עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר והמרכז הלאומי לקידום מדעי Translational, המכונים לאומי לבריאות, דרך גרנט UL1TR000124 (לFW); פליקס ומילדרד ייפ נתרמו Professorship וקרן משפחת בארנס (לDTWW), המכון הלאומי למחקר דנטלי וCraniofacial של המכון הלאומי לבריאות במספר פרס T90DE022734 (לMT). התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

1. הפקת Exosome מבוססת חרוז מגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פתרון מעורב היטב של 5 μl של microparticles המגנטי מצופה streptavidin לμl 495 של חיץ פוספט שנאגרו מלוח (PBS) בצינור microcentrifuge כדי resuspend את החרוזים. לשטוף וresuspend החרוזים עם 500 μl של PBS שלוש פעמים באמצעות מתלה מגנטית. המדף הוא מערך של מגנטים בצד של יחידת דיור שיכול להחזיק את צינורות microcentrifuge המדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שטיפה, בואו ראשון הצינורות לשבת על מדף דקות 1, ולאחר מכן להשתמש קצה פיפטה כדי להסיר את חיץ supernatant בזהירות מבלי להפריע חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על מדף רגיל ללא מגנטים בצד. הוסף 500 μl של PBS לתוך הצינורות, ולהשתמש בפיפטה לערבב את הפתרון וחרוזים יחד. ואז לשים את הצינורות בחזרה על המדף המגנטי להפריד שוב את החרוזים מהפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הסר זו של חיץ באמצעות מגנוט וresuspension בPBSסך הכל שלוש פעמים. זה מבצע שטיפה ראשונית של החלקיקים המגנטיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חרוזים לμl 490 של חיץ PBS, עם הצינור שהונח על החלק הלא-ממוגנט של המתלה המגנטית. Pipet 5 μl של נוגדן CD63 אנטי אנושי בעכבר biotinylated ב1.0 מ&quot;ג / מיליליטר ריכוז המניה לתוך התערובת של חרוזים. השתמש פיפטה לערבב חרוזים ונוגדן בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות microcentrifuge עם חרוז ותערובת נוגדני biotinylated על הכתף מדגם. הגדר את הפרמטרים המסובבים למסובבי מדגם לסיבוב גומלין ב 90 מעלות הטיה במשך 5 שניות ורוטטות בשעה 5 מעלות לשנייה 1. סובב את צינורות תערובת מדגם-חרוז בפרמטרים אלה למשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדן מאוגד לאחר הצמידה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות 30 דקות של סיבוב ב RT, למקם את הצינורות בחזרה במעמד המגנטי במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שלושה שוטף של חרוזים על ידי הסרת השלב הנוזלי באמצעות micropipette ולשטוף עם 500 μ; L של PBS. לאחר לשטוף המשולש, resuspend את החרוזים ב490 μl של קזאין-PBS ומניחים על חלק unmagnetized של המתלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילוץ Exosome באמצעות חרוזים מצופים נוגדן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל כל צינור עם זיהוי מדגם ממוקד. פיפטה מדגם 10 μl של סרום או רוק לתוך צינור microcentrifuge. השתמש פיפטה לערבב מדגם וחרוזים מגנטיים על ידי pipetting מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות עם מדגם ואנטי-אנושי חרוזים נוגדן CD63 על הכתף ולסובב לשעה 2 ב RT. השתמש באותם פרמטרים המסובבים כמתואר בשלב 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות 2 שעות של מדגם מסתובב, לבצע שטיפה משולשת על ידי ממגנט לחרוזים נפרדים מפתרון, הסרת שלב נוזלי עם micropipette, וresuspending חרוזים ב500 μl של חיץ טריס-HCl. חרוזים התוצאה כעת חייבים exosomes ומוכנים לשחרור השדה החשמלי והמדידה. </li></ol></li></ol> 2. שדה המושרה חשמלי פורסםnd מדידה של תוכן Exosomal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precoating הראשוני של אלקטרודה עם GADPH פריימר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פלסטיק גם למערך אלקטרודות כדי למנוע זיהום צולב של אלקטרודות בודדות. לצורך ניסוי זה, להשתמש במערך אלקטרודות 16 חיישן עם כל אלקטרודה יחידה במערך המורכב של עבודה, דלפק, והאלקטרודה התייחסות עשויה זהב חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת מניות של 100 ננומטר בדיקה DNA, 0.3 M KCl, ופירול 10 מ&quot;מ על ידי pipetting ריאגנטים המניה לתוך צינור עם מים מזוקקים ultrapure. מערבבים היטב על ידי vortexing. הערה: במחקר זה, הבדיקה DNA שנבחרה מתאימה לגן התייחסות GAPDH, שידוע שקיים בתוך exosomes. רצף הבדיקה המשמש הוא: 5&#39;-ביוטין-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 &quot;. השתמש את התערובת על כל האלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 60 μl של תערובת הבדיקה מונומר-DNA על פני השטח של כל אלקטרודה זהב. לבחון את האלקטרודות על מנת להבטיח שיש כיסוי הולם של העבודה, גounter, והתייחסות אלקטרודות על ידי התערובת הנוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת מונומר-הבדיקה Electropolymerize כדי ליצור שכבת פולימר ניצוח על פני האלקטרודה על ידי יישום פרופיל שדה מחזורי גל מרובע (CSW) חשמלי על פני השטח האלקטרודה. שדה חשמלי זה מורכב מהחלת 350 mV ל9 שניות ומייד עובר לmV 950 עבור 1 שניות. החל פרופיל גל זה מחזורי מרובע לאלקטרודה במשך 10 מחזורים, עבור הסכום כולל של של שדה חשמלי הוחל 100 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את משטח חיישן 3 פעמים עם מים ויבשים עם גז חנקן מזוקקים כדי להסיר נוזל מפני שטח של האלקטרודה. ודא נוזל שהוסר כראוי מן האלקטרודה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריקת המטענים Exosome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס 5 μl של 1 מיקרומטר של בדיקה גלאים לμl 495 מהתערובת המורכבת חרוז-exosome ולהשתמש פיפטה לערבב. הערה: הבדיקה הגלאים היא רצף DNA פריימר המוצמד למולקולה והעמסת בסוף &#39;3. Prob הגלאירצף דואר המשמש למחקר זה תואם את mRNA GAPDH נמצא בתוך exosomes. הרצף של חללית גלאי מצומדות והעמסת הוא: 5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-והעמסת-3 &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 60 μl של החללית ותערובת מורכבת חרוז-exosome על פני האלקטרודה זהב עם מערך מגנט מתחת. מערך מגנט זה מורכב משישה עשר 2.54 המגנטים ניאודימיום מ&quot;מ הקוטר מיושרים למתאימות לאלקטרודות העבודה של החיישן. איור 2 א ממחיש את המיקום של המגנטים ופתרון חרוז-exosome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמדגם נטען על פני האלקטרודה, תחול 20 מחזורים של השדה החשמלי CSW עם 9 שניות ב-300 mV ושניות 1 ב+200 mV (200 סך הכל שניות). מטען exosomal כי הוא שוחרר יהיה להכליא פריימרים על פני השטח של האלקטרודה. אם סמנים של exosome פני השטח הם נושא החקירה, לדלג חלק זה של הניסוי. איור 2 מדגים את התהליך הזה. </li> &lt;li&gt; Wash-off analytes מאוגד על פני האלקטרודה על ידי משולש שטיפה פני האלקטרודה במים מזוקקים. ייבש את האלקטרודה עם גז חנקן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתב נוגדנים וReadout <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 60 μl של 150 יחידה / נוגדן אנטי והעמסת מיליליטר מוצמד לperoxidase חזרת (HRP ב 1: 1,000 דילול) בדילול מלא בקזאין / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנטייה מונעת חשמלי-שדה לHRP אנטי-והעמסת המורכבת לכריך הבדיקה. החל -200 mV עבור 1 שניות וmV 500 עבור 1 שניות במשך 5 מחזורים למשטח אלקטרודה. איור 2A מציג את מתחמי בדיקה לכידה וגלאי עבור שתי מערכת חומצות גרעין חלבון ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח חיישן לשטוף Triple שימוש במים ויבשים עם גז חנקן מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף פעמי של נוגדן אנטי והעמסת עודף מאוגד, להוסיף 60 μl של Tetramethylbenzidine 5,5&#39;-מצע 3,3 &#39;, (TMB). לטעון המצע הזה לכל משטח חיישן באמצעות pipet רב ערוצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע קריאת אמפרומטריים של הנוכחי על ידי המדידה הנוכחית אלקטרודה ב-200 mV עבור 60 שניות באמצעות potentiostat אלקטרוכימיים מסוגל מדידה בו זמנית של 16 ערוצים. איור 2C הוא דוגמא לפרופיל הנוכחי במהלך קריאה. </li></ol></li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> איור 2. רכיבים של EFIRM שיטה. () שיטה של חילוץ exosomes מBiofluid באמצעות microparticles המגנטי CD63 אנטי אנושי מצופה ולאחר מכן לפרוק את מטען exosome באמצעות גלים מרובעים מחזוריים להחיל מורכב חלקיקים-exosome. Scheme (B) של biosensor אלקטרודה המשמש לאיתור מטרות RNA / DNA / חלבון מexosome שוחרר. דוגמא מייצגת של קריאת אמפרומטריים מהמתודולוגיה EFIRM, (ג) שבו גודל נוכחי גדול יותר מתאים to רמות גבוהות יותר של biomolecule. נתון זה הוא מאל ויי et. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Rabinowits, G., Ger&#231;el-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+MicroRNA:+A+Diagnostic+Marker+for+Lung+Cancer.">Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Lau, C. S., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer+Exosome-like+Microvesicles+and+Salivary+Gland+Cells+Interplay+Alters+Salivary+Gland+Cell-Derived+Exosome-like+Microvesicles+In.">Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In.</a> Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).</li><li>Bala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+exosomes+indicate+hepatocyte+injury+and+inflammation+in+alcoholic,+drug-induced,+and+inflammatory+liver+diseases.">Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases.</a> Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).</li><li>Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+exosomes:+A+reservoir+for+biomarker+discovery+and+potential+mediators+of+intrarenal+signalling.">Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).</li><li>L&#228;sser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+saliva,+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA:+uptake+by+macrophages.">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).</li><li>Palanisamy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes.">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).</li><li>Camussi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li><li>Lau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+pancreatic+cancer-derived+exosomes+in+salivary+biomarker+development.">Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Exosomes+from+Cell+Culture+Supernatants+and+Biological+Fluids.">Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).</li><li>Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+in+Saliva.">Characterization of RNA in Saliva.</a> Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).</li><li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio/Abiotic+Interface+Constructed+from+Nanoscale+DNA+Dendrimer+and+Conducting+Polymer+for+Ultrasensitive+Biomolecular+Diagnosis.">Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis.</a> Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).</li><li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Sensor+for+Multiplex+Biomarkers+Detection.">Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection.</a> Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).</li><li>Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+exosomal+biomarker+by+electric+field-induced+release+and+measurement+(EFIRM).">Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM).</a> Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).</li></ol>

דוד וונג הוא מייסד שותף של RNAmeTRIX Inc, חברת אבחון מולקולרית. PeriRx LLC רישוי משנה קניין רוחני הנוגע לאבחון מולקולרי מRNAmeTRIX. דוד וונג הוא יועץ לPeriRx.

מאחר שהתוצאות מצביעות, חלקיקים מגנטיים CD63 אנטי אנושי מצופה יכולים ללכוד חלקיקים קטנים במיוחד שיש לי גודל הנע 70-100 ננומטר. חלקיקים שנתפסו זה עולה בקנה אחד עם הפרופיל שנצפה קודם לכן של exosomes. יתר על כן, השימוש בCSW המתח הנמוך בעקבות לכידתו של החלקיקים מוצג כדי להסיר אותם ממשטח חרוז ולגרום לפרופילי השפלה DNA דומים לזה של שיטה מסורתית מאגר תמוגה מבוססת לשחרור מטען. הנתונים אלה מצביעים על כך שהעבודה של שחרור מטען exosomal ניתן לפשט באמצעות היישום של גל מרובע מחזורי לשיבוש הקרום השומני exosome. שיטה פשוטה זו מאפשרת לשחרור מטען מהיר ללא הצורך בlysing מאגרים שעלולים להשפיע לרעה על מטען exosome, וכתוצאה מכך שיטת EFIRM נראית שיטה עדיפה ללימודי תוכן exosomal בהשוואה לשיטות המסורתיות של ultracentrifugation ושימוש בתמוגהמאגרים. הרגישות, סגוליות, וקלות שיטת EFIRM הופכים אותו אידיאלי לחילוץ exosomes מBiofluid ומהירות בדיקת תוכן פנימי לשתי חומצות גרעין וחלבוני מטרות. המתודולוגיה EFIRM הייתה מוחלת על המחקר של מודל עכבר עירום שהזריק תאי סרטן ריאות אנושיות H460. תאי סרטן הריאות אנושיות H460 היו transfected בנוסף עם אדם CD63-GFP כך שCD63 סמני משטח exosome היה רכוש ניאון. לאחר תקופה של 20 ימים, בסרום עכבר ודגימות רוק שנאספו, ואת המתודולוגיה EFIRM שימשה לנתח תוכן exosomal. מחקר זה הראה מתאמים ליניארי בין דגימות הסרום ורוק (R = 0.79). ההשלכות של תוצאות אלו הן כפולים: ראשית, היכולת ללכוד exosomes מbiofluids מצביעה על כך שתאי סרטן דיסטלי מסוגלים לשדר exosomes למגזרים אחרים בגוף, בעיקר במחקר זה חלל הפה. Second, ליניאריות נצפתה בין דגימות הסרום ורוק מציעה שרוק יכול להיות Biofluid אמין ללכידתו של exosomes שמיוצרים במדינה חולה של הגוף (כלומר, סרטן) והניתוח של התוכן המולקולרי שלהם. השיטה מתוארת והתוצאות שלאחר מכן מראות כי השיטה מתאימה לחילוץ exosomes מbiofluids מבוסס על סמני פני השטח שלהם (בהיקף של עבודה זו, CD 63 הוא סמן המשטח שנבחר). לפרויקטים עתידיים, זה כישרון לבחון האם מיקוד exosomes סמני משטח נוסף (כגון CD 9) או שילוב של שיטת EFIRM עם טכניקות אחרות ישפר את המיצוי ובדיקה של תוכן exosome. הביולוגיה Exosome היא אזור מבטיח של מחקר לרפואת translational, ונתונים של המחקר הבא מצביעים על כך שניתוח exosomal רוק יכול להיות מקום לזיהוי סמנים ביולוגיים מפלים מחלה. חקירה עתידיתנראה מתאים בקביעה האם ביו-מרקרים המחלה דיסטלי יכולים לשמש לאבחון לא פולשני. EFIRM כשיטת עשויה לעזור לסלול את הדרך לניתוח יעיל יותר של מטרות כאמור בתוך exosomes.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

מחקר Exosome הוא תחום מתפתח של חקירה הבוחן microvesicles שומנים שנושאים 1 RNA, DNA 2, וחלבון 3 מטענים. חקירות קודמות של הביולוגיה exosome הובילו לזיהוי של exosomes בbiofluids כגון דם 4, 5 שתן, שד חלב 6, ורוק 7. מחקרים הוכיחו כי exosomes לשחק תפקיד במסלולים סלולריים שונים, מרחוק המדיטציה תקשורת בין מערכות הגוף שונות 8. בגלל התפקיד exosomes לשחק בתקשורת בין תאית, זה השערה הוא שהם עשויים לארוז מטרות biomolecule (חלבון, RNA, ו- DNA) מתואמות עם מצבי מחלה. במבחנה 3 ובעלי חי מודל 9 מחקרים מופיעים לאשש השערה זו. בחקירת תוכן exosomal לגילוי סמן ביולוגי, יש צורך לפתח מתודולוגיה לבידוד exosome סלקטיבית מbiofluids expulsi המושרה,על מטענים מexosomes, וכימות של מולקולות ביולוגיות exosome. במידה על עבודה זו, exosomes יוגדר כמבנה בעל קוטר של כ 70-100 ננומטר והוא בעל CD63 סמן משטח. חוקרים בדרך כלל לטהר ראשון exosomes ידי ultracentrifugation 10 ולאחר מכן לעבד תוכן exosomal באמצעות השימוש בערכות מאגר תמוגה. שימוש בשיטות מאגר תמוגה דורשת פעמים דגירה נעות בין כמה דקות לכמה שעות. תהליך זה עשוי לגרום הניזק למטען exosome ולהוביל לטעום השפלה. לדוגמא, RNA exosome רוק שוחרר באמצעות מאגר תמוגה לסביבת חוץ-התאית המקיפה בעל זמן מחצית חיים של מתחת 1 דקות, מה שהופך את המדידה של RNA exosomal פוסט-תמוגה חיץ משימה קשה במיוחד ללא התוספת של חומרים כימיים ייצוב 11. ההשפעה מורכבת של הוספת חומרים כימיים שונים לתמוגה וייצוב עשויה להציג את הסוכנים שלסבך ולהפריע לanalysis של תוכן exosomal. גישה חלופית עשויה להיות מועילה למהירות פריקת תוכן exosomal ושמירה על המטען לאפיון בצורה בטוחה. בעבודה זו, אנו מציעים את השימוש בשדה חשמלי לא אחיד לשחרורו של תוכן exosomal. חשמליים-שדות כבר ידועים לשאת את היכולת לקטב ולשבש את bilayer השומנים שיוצר קרום תא. העבודה הניסויית שלנו בוחנת שימוש בגלים מרובעים מחזוריים לא אחידים (CSW) לשיבוש מבנה microvesicle של exosomes ושחרור מטען בוצע. שיטה זו משתמשת במתחים בטווח מאה millivolt כמה, מה שאומר שרוב המולקולות ביולוגיות לא תופרענה. אנו מראים כי השימוש בגל מחזורי מרובע הוא מסוגל להניע שחרורו של תוכן mRNA exosome הרוק לסביבת fluidic שמסביב. גרסה זו של תוכן exosomal משולבת בצורה חלקה עם מערכת אלקטרודה שיכול לשמש כדי לכמת את רמות ביטוי הסמן הביולוגי 12,13. שיטה מוצעת זו מאפשרת ולניתוח מהירים, רגישים, מאגר תמוגה ללא תוכן exosome. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> איור 1. סקירה כללית של EFIRM Workflow.. שיטת EFIRM מחולקת באופן כללי לשלושה שלבים עיקריים הנדרשים לטיהור וexosomes ניתוח. שיטת תוכן exosomal שחרור וניתוח זה CSW מבוסס משמשת יחד עם microbeads המגנטי CD63 הספציפי לבידוד exosome. חרוזים CD63-זיקה אלה מאפשרים לבידוד סלקטיבי של exosomes מדגימות רוק (וbiofluids האחר). לאחר דגירה והפקת exosomes באמצעות חרוזים מגנטיים, החרוזים היגרו למערכת החיישנים אלקטרוכימיים לCSW תוכן שחרור וחלק ניתוח של הניסוי מבוסס. איור 1 נותן סקירה כללית של העבודהזרימה של שיטת EFIRM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:132px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Genefluidics, USA</td>
			<td style="width:132px;">&#160;RS-1000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips</td>
			<td style="width:157px;">Genefluidics, USA</td>
			<td>SC1000-16X-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Biotinylated anti-human CD63 Antibody</td>
			<td style="width:157px;">Ancell, USA</td>
			<td style="width:132px;">215-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Neodynium Magnetics ( 1/10&#34; dia. x 1/32&#34; thick)</td>
			<td style="width:157px;">K&#38;J Magnetics, USA</td>
			<td>DH101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Ultrapure Distilled Water</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies, USA</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Mettler Toldeo 3M KcL Solution</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td>1911512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Pyrrole</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:132px;">W338605-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
			<td style="width:157px;">Roche, Germany</td>
			<td>11426346910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:347px;">3, 3&#8242;, 5, 5&#8242; tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Neogen, Usa</td>
			<td style="width:132px;">330175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline Solution</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies, USA</td>
			<td align="right" style="width:132px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Casein/PBS</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td>37532</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (efirm)

Exosomes הם מבני microvesicular שמשחקים תפקיד מתווך בתקשורת בין תאית. זה עניין ללמוד את המטען הפנימי של exosomes כדי לקבוע אם הם נושאים סמנים ביולוגיים מפלים מחלה. לביצוע ניתוח exosomal, יש צורך לפתח שיטה להפקת וניתוח exosomes מbiofluids היעד מבלי לפגוע בתוכן הפנימי. שחרור חשמלי הנוצר על-שדה והמדידה (EFIRM) הוא שיטה לחילוץ במיוחד exosomes מbiofluids, לפרוק את מטענם, ובדיקת תוכן RNA / החלבון הפנימי שלהם. באמצעות microparticle נוגדן אנטי אנושי CD63 הספציפי מגנטי, exosomes הם זירז ראשון מbiofluids. החילוץ הבא, גלי מתח נמוך חשמליים מחזוריים מרובעים (CSW) מיושמים לשבש את קרום לפוחי ולגרום לפריקת מטען. התוכן של exosome הוא הכלאה לפריימרים DNA או נוגדנים משותקים על פני האלקטרודה לקואהntification של תוכן מולקולרי. שיטת EFIRM יש יתרון להפקת exosomes ומטען פורק לניתוח ללא חיץ תמוגה. שיטה זו היא מסוגלת לבצע זיהוי ספציפי של שני מטרות RNA וחלבון סמן ביולוגי בexosome. EFIRM תמציות exosomes במיוחד המבוסס על סמני פני השטח שלהם בניגוד לטכניקות המבוסס על גודל. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) וassay להדגים את הפונקציונליות של השיטה עבור לכידת exosome וניתוח. שיטת EFIRM הייתה מוחלת על exosomal ניתוח של 9 עכברים הוזרקו תאי H640 סרטן ריאות אנושיות (שורת תאי transfected להביע את סמן exosome CD63-GFP אדם) על מנת לבדוק את פרופיל exosome נגד 11 עכברים שקבלו בקרות מלוחה. רמות הגבוהות של סמנים ביולוגיים exosomal (GAPDH גן ההתייחסות וסמן פני חלבון האנושי CD63-GFP) נמצאו עבור H640 הזריק עכברים בשתי דגימות הסרום ורוק. יתר על כן, saliva ודגימות סרום הוכיחו שיש ליניאריות (R = 0.79). תוצאות אלה מרמזות ליכולת הקיום של סמנים ביולוגיים exosome רוק לגילוי המחלות דיסטלי.

אימות של לכידת Exosome של החרוזים באמצעות TEM בידוד של exosomes מרוק באמצעות חרוזים מגנטיים CD63 אנטי אנושיים קבל תוקף בעקבות פרוטוקול חילוץ באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים תמונות (TEM). TEM תערוכות חרוזים מגנטיים עם 70-100 גרגירים ננומטר מייד סמוכים (ראה איור 3 א, ו3B), עולים בקנה אחד עם הפרופיל הידוע של exosomes. אין 70-100 גרגירי ננומטר נצפו לחרוזים המגנטיים ברוק שלא הייתה לי נוגדני CD63 אנטי אנושיים מצומדת להם בעבר (ראו איור 3 ג ו3D). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig3highres.jpg" /> איור 3. תמונות TEM של microparticle המגנטי. תמונה () של חלקיקים מגנטיים CD63 אנטי-אנושיים עם גרגירים קטנים של 70-100 סמוך ננומטר. (ב) Enlaתצוגת rged של ננו-חלקיקים המגנטיים וגרגרים שנצפו. תמונה (C) של חרוזים מגנטיים ללא נוגדנים מצומדות. תצוגה מוגדלת של חרוזים מגנטיים ללא נוגדנים מצומדות (D). נתון זה הוא מאל ויי et. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> מחקר של שחרור תוכן Exosomal שימוש CSW שדה חשמלי תמונות TEM של חרוזים CD63 אנטי אנושיים להראות 70-100 גרגירים ננומטר סמוכים לחרוזים מגנטיים (ראה איור 3 א). בעקבות לכידתו של exosomes באמצעות חרוזים המגנטיים, דגימות מעובדות עם שתי שיטות שונות במקביל. השיטה הראשונה בה השתמשה הייתה Triton-X 100 חומר ניקוי לlyse exosomes והשיטה השנייה הייתה הגל המרובע המחזורי (CSW) שיטה חופשית מאגר תמוגה חשמלי-שדה דן בעבודה זו (פרטי ar השיטה 100-X Tritonדואר שתואר על ידי t e ווי אל. 14). מתחמי exosome-חרוז מעובד אלה נותחו על ידי TEM וגן התייחסות mRNA היה לכמת בשיטה אלקטרוכימיים המתוארת בעבודה זו. גן ההתייחסות שימש במחקר זה היה GAPDH, אשר קיים ברוב exosomes. תמונות TEM להראות כי בשני Triton-X 100 ושדה החשמלי CSW הדגימות טופלו, הייתה היעדר נודע של מבני exosome דבקו בחרוזים המגנטיים לאחר שני CSW וTriton-X 100 שיטות טיפול (ראה איור 4 ב-ii ו איור 4 ב-ד). המדידה של רמות ביטוי GAPDH בשני Triton-X 100 ושדה החשמלי CSW הדגימות שטופלו ברשותו פרופיל דומה: כלומר, כי בעקבות פרוטוקולי lysing השונים, חלה ירידה ברמות GAPDH נמדדו כזמן התקדם, המצביעה על חשיפה של exosomal mRNA לסביבת extravesicular של הרוק (ראה איור 4C). &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig4highres.jpg" /> איור 4. תוצאות הנוגעות למחזורי כיכר גל Exosome מטענים שחרור. (א) תרשים של שיטת שחרור CSW החשמלית. (ב) תמונות TEM של exosomes: (i) לפני שחרור CSW, (ii) לאחר שיטת CSW, (iii) לפני שיטת חיץ תמוגה, (iv) לאחר שיטת מאגר תמוגה. רקע של תמונות TEM הוא תמיכה לייסי. כימות רמות GAPDH mRNA exosome כאשר מאגר תמוגה וCSW שדה החשמלי מוחל (C). נתון זה הוא מאל ויי et. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בחינת ביצועים של EFIRM לגילוי של חלבוני פני השטח וmRNA טיפח הערכת EFIRM וcompa<html> בבלו-מון לשיטות מסורתיות נערך. EFIRM הושווה לכימות של חלבון באמצעות כתם מערבי (לCD63-GFP אדם, סמן משטח לexosomes) וqPCR לכימות של RNA (באמצעות GAPDH כיעד mRNA). בגלל CDP63-GFP האדם היה על פני השטח של exosome, CSW לא הוחל לפרוק מטען exosome. תוצאות בדיקות החלבון ו- RNA מוצגות בהתאמה באיור 5 א ו5B. בדיקות ספציפיות גם נערכו לEFIRM ידי ערבוב exosomes האדם עם exosomes מדגימות עכבר. בדיקות הספציפיות אלה מעורבים תערובות יחס שונות של עכבר כדי דגימות אנושיות. תוצאות של הניסויים מראות כי כאשר תוכן exosomal העכבר היה גדולים פי חמישה מהתוכן אנושי, חלבוני exosomal אדם וmRNA עדיין יכול להיות מזוהה ולכמת (ראה איור 5 ג ו5D לחלבון ו- RNA, בהתאמה). o: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig5highres.jpg" /> איור 5. הערכת ביצועי EFIRM לmRNA ורמות חלבון באמצעות דגימות מדוללות של exosomes. () השוואה של EFIRM וכתם מערבי במחצית GFP. (ב) השוואה של EFIRM וqPCR לGAPDH mRNA. (ג) רמות יחסית זוהו GFP האות לexosomes אנושי בדילול מלא בכמויות שונות של exosome עכבר. אות יחסית זוהתה לGAPDH mRNA לexosomes האנושי בדילול מלא בכמויות שונות של exosome עכבר (ד &#39;). נתון זה הוא מאל ויי et. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> תוכן Exosomal לכמת מעכבר הרוק על מנת לקבוע את הכדאיות של exo גילויתוכן somal בדגימות רוק, שימש מודל עכבר בעירום. מודל עכבר בעירום זה קיבל זריקת interpleural של 1 x 10 6 תאי סרטן הריאות אנושיים H460 (שורת תאים שtransfected גם להביע את סמן exosome CD63-GFP אדם) או תמיסת מלח. היו 11 עכברים שקיבלו ביקורת שלילית של של תמיסת מלח 100 μl, ו -9 עכברים קיבלו ההזרקה של התאים. בעקבות 20 ימים, דגימות סרום ורוק נאספו משתי קבוצות של עכברים. שימוש בכימות אפשר שיטת EFIRM של הרמות היחסית של חלבון CD63-GFP אדם בסרום העכברים ורוק. השוואה של הרמות יחסי בין שני הסרום והרוק של העכברים הראתה קשר לינארי בין שני biofluids (R = 0.79). בנוסף, נצפה הבדל משמעותי ברמות CD63-GFP בבני האדם לH460 הזריק עכברים נגד העכברים הוזרק תמיסת מלח. הדבר מצביע על כך exosomes מתאי גידול דיסטלי נסחר into בכלי הדם והרוק. תוצאות השוואת סרום ורוק מוצגות באיור 6. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig6highres.jpg" /> הערכת איור 6. EFIRM של רמות היחסית של CD63-GFP אדם בסרום ורוק. מחקרי השוואה בין הרמות היחסית של אדם CDP63-GFP מעכברים הוזרקו תאי סרטן הריאות אנושיים. ליניאריות קיימת בין דגימות סרום והרוק לCD63-GFP האנושי. רמות של CD63-GFP אדם מוגבהות אצל עכברים הוזרקו תאים (בהשוואה לעכברים שהוזרקו תמיסת מלח). נתון זה הוא מאל ויי et. 14

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM at JoVE.com

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

איתור של Exosomal ביומרקר על ידי שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

detection-exosomal-biomarker-electric-field-induced-release

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

18.3K Views.  University of California, Los Angeles. Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves. 

Video: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

פיתוח התאמה אישית הסינית השחלות-מארח אוגר Cell חלבון מבחני באמצעות טכנולוגיה אקוסטית microparticle ממברנה

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

מדידה של לכידות צבירה ידי Tensiometry Surface רקמות

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

סינתזה קומבינטורית של שחרור חלבון ותפוקה גבוהה מסרט הפולימר וספריות Nanoparticle

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is subject to chemical and mechanical signals, and the mechanisms by which it senses and responds to mechanical signals are poorly understood. Elucidating the role of forces in cell maturation will enable the design of scaffolds that can promote cell adhesion and cytoskeletal coupling to the substrate, and therefore improve the capacity of different neuronal types to regenerate after injury.
Here, we describe a method to apply simultaneous force spectroscopy measurements during laser induced cell lesion. We measure tension release in the partially lesioned axon by simultaneous interferometric tracking of an optically trapped probe adhered to the membrane of the axon. Our experimental protocol detects the tension release with piconewton sensitivity, and the dynamic of the tension release at millisecond time resolution. Therefore, it offers a high-resolution method to study how the mechanical coupling between cells and substrates can be modulated by pharmacological treatment and/or by distinct mechanical properties of the substrate.

We measured the tension release in an axon that was partially lesioned with a laser dissector by simultaneous force spectroscopy measurement performed on an optically-trapped probe adhered to the membrane of the axon. The developed experimental protocol evaluates the axon adhesion to the culture substrate.

מדידה לשחרר מתח בנגע לייזר מושרה אקסון להעריך הידבקות axonal למצע בpiconewton והאלפית השני רזולוציה

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

זיהוי אופטי של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

מדידה המרבית איזומטרי הכוח שנוצרה על ידי סיבי שריר שלד permeabilized

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell culture system that was used for a long-term cell differentiation study using microscopy. The microfluidic system consists of the following major components: an optically transparent electrotactic chip, a transparent indium-tin-oxide (ITO) heater, a culture media-filling pump, an electrical power supply, a high-frequency power amplifier, an EF multiplexer, a programmable X-Y-Z motorized stage, and an inverted phase-contrast microscope equipped with a digital camera. The microfluidic system is beneficial in simplifying the overall experimental setup and, in turn, the reagent and sample consumption. This work involves the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) induced by direct current (DC) pulse stimulation. In the stem cell maintenance medium, the mouse NPCs (mNPCs) differentiated into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes after the DC pulse stimulation. The results suggest that simple DC pulse treatment could control the fate of mNPCs and could be used to develop therapeutic strategies for nervous system disorders. The system can be used for cell culture in multiple channels, for long-term EF stimulation, for cell morphological observation, and for automatic time-lapse image acquisition. This microfluidic system not only shortens the required experimental time, but also increases the accuracy of control on the microenvironment.

In this study, we present a protocol for the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) solely induced by direct current (DC) pulse stimulation in a microfluidic system.

בידול תאי קודמן עצבי הנגרמת על ידי שדה חשמלי בהתקנים מיקרופלואידיים

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...