עבודה זו התאפשרה באמצעות תמיכה ממשלתית ויקטוריאנית בתשתיות תפעוליות וממשלת אוסטרליה NHMRC IRIISS ונתמכה על ידי מימון המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (ALW #1120300) ומועצת המחקר האוסטרלית (KJH #FT190100265). המחברים רוצים להכיר בתמיכה הטכנית של פלטפורמת המחקר בבעלי חיים מונאש, פלטפורמת היסטולוגיה מונאש ומתקן הדמיה מיקרו מונאש.

השחלות נאספו מעכברי C57BL6J נקבה. כל ההליכים והניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לקוד הנוהג האוסטרלי של NHMRC לטיפול ושימוש בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים בפלטפורמת המחקר בבעלי חיים של מונאש.
הערה: סוכן כימותרפיה הראה לרוקן ביציות זקיק ראשוני, כפי שנקבע באמצעות סטריאולוגיה11 וספירות ישירות12,13 שימש בדו"ח זה כדי להשוות את שתי שיטות הספירה באותה חיה. נקבה, 8 שבועות (מבוגר צעיר) עכברים נשקלו לפני זריקה תוך-פרטית אחת של 75 מ"ג / קילוגרם / bodyweight של ציקלופוספאמיד, או בקרת רכב מלוחים (n = 5 / קבוצה). מינון זה הוכח לגרום כ 50% דלדול של זקיקים ראשוניים, אבל לא דווח לגרום לתחלואה או תמותה בעכברים14. השחלות נקצרו 48 שעות לאחר הטיפול. שחלה אחת מכל בעל חיים תוקנה בתמיסת פורמלין ניטרלית של 10% (v/v) למשך 24 שעות, והשנייה תוקנה בתמיסה של בואן למשך 24 שעות. הרקמה הוטבעה אז שרף glycolmethacrylate ו חתך באופן סדרתי ב 20 מיקרומטר, או פרפין חתך סדרתי ב 5 מיקרומטר. כל הרקמות היו מוכתמות בחומצה תקופתית שיף והמטוטוקסילין.
1. הכנה היסטולוגית: קיבעון, עיבוד, הטמעה וקטע של שחלות עכבר
<ol><li>לנתח את השחלות העכבר על ידי גיזום oviduct ואת כל השומן שמסביב, מבלי לפגוע או לחתוך את השחלה עצמה. במידת הצורך, השתמשו במיקרוסקופ מנתח ובלהב דק לשלב זה (איור 1A).</li>
	<li>לתקן רקמות מיד על ידי הצבת לתוך צינור קטן שכותרתו המכילה את התיקון של Bouin (סטריאולוגיה), או פורמלין קיבוע (ספירה ישירה) במשך 24 שעות (איור 1B),לפני העברת רקמות לתוך 70% אתנול. הערה: מורפולוגיה של זקיק שמורה בצורה הטובה ביותר בתוך רקמת השחלות הקבועה של בואן, המוטבעת בשרף גליקולמתאקרילאט(איור 2).</li>
	<li>לעבד שחלות קבועות שלמות ולאחר מכן להטביע שרף glycolmethacrylate עבור סטריאולוגיה (קובץ משלים 1), או שעווה פרפין לספירה ישירה באמצעות פרוטוקול היסטולוגי סטנדרטי. התראה: שף רעיל, לכן ודא שכל שלבי עיבוד הרקמות מבוצעים במכסה המנוע של האדים והכפפות שחוקות בכל עת.</li>
	<li>השתמש במיקרוטום מיוחד של שרפין מתאקרילאט(איור 1C)המצויד בסכיןזכוכית (איור 1D)כדי לחתוך באופן ממצה מקטעי שרפים עבים של גליקולמתאקרילאט (למשל, 20 מיקרומטר). לאסוף את המקטעים במרווח קבוע (למשל, כל קטע 3) על שקופיות מיקרוסקופזכוכית עבור סטריאולוגיה.</li>
	<li>השתמש microtome סטנדרטי לחתוך מקטעי פרפין דק (למשל, 4-6 מיקרומטר). לאסוף מקטעי רקמה במרווח זמן קבוע (למשל, כל קטע 9) על שקופית מיקרוסקופזכוכית לספירת זקיק ישירה.</li>
	<li>הכתים את השקופיות בחומצה המחזורית שיף והמטוטוקסילין(קובץ משלים 2).</li>
	<li>כריכה עם DPX סטנדרטי למקטעי פרפין, או DPX עבה למקטעי צואה גליקולמתאקרילאט(איור 1E). התראה: גליקולמטהקרילט שרפין DPX הוא מסוכן, אז לבצע את השלב הזה כדי אדים מכסה המנוע. הערה: גליקולמטהקרילט תריס DPX הוא צמיג מאוד. יש להקפיד על כיסוי הזכוכית בחוזקה על ידי לחיצה עליו עם מרית כדי להבטיח שה-DPX יפוזר באופן שווה ודקה, ואין בועות אוויר מתחת לכיסוי(איור 1F).</li>
</ol>2. הערכה סטריאולוגית של מספר זקיק ראשוני באמצעות השבר האופטי
<ol><li>הפעל את המחשב, את יחידת הבקרה מרובת הפקדים, את המצלמה ואת מקור האור בתוך הגדרת הסטריאולוגיה והגדר את מטרת המיקרוסקופ להגדלה נמוכה (למשל, 10x).</li>
	<li>פתח את תוכנת הסטריאולוגיה.</li>
	<li>שים את השקופית הראשונה בצורה מאובטחת על במת המיקרוסקופ.</li>
	<li>התאימו את החשיפה לאור באמצעות בדיקת 'אוטומטי' תחת 'חשיפה' בחלונית 'הגדרות מצלמה' (איור משלים 1A). לחלופין, כוונן ידנית את החשיפה לאור.</li>
	<li>השתמש בג'ויסטיק כדי לאתר את דגימת הרקמה הראשונה ולהביא את המדגם לפוקוס.</li>
	<li>התאם את האיזון הלבן, על-ידי לחיצה על הגדרות נוספות (הממוקמות בפינה השמאלית התחתונה של החלונית 'הגדרות מצלמה') ולאחר מכן לחץ על איזון לבן ולחץ על אוטומטי (איור משלים 1B). לחלופין, לחץ על לחצן איזון לבן הסמוך ללחצן הגדרות נוספות (או בחר אזור בהגדרות נוספות), כדי להגדיר את האיזון הלבן באופן ידני על-ידי בחירת אזור לבן במקטע.</li>
	<li>עבור לתפריט הנפתח בדיקות ולחץ על זרימת עבודה של משבר אופטי. לאחר מכן לחץ על התחל פרוייקט חדש ולחץ על אישור.
	<ol>
<li>אם נשמרה תצורת דגימה קיימת, תחת פרמטרי דגימה, לחץ על כן | אני לא יודע מה לעשות ובחר את תצורת הדגימה הרצויה.</li>
		<li>אם לא, לחץ על לא והזן ידנית את פרטי המקטע הטורי (איור משלים 1C) והגדר את תצורת הבדיקה בשלב 2.13.</li>
	</ol></li>
	<li>לחץ על הבא, הגדר את המיקרוסקופ להגדלה נמוכה ובחר הגדלה 10x מהתפריט הנפתח.</li>
	<li>לחץ על הבא, ולאחר מכן לעקוב אחר כל החלק השחלות - להתחיל על ידי לחיצה שמאלה סביב המקטע ובסוף, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר סגור מיתאר.</li>
	<li>לחץ על הבא, הגדר את המיקרוסקופ להגדלה גבוהה ובחר הגדלה 100x שמן מהתפריט הנפתח.</li>
	<li>מניחים טיפת שמן על מקטע הרקמה בשקופית ומעבירים את מטרת המיקרוסקופ להגדלה של 100x.</li>
	<li>כוונן את החשיפה לאור (כמו בשלב 2.4) ולחץ על הבא.</li>
	<li>הגדר את פרמטרי הדגימה כדי להגדיר את תצורת הבדיקה. כאן, מסגרת הספירה הוגדרה ל- 47.5 מיקרומטר x 47.5 מיקרומטר (2,256.25 מיקרומטר2) ואורך השלב הוגדר ל- 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר (10,000 מיקרומטר2) (איור משלים 2). לאחר שנקבעו פרמטרי הדגימה, שמור את התבנית ופתח מחדש במהלך הפעלות הניתוח הבאות בשלב 2.7.</li>
	<li>לחץ על התחל לספור (איור משלים 1D). התמקד בחלק העליון של המדגם, לחץ על אישור והתחל לספור.</li>
	<li>השתמש ידית התמקדות לנוע דרך עומק דגימת 10 מיקרומטר ולספור את כל הזקיקים הקדמוניים אשר גרעין ביצית נכנס לפוקוס. לחץ על הבא כדי לעבור לאזור הבא.<ol>
<li>לסווג זקיקים כמו ראשוני אם ביצית מוקף בתאי גרנולוזה קשקשיים (שטוחים), אך ללא תאי גרנולוזה cuboidal (איור 2A). הערה: זקיקים ראשוניים נבדלים מזקיקים בינוניים/מעבריים, הכוללים שילוב של תאי גרנולוזה קובידליים וקבורתיים (איור 2B),וזקיקים ראשוניים, המוקפים בעיקר בתאי גרנולוזה קוביואידיים(איור 2C). יש לכמת מחלקות זקיק אלה בנפרד.</li>
		<li>לספור רק זקיקים שבהם גרעין ביצית גלוי. גרעין ביצית חייב להופיע בתוך מסגרת הספירה או לגעת בקווי ההכללה הירוקים של מסגרת הספירה(איור משלים 1E,F).</li>
		<li>אם גרעין ביצית נופל מחוץ למסגרת הספירה (איור משלים 1G) או נוגע בקווי ההדרה האדומים של מסגרת הספירה, אל תספור זקיק זה.</li>
		<li>בעת הערכת דלדול זקיק ראשוני בתגובה לכימיקל אקסוגני (למשל, כימותרפיה), ודא שכל הזקיקים שנספרו בריאים ולכן יש להם מורפולוגיה נורמלית (איור 2). לספור כל זקיקים חריגים או אטרטיים בנפרד. לעתים קרובות, מוות זקיק הוא המושרה על ידי עלבונות כגון כימותרפיה, וכימות של זקיקי אטרטית צריך להתקבל בנפרד על מנת להבחין בין זקיקים בריאים אטרטיים, כמו רק זקיקים בריאים מרכיבים את שמורת השחלות15.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר השלמת הספירה במקטע זה, בצע אחת מהפעולות הבאות:<ol>
<li>לחץ על הוסף מקטע חדשולאחר מכן חזור לשלב 2.3 כדי להגדיר את המקטע הבא לספירה.</li>
		<li>לחץ על סיימתי לספור כדי לסיים את ההפעלה. להחזיר את המטרה 10x, לצאת התוכנה סטריאולוגיה לכבות את מקור האור, מצלמה, יחידת בקרה מרובה ומחשב.</li>
	</ol></li>
	<li>השג את מספר הזקיק הגולמי (Q) מכל מקטע רקמה שנדגם מהשחלה כולה, ולאחר מכן באמצעות גיליון אלקטרוני, השתמש במשוואה שלהלן כדי לקבל את הערך הסופי מכל בעל חיים משוכפל (N)4. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg">איפה: N = המספר המשוער הכולל של זקיקים בתוך השחלה. Q = ספירת זקיקים ראשונית גולמית. f1 = מרווח דגימה. כל קטעשלישי נדגם <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg"> כך. f2 = קשרי גומלין בין מסגרת הספירה (אזור לדוגמה) לבין צעד, מחושב כ <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg"> . מאז אזור המדגם היה 2256 מיקרומטר2 (47.5 מיקרומטר x 47.5 מיקרומטר) ואת אזור צעד היה 10000 מיקרומטר2 (100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר), <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg"> . f3 = שבר של קטע השחלות שנדגם. מאז 10 מיקרומטר של סעיף 20 מיקרומטר נדגם, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg"> . לכן, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg"> . הערה: פרוטוקול זה מתאר כיצד ליישם עקרונות אלה של ניתוחים סטריאולוגיים באמצעות תוכנה סטריאולוגית מצוטט נרחב (טבלה של חומרים); עם זאת, תוכנה סטריאולוגית אחרת זמינה. העקרונות המיושמים במהלך ניתוחים סטריאולוגיים של זקיקי השחלות זהים, ללא קשר לתוכנה המשמשת להגדרת הפרמטרים. סטריאולוגיה היא המדויקת ביותר כאשר 100 או יותר אובייקטים נספרים בשחלת עכברבוגרת 4, כמו זה נותן מקדם של שגיאה עבור האומדן מתחת 10%16. פרמטרי הדגימה המתוארים כאן עברו אופטימיזציה כדי להבטיח מינימום של כ -100 אובייקטים (כלומר, זקיקים ראשוניים, מעבריים וראשיים) ניתן לספור בשחלות C57BL6J מסוג מבוגרים. מחקר פיילוט יכול להתבצע כולל גודל מדגם קטן כדי לקבוע את פרמטרי הדגימה האופטימליים, כגון מרווח ומספר המקטעים שיש לנתח ומספר הניתוחים האופטיים בתוך הסעיפים שנדגמו17.</li>
</ol>3. הערכת מספר זקיק ראשוני על ידי ספירות זקיק השחלות הישירות
<ol><li>הנח את שקופית המיקרוסקופ בצורה מאובטחת תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי ובצע ספירות ישירות כדי להשיג מספר זקיק ראשוני גולמי.<ol>
<li>לסווג זקיקים כמו הקדמוני אם ביצית גלוי בבירור והוא מוקף בתאי גרנולוזה קשקשיים (שטוחים), אבל אין תאי גרנולוזה cuboidal (איור 2D). הערה: זקיקים קדמוניים נבדלים מזקיקים בינוניים/מעבריים, הכוללים שילוב של תאי גרנולוזה קובידליים וקבורתיים (איור 2E)וזקיקים ראשוניים, המוקפים בעיקר בתאי גרנולוזה קוביואידיים(איור 2F). יש לכמת מחלקות זקיק אלה בנפרד.</li>
		<li>ודא שכל הזקיקים שנספרו בריאים ולכן יש להם מורפולוגיה נורמלית (איור 2). לספור כל זקיקים חריגים או אטרטיים בנפרד, כמו רק זקיקים בריאים להרכיב את השמורה השחלות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחלופין, קח פוטומיקרוגרפים מרובים או תפורים בעוצמה גבוהה (למשל, 20x) של כל מקטע רקמת השחלות כדי לבצע ספירות על-ידי פתיחת קבצי התמונה. ניתן לעשות זאת באופן ידני, או באמצעות סורק שקופיות אוטומטי.</li>
	<li>השג את מספר הזקיק הגולמי (Q) מכל מקטע רקמה שנדגם מהשחלה כולה במרווח שנקבע מראש. הכפל מספר זה בהיפוך של שבר הדגימה כדי להשיג את הערך הסופי עבור כל בעל חיים משכפל (N), באמצעות המשוואה שלהלן. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg">איפה: N = המספר המשוער הכולל של זקיקים בתוך השחלה. ש = ספירת זקיקים גולמיים (מכל סוג בנפרד, מחושב בנפרד). f1 = מרווח דגימה. כל קטע9 נדגם <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg"> כך. לכן, <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg"> .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Mullerian+hormone:+ovarian+reserve+testing+and+its+potential+clinical+implications.">Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications.</a> Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).</li><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary.">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li><li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number.">Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li><li>Ristic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+dexamethasone+treatment+reduces+ovarian+follicle+number+in+neonatal+rat+offspring.">Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring.</a> Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).</li><li>Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+study+on+the+effect+of+vitamin+C+in+preventing+the+adverse+effects+of+bisphenol+A+on+rat+ovary.">Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary.</a> International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+image+analysis+and+its+solution:+unbiased+stereology.">Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).</li><li>Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+methacrylate+sections+devoid+of+lost+caps+simplify+stereological+quantifications+based+on+the+optical+fractionator+design.">Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design.</a> Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PUMA+protects+the+ovarian+reserve+during+DNA-damaging+chemotherapy+and+preserves+fertility.">Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility.</a> Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).</li><li>Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GnRH+antagonist+cetrorelix+reduces+cyclophosphamide-induced+ovarian+follicular+destruction+in+mice.">The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice.</a> Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).</li><li>Winship, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor,+olaparib,+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice:+implications+for+fertility+preservation.">The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction. , (2020).</li><li>Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+depletion+of+primordial+follicular+reserve+in+mice+treated+with+cyclophosphamide:+clinical+importance+and+proposed+accurate+investigative+tool.">Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool.</a> Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-+and+cyclophosphamide-induced+primordial+follicle+depletion+is+caused+by+direct+damage+to+oocytes.">Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes.</a> Molecular Human Reproduction. , (2019).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).</li><li>Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Fractionator+Technique+to+Estimate+Cell+Numbers+in+a+Rat+Model+of+Electroconvulsive+Therapy.">The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).</li><li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Is+the+Number+of+Primordial+Follicles+in+the+Ovarian+Reserve+Established.">How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).</li><li>Omari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcl-1+is+a+key+regulator+of+the+ovarian+reserve.">Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve.</a> Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).</li><li>Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice+and+depletion+is+enhanced+with+age.">Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accurate,+simple+method+for+unbiased+determination+of+primordial+follicle+number+in+the+primate+ovary.">An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary.</a> Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries:+symmetry+and+relationship+with+age.">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li><li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number:+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem.">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li><li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+(STRAW)+staging+system.">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li><li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+reproductive+aging:+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause.">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li><li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach.">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).</li><li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב עבור טכניקת תקן הזהב לספירת זקיקים ראשוניים של העכבר, סטריאולוגיה, ואת השיטה הנפוצה יותר של ספירת זקיקים ישירה. טיפול כימותרפי שימש כדי להשוות ולהשוות את התוצאות שהתקבלו משתי שיטות שונות אלה בתוך השחלה השמאלית והימנית מאותה חיה. שתי השיטות חשפו שונות גבוה...

הביציות הלא בוגרות, שנעצרו באופן מיוטי, המאוחסנות בתוך זקיקים ראשוניים בשחלה, הן יחידת האחסון של הנבט הנשי ומהוות את שמורת השחלות לכל החיים של הפרט. מספרי זקיק ראשוני לרדת באופן טבעי עם גיל1, או לחילופין, יכול להיות מדולדל בטרם עת בעקבות חשיפה לכימיקלים אקסוגני, כולל כמה תרופות רעילים סביבתיים באוויר, מזון ומים2. בהינתן שמספר הזקיק הקדמוני הוא סופי, כמות ואיכות הזקיקים הנמצאים בשחלה קובעות במידה רבה את פוריות הנשית ואת בריאות הצאצאים. לכן, כימות מדויק של מספר זקיק ראשוני אצל נשים חיוני להערכת ההשפעות מחוץ ליעד של עלבונות אקסוגני על עתודת השחלות.
אצל נשים, ניתוח של השחלה כולה הוא בדרך כלל לא אפשרי, ולכן אמצעים פונדקאיים לא פולשניים של עתודת השחלות חייב להיות מנוצל בסביבה קלינית. הורמון אנטי Mϋllerian (AMH) הוא הסמן הביולוגי הפונדקאי הנפוץ ביותר קלינית3. רמות AMH בסרום נמדדות לעתים קרובות אצל נשים בגיל אימהי מתקדם, או לפני ואחרי טיפול בסרטן, כגון כימותרפיה. עם זאת, AMH מופק על ידי זקיקים גדל ולא על ידי זקיקים ראשוניים, ולכן, רמות הסרום אינם מודיעים על מספר זקיק ראשוני מוחלט.
עם היעדר שיטות כדי לקבוע במדויק את מספר הזקיק הקדמוני אצל נשים באתרו, ספירת זקיקי השחלות במודלים בעלי חיים קטנים, כגון מכרסמים, נשאר כלי מחקר חיוני כדי להעריך את המידה שבה עלבונות אקסוגני להשפיע על זקיקים ראשוניים ובכך, פוריות. למרבה הצער, דיווחים לאורך הספרות של מספרי זקיק ראשוניים במודלים מכרסמים הם משתנים מאוד4. סיבה מרכזית לכך היא הבדלים טכניים שדווחו בהרחבה בשיטת הספירה שננקטה. בעיקר, ישנן שתי טכניקות שונות המתוארות בספרות לספירת זקיקים ראשוניים בעכברים. אלה כוללים סטריאולוגיה, אשר משתמשת בשיטת מפרק אופטי שבר, וספירת זקיק ישירה.
סטריאולוגיה נחשבת תקן הזהב כפי שהוא משתמש דגימה אקראית אחידה שיטתית5, מה שהופך אותו השיטה המדויקת ביותר של כימות מספר זקיק ראשוני בעכבר כולו, או שחלותעכברוש 4,6,7. הסטריאולוגיה אינה משוחדת, שכן היא מהווה את המבנה התלת מימדי של מושא העניין8. בשיטת מפרק/שבר אופטי, מוחלות שלוש רמות דגימה כדי לכמת זקיקים ראשוניים באמצעות מקטעי רקמה עבים (למשל, 20 מיקרומטר) בתוך שבר ידוע של השחלה הכוללת של העכבר. ראשית, מרווח הדגימה נבחר (למשל, כל מקטע3) בהתחלה אקראית (דגימת שבר 1, f1)4. לאחר מכן נדגמים חלקים באופן שיטתי ואחיד מנקודה זו דרך השחלה כולה. לאחר מכן, מסגרת ספירה לא משוחדת מודבקת על החלק השחלתי ומוזזת בהדרגה לאורך רשת ספירה מוגדרת ואקראית (דגימת שבר 2, f2)8. לבסוף, חלק ידוע של עובי המקטע נדגם אופטית (למשל, 10 מיקרומטר) וזקיקים בתוך אזור זה נספרים (דגימת שבר 3, f3)4. מספר הזקיק הגולמי מוכפל בהיפוך של שברי דגימה אלה כדי להשיג את הערך הסופי. שיטה זו דורשת הכשרה וציוד מומחים, כולל מיקרוסקופ עם שלב ממונע המונע על ידי תוכנה סטריאולוגית. רקמות צריך להישמר בתיקון של Bouin מיוחד, מוטבע שרף glycolmethacrylate כדי לאפשר מקטעי רקמה עבה להיחתך באמצעות microtome שרף glycolmethacrylate עם סכין זכוכית. שיטה זו נועדה להסביר הצטמקות רקמות ועיוות, כדי לשמר בצורה הטובה ביותר את המבנה המורפולוגי התלת מימדי של השחלה וזקיקים9.
ספירת זקיקים ישירה היא השיטה הנפוצה ביותר לספירת זקיקים10. קיבועים נפוצים יותר (כלומר, פורמלין) ניתן להשתמש, ואחריו הטמעת שעווה פרפין וסעיף סדרתי ממצה באמצעות microtome סטנדרטי בעובי של בין 4-6 מיקרומטר. זקיקים נספרים באופן שיטתי במקטע הרקמה כולו במרווח מוגדר, ולאחר מכן מוכפלים בהיפוך של מרווח הדגימה כדי להשיג את הערכת הזקיק הכוללת. שיטה זו היא מהירה, קלה, ניתן לבצע באמצעות רקמות בארכיון, ומוכן באמצעות טכניקות היסטולוגיות סטנדרטיות. זה דורש רק מיקרוסקופ אור עם יכולות הדמיה סטנדרטיות. עם זאת, למרות יתרונות אלה, ספירת זקיקים ישירה חסרה את הדיוק ואת הפרמטרים ספירה קפדנית של סטריאולוגיה, מה שהופך אותו נוטה יותר הטיה החוקר. בנוסף, רקמות עלולות לעבור הצטמקות ועיוות במהלך העיבוד, לשבש את השלמות והמורפולוגיה של השחלה ובכך להקשות על סיווג זקיק וכימות.
מטרת מאמר זה היא לתאר שתי שיטות נפוצות להערכת כמותית של מספר זקיק ראשוני בשחלות עכבר: סטריאולוגיה וספירת זקיקים ישירה. אנו נספק פרוטוקולים מפורטים לשתי שיטות אלה ונדגיש כמה מהחוזקות והחולשות שלהם, על מנת לשפר את הרבייה בתחום שלנו ולאפשר לחוקרים לקבל החלטה מושכלת של שיטת הספירה המתאימה ביותר למחקריהם.

<table><tbody><tr><td>1-Butanol (HPLC)</td><td>Fisher Chemical</td><td>#A383-1</td><td></td></tr><tr><td>Acid alcohol</td><td>Amber Scientific</td><td>#ACDL</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&amp;rsquo;s fixative</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HT10132</td><td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td></tr><tr><td>Cyclophosphamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C0768-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#06522</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Amber Scientific</td><td>#ETH</td><td>Ethanol 100%</td></tr><tr><td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td><td>Designs for Vision</td><td>#FEA-745-SR</td><td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td></tr><tr><td>Formalin fixative</td><td>Australian Biostain</td><td>#ANBFC</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENCS22501GP</td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td><td>Leica Microsystems</td><td>#RM2165</td><td></td></tr><tr><td>Glycolmethacrylate DPX</td><td>*made in house</td><td></td><td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Trajan</td><td>#11031</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;s haematoxylin</td><td>Amber Scientific</td><td>#MH</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX50 microscope</td><td>Olympus</td><td>#BX50</td><td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &amp;amp; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td></tr><tr><td>Olympus immersion oil type-F</td><td>Olympus</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>Olympus TH4-200 light source</td><td>Olympus</td><td>#TH4-200</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#03987</td><td></td></tr><tr><td>Periodic acid</td><td>Trajan</td><td>#PERI1%</td><td>Periodic acid 1%</td></tr><tr><td>Rotary Microtome CUT 4060</td><td>MicroTec</td><td>#4060R/F</td><td>Used to cut paraffin sections</td></tr><tr><td>Schiff&amp;rsquo;s reagent</td><td>Trajan</td><td>#SCHF</td><td></td></tr><tr><td>Scott&#039;s tap water</td><td>Amber Scientific</td><td>#SCOT</td><td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td></tr><tr><td>StereoInvestigator Stereological System</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENSF41296SP</td><td>1 mm, 72 pcs</td></tr><tr><td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64709003</td><td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td></tr><tr><td>Technovit 3040 yellow</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64708805</td><td>100 g/80 mL</td></tr></tbody></table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

יונקים נקביים המתרבים מינית נולדים עם כל אספקת ביציות לכל החיים שלהם. ביציות לא בוגרות ורגיעה נמצאות בתוך זקיקים ראשוניים, יחידת האחסון של הנבט הנשי. הם אינם מתחדשים, ולכן מספרם בלידה ושיעור האובדן שלאחר מכן מכתיב במידה רבה את תוחלת החיים הפורייה הנשית. כימות מדויק של מספרי זקיקים ראשוניים אצל נשים ובעלי חיים חיוני לקביעת ההשפעה של תרופות ורעילים על שמורת השחלות. כמו כן, יש צורך להעריך את הצורך, ואת ההצלחה של, טכניקות שימור פוריות קיימות ומתפתחות. נכון לעכשיו, אין שיטות קיימות כדי למדוד במדויק את מספר הזקיקים הקדמוניים המרכיבים את עתודת השחלות אצל נשים. יתר על כן, קבלת רקמת השחלות מבעלי חיים גדולים או מינים בסכנת הכחדה לניסויים היא לעתים קרובות לא ריאלי. לכן, עכברים הפכו מודל חיוני עבור מחקרים כאלה, ואת היכולת להעריך מספרי זקיק ראשוני בשחלות עכבר שלמות הוא כלי קריטי. עם זאת, דיווחים על מספרי זקיקים מוחלטים בשחלות העכבר בספרות הם משתנים מאוד, מה שמקשה על השוואה ו/או שכפול נתונים. זאת בשל מספר גורמים, כולל מתח, גיל, קבוצות טיפול, כמו גם הבדלים טכניים בשיטות הספירה המועסקים. במאמר זה, אנו מספקים מדריך הדרכה שלב אחר שלב להכנת מקטעים היסטולוגיים ולספירת זקיקים ראשוניים בשחלות עכבר בשתי שיטות שונות: [1] סטריאולוגיה, המסתמכת על טכניקת מפרק השבר/אופטי; ו[2] טכניקת הספירה הישירה. חלק מהיתרונות והחסרונות המרכזיים של כל שיטה יודגשו כך שניתן יהיה לשפר את השחזור בתחום ולאפשר לחוקרים לבחור את השיטה המתאימה ביותר למחקריהם.

מודל מאופיין היטב של דלדול זקיק שימש, לפיה עכברים נקבה צעירה מבוגרת ניתנו מנה אחת של כימותרפיה ציקלופוספאמיד, או בקרת רכב מלוחים (n = 5 / קבוצה) ושתי השחלות נקצרו מכל בעל חיים לאחר 48 שעות. שחלה אחת לכל חיה הוכנה כמתואר בשלב 1 עבור כל אחת משתי השיטות: סטריאולוגיה או ספירה ישירה. השחלה השמאלית והי?...

Watch this Scientific Journal Video about Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries at JoVE.com

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

כאן, אנו מתארים, להשוות, ולהשוות שתי טכניקות שונות לספירת זקיק מדויקת של רקמות השחלות עכבר קבוע.

ספירה מדויקת של זקיקים בשחלות עכברים למבוגרים

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

accurate-follicle-enumeration-in-adult-mouse-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Views.  Monash University. כאן, אנו מתארים, להשוות, ולהשוות שתי טכניקות שונות לספירת זקיק מדויקת של רקמות השחלות עכבר קבוע.

Video: Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

איחזור של ביציות עכבר

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Biology

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus improving the overall pregnancy outcome. We recently developed a classification method based on microscopic live observations of mouse oocytes during their in vitro maturation from the germinal vesicle (GV) to the metaphase II stage, followed by the analysis of the cytoplasmic movements occurring during this time-lapse period. Here, we present detailed protocols of this procedure. Oocytes are isolated from fully-grown antral follicles and cultured for 15 h inside a microscope equipped for time-lapse analysis at 37 &#176;C and 5% CO2. Pictures are taken at 8 min intervals. The images are analyzed using the Particle Image Velocimetry (PIV) method that calculates, for each oocyte, the profile of Cytoplasmic Movement Velocities (CMVs) occurring throughout the culture period. Finally, the CMVs of each single oocyte are fed through a mathematical classification tool (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), which predicts the probability of a gamete to be developmentally competent or incompetent with an accuracy of 91.03%. This protocol, set up for the mouse, could now be tested on oocytes of other species, including humans.

Here, we present a protocol for non-invasive assessment of oocyte developmental competence performed during their in vitro maturation from the germinal vesicle to the metaphase II stage. This method combines time-lapse imaging with particle image velocimetry (PIV) and neural network analyses.

מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

פיתוח מודל עכבר לכריתת שחלות עם רמת FSH גבוהה

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model

During the transition from a reproductive to a nonreproductive phase (menopause), many women experience significant physiological and pathological changes, including decreased bone mass, increased blood lipids, and increased visceral adiposity. Levels of follicle-stimulating hormone (FSH) rise during the menopausal transition. Many studies have shown that FSH in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. Thus, building an animal model that can help study the independent effects of FSH in vivo is particularly important. In this study, C57BL/6 female mice were ovariectomized and supplemented with estradiol valerate (OVX + E2) to eliminate the effect of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The OVX + E2 mice received solvent (N.S.) or different doses of recombinant FSH via intraperitoneal injection to create a mouse model (OVF) characterized by relatively stable estrogen and rising FSH levels. Thus, we successfully generated an experimental mouse model to mimic the early stage of menopause transition, characterized by elevated serum FSH levels. The OVF model has the advantages of being stable, low cost, and easy to operate, which is suitable for studies to explore the extragonadal actions of FSH. Here, we describe detailed protocols for the mouse OVF model.

מחבר זרקור: חקירת הקשר בין FSH ושינויים פתופיזיולוגיים אצל נשים לפני גיל המעבר - תובנות ממודל עכבר 

Follicle-stimulating hormone (FSH) in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. The ovariectomized and FSH-treated mouse model (OVF) can be used to explore the extragonadal actions of FSH.