This article describes the development of a method to induce acute or chronic dry eye disease in rabbits by injecting concanavalin A to all portions of the orbital lacrimal gland system. This method, superior to those already reported, generates a reproducible, stable model of dry eye suitable for the study of pharmacological agents.

Un modelo de conejo de enfermedad ocular seca acuosa-deficiente inducida por la inyección de Concanavalin A en las glándulas lagrimales: Aplicación a estudios de eficacia de fármacos

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...