עבודה זו התאפשרה באמצעות תמיכה ממשלתית ויקטוריאנית בתשתיות תפעוליות וממשלת אוסטרליה NHMRC IRIISS ונתמכה על ידי מימון המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (ALW #1120300) ומועצת המחקר האוסטרלית (KJH #FT190100265). המחברים רוצים להכיר בתמיכה הטכנית של פלטפורמת המחקר בבעלי חיים מונאש, פלטפורמת היסטולוגיה מונאש ומתקן הדמיה מיקרו מונאש.

השחלות נאספו מעכברי C57BL6J נקבה. כל ההליכים והניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לקוד הנוהג האוסטרלי של NHMRC לטיפול ושימוש בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים בפלטפורמת המחקר בבעלי חיים של מונאש.
הערה: סוכן כימותרפיה הראה לרוקן ביציות זקיק ראשוני, כפי שנקבע באמצעות סטריאולוגיה11 וספירות ישירות12,13 שימש בדו"ח זה כדי להשוות את שתי שיטות הספירה באותה חיה. נקבה, 8 שבועות (מבוגר צעיר) עכברים נשקלו לפני זריקה תוך-פרטית אחת של 75 מ"ג / קילוגרם / bodyweight של ציקלופוספאמיד, או בקרת רכב מלוחים (n = 5 / קבוצה). מינון זה הוכח לגרום כ 50% דלדול של זקיקים ראשוניים, אבל לא דווח לגרום לתחלואה או תמותה בעכברים14. השחלות נקצרו 48 שעות לאחר הטיפול. שחלה אחת מכל בעל חיים תוקנה בתמיסת פורמלין ניטרלית של 10% (v/v) למשך 24 שעות, והשנייה תוקנה בתמיסה של בואן למשך 24 שעות. הרקמה הוטבעה אז שרף glycolmethacrylate ו חתך באופן סדרתי ב 20 מיקרומטר, או פרפין חתך סדרתי ב 5 מיקרומטר. כל הרקמות היו מוכתמות בחומצה תקופתית שיף והמטוטוקסילין.
1. הכנה היסטולוגית: קיבעון, עיבוד, הטמעה וקטע של שחלות עכבר
<ol><li>לנתח את השחלות העכבר על ידי גיזום oviduct ואת כל השומן שמסביב, מבלי לפגוע או לחתוך את השחלה עצמה. במידת הצורך, השתמשו במיקרוסקופ מנתח ובלהב דק לשלב זה (איור 1A).</li>
	<li>לתקן רקמות מיד על ידי הצבת לתוך צינור קטן שכותרתו המכילה את התיקון של Bouin (סטריאולוגיה), או פורמלין קיבוע (ספירה ישירה) במשך 24 שעות (איור 1B),לפני העברת רקמות לתוך 70% אתנול. הערה: מורפולוגיה של זקיק שמורה בצורה הטובה ביותר בתוך רקמת השחלות הקבועה של בואן, המוטבעת בשרף גליקולמתאקרילאט(איור 2).</li>
	<li>לעבד שחלות קבועות שלמות ולאחר מכן להטביע שרף glycolmethacrylate עבור סטריאולוגיה (קובץ משלים 1), או שעווה פרפין לספירה ישירה באמצעות פרוטוקול היסטולוגי סטנדרטי. התראה: שף רעיל, לכן ודא שכל שלבי עיבוד הרקמות מבוצעים במכסה המנוע של האדים והכפפות שחוקות בכל עת.</li>
	<li>השתמש במיקרוטום מיוחד של שרפין מתאקרילאט(איור 1C)המצויד בסכיןזכוכית (איור 1D)כדי לחתוך באופן ממצה מקטעי שרפים עבים של גליקולמתאקרילאט (למשל, 20 מיקרומטר). לאסוף את המקטעים במרווח קבוע (למשל, כל קטע 3) על שקופיות מיקרוסקופזכוכית עבור סטריאולוגיה.</li>
	<li>השתמש microtome סטנדרטי לחתוך מקטעי פרפין דק (למשל, 4-6 מיקרומטר). לאסוף מקטעי רקמה במרווח זמן קבוע (למשל, כל קטע 9) על שקופית מיקרוסקופזכוכית לספירת זקיק ישירה.</li>
	<li>הכתים את השקופיות בחומצה המחזורית שיף והמטוטוקסילין(קובץ משלים 2).</li>
	<li>כריכה עם DPX סטנדרטי למקטעי פרפין, או DPX עבה למקטעי צואה גליקולמתאקרילאט(איור 1E). התראה: גליקולמטהקרילט שרפין DPX הוא מסוכן, אז לבצע את השלב הזה כדי אדים מכסה המנוע. הערה: גליקולמטהקרילט תריס DPX הוא צמיג מאוד. יש להקפיד על כיסוי הזכוכית בחוזקה על ידי לחיצה עליו עם מרית כדי להבטיח שה-DPX יפוזר באופן שווה ודקה, ואין בועות אוויר מתחת לכיסוי(איור 1F).</li>
</ol>2. הערכה סטריאולוגית של מספר זקיק ראשוני באמצעות השבר האופטי
<ol><li>הפעל את המחשב, את יחידת הבקרה מרובת הפקדים, את המצלמה ואת מקור האור בתוך הגדרת הסטריאולוגיה והגדר את מטרת המיקרוסקופ להגדלה נמוכה (למשל, 10x).</li>
	<li>פתח את תוכנת הסטריאולוגיה.</li>
	<li>שים את השקופית הראשונה בצורה מאובטחת על במת המיקרוסקופ.</li>
	<li>התאימו את החשיפה לאור באמצעות בדיקת 'אוטומטי' תחת 'חשיפה' בחלונית 'הגדרות מצלמה' (איור משלים 1A). לחלופין, כוונן ידנית את החשיפה לאור.</li>
	<li>השתמש בג'ויסטיק כדי לאתר את דגימת הרקמה הראשונה ולהביא את המדגם לפוקוס.</li>
	<li>התאם את האיזון הלבן, על-ידי לחיצה על הגדרות נוספות (הממוקמות בפינה השמאלית התחתונה של החלונית 'הגדרות מצלמה') ולאחר מכן לחץ על איזון לבן ולחץ על אוטומטי (איור משלים 1B). לחלופין, לחץ על לחצן איזון לבן הסמוך ללחצן הגדרות נוספות (או בחר אזור בהגדרות נוספות), כדי להגדיר את האיזון הלבן באופן ידני על-ידי בחירת אזור לבן במקטע.</li>
	<li>עבור לתפריט הנפתח בדיקות ולחץ על זרימת עבודה של משבר אופטי. לאחר מכן לחץ על התחל פרוייקט חדש ולחץ על אישור.
	<ol>
<li>אם נשמרה תצורת דגימה קיימת, תחת פרמטרי דגימה, לחץ על כן | אני לא יודע מה לעשות ובחר את תצורת הדגימה הרצויה.</li>
		<li>אם לא, לחץ על לא והזן ידנית את פרטי המקטע הטורי (איור משלים 1C) והגדר את תצורת הבדיקה בשלב 2.13.</li>
	</ol></li>
	<li>לחץ על הבא, הגדר את המיקרוסקופ להגדלה נמוכה ובחר הגדלה 10x מהתפריט הנפתח.</li>
	<li>לחץ על הבא, ולאחר מכן לעקוב אחר כל החלק השחלות - להתחיל על ידי לחיצה שמאלה סביב המקטע ובסוף, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר סגור מיתאר.</li>
	<li>לחץ על הבא, הגדר את המיקרוסקופ להגדלה גבוהה ובחר הגדלה 100x שמן מהתפריט הנפתח.</li>
	<li>מניחים טיפת שמן על מקטע הרקמה בשקופית ומעבירים את מטרת המיקרוסקופ להגדלה של 100x.</li>
	<li>כוונן את החשיפה לאור (כמו בשלב 2.4) ולחץ על הבא.</li>
	<li>הגדר את פרמטרי הדגימה כדי להגדיר את תצורת הבדיקה. כאן, מסגרת הספירה הוגדרה ל- 47.5 מיקרומטר x 47.5 מיקרומטר (2,256.25 מיקרומטר2) ואורך השלב הוגדר ל- 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר (10,000 מיקרומטר2) (איור משלים 2). לאחר שנקבעו פרמטרי הדגימה, שמור את התבנית ופתח מחדש במהלך הפעלות הניתוח הבאות בשלב 2.7.</li>
	<li>לחץ על התחל לספור (איור משלים 1D). התמקד בחלק העליון של המדגם, לחץ על אישור והתחל לספור.</li>
	<li>השתמש ידית התמקדות לנוע דרך עומק דגימת 10 מיקרומטר ולספור את כל הזקיקים הקדמוניים אשר גרעין ביצית נכנס לפוקוס. לחץ על הבא כדי לעבור לאזור הבא.<ol>
<li>לסווג זקיקים כמו ראשוני אם ביצית מוקף בתאי גרנולוזה קשקשיים (שטוחים), אך ללא תאי גרנולוזה cuboidal (איור 2A). הערה: זקיקים ראשוניים נבדלים מזקיקים בינוניים/מעבריים, הכוללים שילוב של תאי גרנולוזה קובידליים וקבורתיים (איור 2B),וזקיקים ראשוניים, המוקפים בעיקר בתאי גרנולוזה קוביואידיים(איור 2C). יש לכמת מחלקות זקיק אלה בנפרד.</li>
		<li>לספור רק זקיקים שבהם גרעין ביצית גלוי. גרעין ביצית חייב להופיע בתוך מסגרת הספירה או לגעת בקווי ההכללה הירוקים של מסגרת הספירה(איור משלים 1E,F).</li>
		<li>אם גרעין ביצית נופל מחוץ למסגרת הספירה (איור משלים 1G) או נוגע בקווי ההדרה האדומים של מסגרת הספירה, אל תספור זקיק זה.</li>
		<li>בעת הערכת דלדול זקיק ראשוני בתגובה לכימיקל אקסוגני (למשל, כימותרפיה), ודא שכל הזקיקים שנספרו בריאים ולכן יש להם מורפולוגיה נורמלית (איור 2). לספור כל זקיקים חריגים או אטרטיים בנפרד. לעתים קרובות, מוות זקיק הוא המושרה על ידי עלבונות כגון כימותרפיה, וכימות של זקיקי אטרטית צריך להתקבל בנפרד על מנת להבחין בין זקיקים בריאים אטרטיים, כמו רק זקיקים בריאים מרכיבים את שמורת השחלות15.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר השלמת הספירה במקטע זה, בצע אחת מהפעולות הבאות:<ol>
<li>לחץ על הוסף מקטע חדשולאחר מכן חזור לשלב 2.3 כדי להגדיר את המקטע הבא לספירה.</li>
		<li>לחץ על סיימתי לספור כדי לסיים את ההפעלה. להחזיר את המטרה 10x, לצאת התוכנה סטריאולוגיה לכבות את מקור האור, מצלמה, יחידת בקרה מרובה ומחשב.</li>
	</ol></li>
	<li>השג את מספר הזקיק הגולמי (Q) מכל מקטע רקמה שנדגם מהשחלה כולה, ולאחר מכן באמצעות גיליון אלקטרוני, השתמש במשוואה שלהלן כדי לקבל את הערך הסופי מכל בעל חיים משוכפל (N)4. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg">איפה: N = המספר המשוער הכולל של זקיקים בתוך השחלה. Q = ספירת זקיקים ראשונית גולמית. f1 = מרווח דגימה. כל קטעשלישי נדגם <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg"> כך. f2 = קשרי גומלין בין מסגרת הספירה (אזור לדוגמה) לבין צעד, מחושב כ <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg"> . מאז אזור המדגם היה 2256 מיקרומטר2 (47.5 מיקרומטר x 47.5 מיקרומטר) ואת אזור צעד היה 10000 מיקרומטר2 (100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר), <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg"> . f3 = שבר של קטע השחלות שנדגם. מאז 10 מיקרומטר של סעיף 20 מיקרומטר נדגם, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg"> . לכן, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg"> . הערה: פרוטוקול זה מתאר כיצד ליישם עקרונות אלה של ניתוחים סטריאולוגיים באמצעות תוכנה סטריאולוגית מצוטט נרחב (טבלה של חומרים); עם זאת, תוכנה סטריאולוגית אחרת זמינה. העקרונות המיושמים במהלך ניתוחים סטריאולוגיים של זקיקי השחלות זהים, ללא קשר לתוכנה המשמשת להגדרת הפרמטרים. סטריאולוגיה היא המדויקת ביותר כאשר 100 או יותר אובייקטים נספרים בשחלת עכברבוגרת 4, כמו זה נותן מקדם של שגיאה עבור האומדן מתחת 10%16. פרמטרי הדגימה המתוארים כאן עברו אופטימיזציה כדי להבטיח מינימום של כ -100 אובייקטים (כלומר, זקיקים ראשוניים, מעבריים וראשיים) ניתן לספור בשחלות C57BL6J מסוג מבוגרים. מחקר פיילוט יכול להתבצע כולל גודל מדגם קטן כדי לקבוע את פרמטרי הדגימה האופטימליים, כגון מרווח ומספר המקטעים שיש לנתח ומספר הניתוחים האופטיים בתוך הסעיפים שנדגמו17.</li>
</ol>3. הערכת מספר זקיק ראשוני על ידי ספירות זקיק השחלות הישירות
<ol><li>הנח את שקופית המיקרוסקופ בצורה מאובטחת תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי ובצע ספירות ישירות כדי להשיג מספר זקיק ראשוני גולמי.<ol>
<li>לסווג זקיקים כמו הקדמוני אם ביצית גלוי בבירור והוא מוקף בתאי גרנולוזה קשקשיים (שטוחים), אבל אין תאי גרנולוזה cuboidal (איור 2D). הערה: זקיקים קדמוניים נבדלים מזקיקים בינוניים/מעבריים, הכוללים שילוב של תאי גרנולוזה קובידליים וקבורתיים (איור 2E)וזקיקים ראשוניים, המוקפים בעיקר בתאי גרנולוזה קוביואידיים(איור 2F). יש לכמת מחלקות זקיק אלה בנפרד.</li>
		<li>ודא שכל הזקיקים שנספרו בריאים ולכן יש להם מורפולוגיה נורמלית (איור 2). לספור כל זקיקים חריגים או אטרטיים בנפרד, כמו רק זקיקים בריאים להרכיב את השמורה השחלות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחלופין, קח פוטומיקרוגרפים מרובים או תפורים בעוצמה גבוהה (למשל, 20x) של כל מקטע רקמת השחלות כדי לבצע ספירות על-ידי פתיחת קבצי התמונה. ניתן לעשות זאת באופן ידני, או באמצעות סורק שקופיות אוטומטי.</li>
	<li>השג את מספר הזקיק הגולמי (Q) מכל מקטע רקמה שנדגם מהשחלה כולה במרווח שנקבע מראש. הכפל מספר זה בהיפוך של שבר הדגימה כדי להשיג את הערך הסופי עבור כל בעל חיים משכפל (N), באמצעות המשוואה שלהלן. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg">איפה: N = המספר המשוער הכולל של זקיקים בתוך השחלה. ש = ספירת זקיקים גולמיים (מכל סוג בנפרד, מחושב בנפרד). f1 = מרווח דגימה. כל קטע9 נדגם <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg"> כך. לכן, <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg"> .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Mullerian+hormone:+ovarian+reserve+testing+and+its+potential+clinical+implications.">Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications.</a> Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).</li><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary.">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li><li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number.">Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li><li>Ristic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+dexamethasone+treatment+reduces+ovarian+follicle+number+in+neonatal+rat+offspring.">Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring.</a> Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).</li><li>Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+study+on+the+effect+of+vitamin+C+in+preventing+the+adverse+effects+of+bisphenol+A+on+rat+ovary.">Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary.</a> International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+image+analysis+and+its+solution:+unbiased+stereology.">Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).</li><li>Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+methacrylate+sections+devoid+of+lost+caps+simplify+stereological+quantifications+based+on+the+optical+fractionator+design.">Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design.</a> Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PUMA+protects+the+ovarian+reserve+during+DNA-damaging+chemotherapy+and+preserves+fertility.">Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility.</a> Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).</li><li>Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GnRH+antagonist+cetrorelix+reduces+cyclophosphamide-induced+ovarian+follicular+destruction+in+mice.">The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice.</a> Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).</li><li>Winship, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor,+olaparib,+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice:+implications+for+fertility+preservation.">The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction. , (2020).</li><li>Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+depletion+of+primordial+follicular+reserve+in+mice+treated+with+cyclophosphamide:+clinical+importance+and+proposed+accurate+investigative+tool.">Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool.</a> Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-+and+cyclophosphamide-induced+primordial+follicle+depletion+is+caused+by+direct+damage+to+oocytes.">Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes.</a> Molecular Human Reproduction. , (2019).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).</li><li>Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Fractionator+Technique+to+Estimate+Cell+Numbers+in+a+Rat+Model+of+Electroconvulsive+Therapy.">The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).</li><li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Is+the+Number+of+Primordial+Follicles+in+the+Ovarian+Reserve+Established.">How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).</li><li>Omari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcl-1+is+a+key+regulator+of+the+ovarian+reserve.">Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve.</a> Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).</li><li>Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice+and+depletion+is+enhanced+with+age.">Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accurate,+simple+method+for+unbiased+determination+of+primordial+follicle+number+in+the+primate+ovary.">An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary.</a> Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries:+symmetry+and+relationship+with+age.">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li><li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number:+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem.">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li><li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+(STRAW)+staging+system.">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li><li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+reproductive+aging:+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause.">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li><li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach.">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).</li><li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב עבור טכניקת תקן הזהב לספירת זקיקים ראשוניים של העכבר, סטריאולוגיה, ואת השיטה הנפוצה יותר של ספירת זקיקים ישירה. טיפול כימותרפי שימש כדי להשוות ולהשוות את התוצאות שהתקבלו משתי שיטות שונות אלה בתוך השחלה השמאלית והימנית מאותה חיה. שתי השיטות חשפו שונות גבוה...

הביציות הלא בוגרות, שנעצרו באופן מיוטי, המאוחסנות בתוך זקיקים ראשוניים בשחלה, הן יחידת האחסון של הנבט הנשי ומהוות את שמורת השחלות לכל החיים של הפרט. מספרי זקיק ראשוני לרדת באופן טבעי עם גיל1, או לחילופין, יכול להיות מדולדל בטרם עת בעקבות חשיפה לכימיקלים אקסוגני, כולל כמה תרופות רעילים סביבתיים באוויר, מזון ומים2. בהינתן שמספר הזקיק הקדמוני הוא סופי, כמות ואיכות הזקיקים הנמצאים בשחלה קובעות במידה רבה את פוריות הנשית ואת בריאות הצאצאים. לכן, כימות מדויק של מספר זקיק ראשוני אצל נשים חיוני להערכת ההשפעות מחוץ ליעד של עלבונות אקסוגני על עתודת השחלות.
אצל נשים, ניתוח של השחלה כולה הוא בדרך כלל לא אפשרי, ולכן אמצעים פונדקאיים לא פולשניים של עתודת השחלות חייב להיות מנוצל בסביבה קלינית. הורמון אנטי Mϋllerian (AMH) הוא הסמן הביולוגי הפונדקאי הנפוץ ביותר קלינית3. רמות AMH בסרום נמדדות לעתים קרובות אצל נשים בגיל אימהי מתקדם, או לפני ואחרי טיפול בסרטן, כגון כימותרפיה. עם זאת, AMH מופק על ידי זקיקים גדל ולא על ידי זקיקים ראשוניים, ולכן, רמות הסרום אינם מודיעים על מספר זקיק ראשוני מוחלט.
עם היעדר שיטות כדי לקבוע במדויק את מספר הזקיק הקדמוני אצל נשים באתרו, ספירת זקיקי השחלות במודלים בעלי חיים קטנים, כגון מכרסמים, נשאר כלי מחקר חיוני כדי להעריך את המידה שבה עלבונות אקסוגני להשפיע על זקיקים ראשוניים ובכך, פוריות. למרבה הצער, דיווחים לאורך הספרות של מספרי זקיק ראשוניים במודלים מכרסמים הם משתנים מאוד4. סיבה מרכזית לכך היא הבדלים טכניים שדווחו בהרחבה בשיטת הספירה שננקטה. בעיקר, ישנן שתי טכניקות שונות המתוארות בספרות לספירת זקיקים ראשוניים בעכברים. אלה כוללים סטריאולוגיה, אשר משתמשת בשיטת מפרק אופטי שבר, וספירת זקיק ישירה.
סטריאולוגיה נחשבת תקן הזהב כפי שהוא משתמש דגימה אקראית אחידה שיטתית5, מה שהופך אותו השיטה המדויקת ביותר של כימות מספר זקיק ראשוני בעכבר כולו, או שחלותעכברוש 4,6,7. הסטריאולוגיה אינה משוחדת, שכן היא מהווה את המבנה התלת מימדי של מושא העניין8. בשיטת מפרק/שבר אופטי, מוחלות שלוש רמות דגימה כדי לכמת זקיקים ראשוניים באמצעות מקטעי רקמה עבים (למשל, 20 מיקרומטר) בתוך שבר ידוע של השחלה הכוללת של העכבר. ראשית, מרווח הדגימה נבחר (למשל, כל מקטע3) בהתחלה אקראית (דגימת שבר 1, f1)4. לאחר מכן נדגמים חלקים באופן שיטתי ואחיד מנקודה זו דרך השחלה כולה. לאחר מכן, מסגרת ספירה לא משוחדת מודבקת על החלק השחלתי ומוזזת בהדרגה לאורך רשת ספירה מוגדרת ואקראית (דגימת שבר 2, f2)8. לבסוף, חלק ידוע של עובי המקטע נדגם אופטית (למשל, 10 מיקרומטר) וזקיקים בתוך אזור זה נספרים (דגימת שבר 3, f3)4. מספר הזקיק הגולמי מוכפל בהיפוך של שברי דגימה אלה כדי להשיג את הערך הסופי. שיטה זו דורשת הכשרה וציוד מומחים, כולל מיקרוסקופ עם שלב ממונע המונע על ידי תוכנה סטריאולוגית. רקמות צריך להישמר בתיקון של Bouin מיוחד, מוטבע שרף glycolmethacrylate כדי לאפשר מקטעי רקמה עבה להיחתך באמצעות microtome שרף glycolmethacrylate עם סכין זכוכית. שיטה זו נועדה להסביר הצטמקות רקמות ועיוות, כדי לשמר בצורה הטובה ביותר את המבנה המורפולוגי התלת מימדי של השחלה וזקיקים9.
ספירת זקיקים ישירה היא השיטה הנפוצה ביותר לספירת זקיקים10. קיבועים נפוצים יותר (כלומר, פורמלין) ניתן להשתמש, ואחריו הטמעת שעווה פרפין וסעיף סדרתי ממצה באמצעות microtome סטנדרטי בעובי של בין 4-6 מיקרומטר. זקיקים נספרים באופן שיטתי במקטע הרקמה כולו במרווח מוגדר, ולאחר מכן מוכפלים בהיפוך של מרווח הדגימה כדי להשיג את הערכת הזקיק הכוללת. שיטה זו היא מהירה, קלה, ניתן לבצע באמצעות רקמות בארכיון, ומוכן באמצעות טכניקות היסטולוגיות סטנדרטיות. זה דורש רק מיקרוסקופ אור עם יכולות הדמיה סטנדרטיות. עם זאת, למרות יתרונות אלה, ספירת זקיקים ישירה חסרה את הדיוק ואת הפרמטרים ספירה קפדנית של סטריאולוגיה, מה שהופך אותו נוטה יותר הטיה החוקר. בנוסף, רקמות עלולות לעבור הצטמקות ועיוות במהלך העיבוד, לשבש את השלמות והמורפולוגיה של השחלה ובכך להקשות על סיווג זקיק וכימות.
מטרת מאמר זה היא לתאר שתי שיטות נפוצות להערכת כמותית של מספר זקיק ראשוני בשחלות עכבר: סטריאולוגיה וספירת זקיקים ישירה. אנו נספק פרוטוקולים מפורטים לשתי שיטות אלה ונדגיש כמה מהחוזקות והחולשות שלהם, על מנת לשפר את הרבייה בתחום שלנו ולאפשר לחוקרים לקבל החלטה מושכלת של שיטת הספירה המתאימה ביותר למחקריהם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Butanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>#A383-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid alcohol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ACDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#8217;s fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HT10132</td>
			<td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C0768-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ETH</td>
			<td>Ethanol 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td>#FEA-745-SR</td>
			<td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin fixative</td>
			<td>Australian Biostain</td>
			<td>#ANBFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENCS22501GP</td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>#RM2165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycolmethacrylate DPX</td>
			<td>*made in house</td>
			<td></td>
			<td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX50 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#BX50</td>
			<td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &#38; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus immersion oil type-F</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TH4-200 light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#TH4-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#03987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#PERI1%</td>
			<td>Periodic acid 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome CUT 4060</td>
			<td>MicroTec</td>
			<td>#4060R/F</td>
			<td>Used to cut paraffin sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#SCHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s tap water</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#SCOT</td>
			<td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoInvestigator Stereological System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENSF41296SP</td>
			<td>1 mm, 72 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64709003</td>
			<td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 3040 yellow</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64708805</td>
			<td>100 g/80 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

יונקים נקביים המתרבים מינית נולדים עם כל אספקת ביציות לכל החיים שלהם. ביציות לא בוגרות ורגיעה נמצאות בתוך זקיקים ראשוניים, יחידת האחסון של הנבט הנשי. הם אינם מתחדשים, ולכן מספרם בלידה ושיעור האובדן שלאחר מכן מכתיב במידה רבה את תוחלת החיים הפורייה הנשית. כימות מדויק של מספרי זקיקים ראשוניים אצל נשים ובעלי חיים חיוני לקביעת ההשפעה של תרופות ורעילים על שמורת השחלות. כמו כן, יש צורך להעריך את הצורך, ואת ההצלחה של, טכניקות שימור פוריות קיימות ומתפתחות. נכון לעכשיו, אין שיטות קיימות כדי למדוד במדויק את מספר הזקיקים הקדמוניים המרכיבים את עתודת השחלות אצל נשים. יתר על כן, קבלת רקמת השחלות מבעלי חיים גדולים או מינים בסכנת הכחדה לניסויים היא לעתים קרובות לא ריאלי. לכן, עכברים הפכו מודל חיוני עבור מחקרים כאלה, ואת היכולת להעריך מספרי זקיק ראשוני בשחלות עכבר שלמות הוא כלי קריטי. עם זאת, דיווחים על מספרי זקיקים מוחלטים בשחלות העכבר בספרות הם משתנים מאוד, מה שמקשה על השוואה ו/או שכפול נתונים. זאת בשל מספר גורמים, כולל מתח, גיל, קבוצות טיפול, כמו גם הבדלים טכניים בשיטות הספירה המועסקים. במאמר זה, אנו מספקים מדריך הדרכה שלב אחר שלב להכנת מקטעים היסטולוגיים ולספירת זקיקים ראשוניים בשחלות עכבר בשתי שיטות שונות: [1] סטריאולוגיה, המסתמכת על טכניקת מפרק השבר/אופטי; ו[2] טכניקת הספירה הישירה. חלק מהיתרונות והחסרונות המרכזיים של כל שיטה יודגשו כך שניתן יהיה לשפר את השחזור בתחום ולאפשר לחוקרים לבחור את השיטה המתאימה ביותר למחקריהם.

מודל מאופיין היטב של דלדול זקיק שימש, לפיה עכברים נקבה צעירה מבוגרת ניתנו מנה אחת של כימותרפיה ציקלופוספאמיד, או בקרת רכב מלוחים (n = 5 / קבוצה) ושתי השחלות נקצרו מכל בעל חיים לאחר 48 שעות. שחלה אחת לכל חיה הוכנה כמתואר בשלב 1 עבור כל אחת משתי השיטות: סטריאולוגיה או ספירה ישירה. השחלה השמאלית והי?...

Watch this Scientific Journal Video about Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries at JoVE.com

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

כאן, אנו מתארים, להשוות, ולהשוות שתי טכניקות שונות לספירת זקיק מדויקת של רקמות השחלות עכבר קבוע.

ספירה מדויקת של זקיקים בשחלות עכברים למבוגרים

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

accurate-follicle-enumeration-in-adult-mouse-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Views.  Monash University. כאן, אנו מתארים, להשוות, ולהשוות שתי טכניקות שונות לספירת זקיק מדויקת של רקמות השחלות עכבר קבוע.

Video: Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, the ability to determine an embryo&#39;s sex is necessary in many experiments particularly regarding early development. The present protocol demonstrates an inexpensive, rapid and non-toxic preparation of pig genomic DNA for use with PCR. Day 30 embryos must be humanely collected according to the guidelines established by Institutional Animal Policy and Welfare Committees for the present protocol. The preparation of the whole embryo for this PCR based sexing technique simply involves grinding the frozen embryo to a fine powder using a pre-chilled mortar and pestle. PCR-quality DNA is released from a small amount of embryo powder by applying a hot incubation in an alkaline lysis reagent. Next, the DNA solution is mixed with neutralization buffer and used directly for PCR. Two primer pairs are generated to detect specific sex determining region of the Y- chromosome (SRY) and ZFX region of the X- chromosome with high accuracy and specificity. The same protocol can be applied to other elongated embryos (Day 10 to Day 14) earlier than Day 30. Also, this protocol can be carried with 96-welled plates when screening a large number of embryos, making it feasible for automation and high-throughput sex typing.

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

חינם מדויק פנול DNA זיהוי מין של יום 30 חזירים העוברים על ידי PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

שימוש הרומן של בדיקת אולטרה סאונד בתדירות גבוהה תלת מימדי אפיון בתחילת ההריון העכבר

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...