We thank John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O'Brien and Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) and Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) for assistance with tissue acquisition. We also thank the Wisconsin State Laboratory of Hygiene for diagnostic testing services, and Dr. Tonie Rocke and her staff (USGS National Wildlife Health Center) for use of equipment. Any use of trade, product, or firm names is for descriptive purposes only and does not imply endorsement by the U.S. Government.

עבודה בבעלי חיים שנערכו במרכז בטבע הלאומי USGS הבריאות בוצעה בהתאם להנחיות משרד NIH של בעלי החיים במעבדת רווחה ותחת טיפול בבעלי חיים מוסדי ו# פרוטוקול EP080716 ועדת שימוש. רקמות מבעלי החיים שנקטפו-צייד היו מתנות ומיסקונסין או מישיגן מחלקות משאבי טבע. 1. פתרון הכנה הערה: הפתרונות המפורטים להלן נדרשות להכנת מצע assay CER בסעיף 2 להלן. הכן כל אחד מפתרונות אלה מפתרונות מניות ריכוז גבוהים יותר; ריכוזים מומלצים עבור פתרונות מניות יינתנו בסוגריים אחרי כל שם כימי המתאים מופיע ברשימה. הכן את כל הפתרונות הטריים על הכנת מצע ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד שימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למאגר תמוגה, להכין פתרון מאלה ב 10 מ&quot;מ טריס, pH 7.5 (1 M טריס, פתרון 7.5 pH המניה מומלץ): 100 מ&quot;מ שלכלוריד גנות (NaCl, פתרון מניות 1 M), חומצת ethylenediaminetetraacetic 10 מ&quot;מ (EDTA, 500 mM EDTA, pH פתרון מניות 8.0), 0.5% NP-40 (פתרון מניות 10%), deoxycholate 0.5% (DOC, פתרון מניות 10% ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיץ המרה, להכין פתרון של סולפט 0.05% dodecyl נתרן (SDS, 10% מניות פתרון) ו 0.5% Triton X-100 (פתרון 10% מניות) בתמיסת מלח 1 פוספט (PBS, 10, pH פתרון מניות 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרונות chaotropic, להכין שני 3 M פתרונות של hydrochloride guanidine (GdnHCl, 8 M מלאי) ב1x PBS (פתרון המניות 10x). התאם את ה- pH של אחד מהפתרונות ל -3.5 ± 0.05 באמצעות חומצה מרוכזת הידרוכלורית (HCl). בדוק שpH של התמיסה השנייה נשאר בpH 7.4 ± 0.05 ולהתאים באמצעות הידרוקסיד מרוכז HCl או נתרן (NaOH) במידת צורך. </li></ol> 2. הכן זוגות CER Assay מצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג רקמה בריאה, שאינו נגועה TSE-מוח ממינים של ריבית ולהכין 10% נפח משקל לכל(W / v) homogenate במאגר תמוגה באמצעות אחת מהשיטות הבאות: dounce, חרוז-טחנה, או הומוגניזציה מכתש ועלי. לחדד עוד וכתוצאה מכך homogenates על ידי חשיפתם להומוגניזציה מזרק ומחט, באמצעות מחטים של מד הגדלת עד מצע יכול להישאף וגורש בקלות באמצעות מחט מזרק G 27. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למצעים שהוכנו ממכרסמים ויונקים קטנים אחרים, homogenize מוח כולו (ים); למצעים שהוכנו מיונקים גדולים יותר, להשתמש OBEX רקמה (גזע המוח) להכין homogenates. בעת בחירת כמות homogenate המוח, להכין לא יותר מ -50% מהקיבולת של צנטריפוגות משמשת למשקעי חלבון בשלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם האיכות של רקמת המוח רכשה מוטלת בספק, להעריך את רמות PRP C על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblot 17 הכנה מוקדמת למצע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלק homogenate המוח לשני כרכים שווים בצינורות חרוטי נפרדים שכותרתו פלסטיק. להוסיף GdnHCl (3 M פתרונות ב1 PBS) בשני pH 3.5 או 7.4 לכל צינור ביחס של 1: 1 נפח לhomogenate המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את ערכי ה- pH של שני פתרונות. התאם את ה- pH של pH 3.5 המצע לpH ± 0.05 באמצעות HCl המרוכז. להבטיח את ה- pH של המצע האחר נשאר בpH 7.4 ± 0.05 ולהתאים את ה- pH במידת צורך עם HCl או NaOH במידת הצורך. הימנע מהחטאת ערכי pH על ידי תוספת מושכלת של חומצה או בסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב פתרונות במיקסר הסוף-over-הסוף בטמפרטורת חדר (RT) במשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז חלבון על ידי הוספת ארבעה כרכים של מתנול לפתרונות מצע בכל צינור חרוטי, מערבולת לערבב היטב, דגירה ב -20 ° C ל16-18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות משקעים על ידי צנטריפוגה ב× גרם 13,000 למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג בזהירות וזורקי supernatants ולאפשר מתנול להתאדות מהכדורים. השתמש בהחלה מכותנה שקצה כדי לסייע בקליטת מתנול נצמד לחלק הפנימי של הצינור. אל תאפשר כדורים ליותר מ-dry ופעם מתנול הוא כבר לא נראה לעין, להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי חלבון Resuspend במאגר המרה. השתמש בכמות של חיץ ההמרה שווה לכמות חומר התחלת homogenate המוח לוותר לתוך צינור אחד בשלב 2.2. הערה: זה קריטי, כי המאגר משמש להמרת resuspend כדורי חלבון משני pH 3.5 והכנות מצע שטופלו 7.4 הוא הפתרון המוגדר בשלב 1.2 לעיל (המכיל רמות נמוכות של חומרי ניקוי וpH פיסיולוגי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות בקצרה sonicate מצע בsonicator cuphorn (10 שניות ב ~ 30% כוח מרבי), aliquot לתוך 0.5-1.0 מיליליטר כרכים בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge שכותרת. בצע immunoblot בקרת איכות (שלב 2.9) על aliquot של כל מצע. אחסן aliquots האחר ב -80 ° C עד מוכן לבצע assay CER (סעיף 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בקרת איכות על זוגות מצע CER לפני השימוש (איור 2). צעדים אלה להבטיח כי מצעי CER יהיו providתוצאות אופטימליות דואר בלימודי גיור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח כמויות דומות של PRP C בשני מצעים. להשוות רמות PRP ב10-25 μl של כל מצע על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblotting 17. אם רמות החלבון בpH 7.4 ו -3.5 מצעים נמצאים ב~ 10% של כל אחד אחר, זוגות המצע מתאימים לשימוש במחקרי CER. הערה: immunoblots PRP לא צריך להראות ראיות של השפלה PRP C הנרחבת. Immunoreactivity PRP צריך להיות בעיקר&gt; 20 kDa. להקות פחות ממסה מולקולרית זה יכול להיות מוצרים פגומים. דפוסי פסים צריכים להיות שווי ערך פחות או יותר בין זוגות מצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כC PRP בשני מצעים צריך להיות PK רגיש, טיפול 10-25 μl של כל מצע עם PK בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ולעכל דגימות ב 1000 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בתרם-אכר. להעריך כל אות PRP שנותר על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblotting 17.מצעים עם מיל PRP אינם מתאימים לשימוש במחקרי CER. </li></ol></li></ol> 3. להכין זרעי TSE סוכן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג רקמת מוח נגוע TSE ממינים של ריבית ולהכין 10% (w / v) homogenate ב1x PBS pH 7.4 באמצעות השיטות מפורטות בשלב 2.1 לעיל. הערה: זרעים גם יכולים להיות מיוצרים מרקמות נגועים TSE אחרות מחוץ למערכת העצבים המרכזית, לעומת זאת, יעילות ההמרה של מצעי המוח מפיק זרעים נגזרים מרקמות היקפי נגועים TSE טרם הוערכה באופן ניסיוני בספרות שפורסמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot וכתוצאה מכך homogenate (ים) לתוך 100-300 כרכי μl בצינורות 0.5 מיליליטר microcentrifuge וחנות ב -80 ° C עד מוכן לבצע את assay CER. </li></ol> Assay 4. CER הערה: assay CER כרוך תוספת של כמות קטנה יחסית של PRP TSE (הניתנת ב&quot; הזרע &quot;) ממין אחדלעודף יחסי של PRP C (הניתן במוח נגוע &quot;המצע&quot;) ממין אחר שכבר מפוגל באופן חלקי בשני pH 3.5 או 7.4. בעקבות תקופת דגירה ממושכת רועדת, המרה מונעת תבנית של PRP C על ידי PRP TSE בכל תגובה מוערכת על ידי אות densitometric של PRP מיל שנותר לאחר עיכול PK וזיהוי immunoblot. השוואת רמות מיל PRP במצעים המפוגלים בעבר ב- pH 3.5 לעומת 7.4 מספקת מדד של מחסום המינים. סקירה ניסיונית של הליך assay זה מסופקת באיור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט להפשיר זוגות מצע CER נגוע (assay דורש כמויות שווה של מצעים המפוגלים בעבר בשני pH 3.5 ו -7.4) ופתרונות זרע TSE נגועים על ידי הצבת אותם על גבי מצע של קרח (כ זמן הפשרה 1 שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהפשיר באופן מלא, ולאחר מכן לשאוב לגרש כל פתרון מצע דרך27 כמה פעמים מחט מזרק G מחדש homogenize זה. בקצרה sonicate כל פתרון זרע נגוע TSE במשך 10 שניות ב ~ 30% כוח מקסימאלי. שמור את כל הפתרונות על קרח בעת הכנת תגובות המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית 5 צינורות בודדים נמוכים מחייב, דק דופן PCR לסוכן TSE נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תגובות גיור בצינורות אלה על ידי הוספת 5 μl של 10% פתרון זרע TSE נגוע עד 95 μl של (א) מצע CER מוכן בpH 7.4 ו- (ב) מצע CER מוכן ב- pH 3.5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימת ניסוי, להכין תגובות מקבילות בזוגות מצע CER המפוגלים בעבר בשני pH 3.5 ו -7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל יחסים של זרע סוכן TSE למצע מוח נגוע באמצעות קביעה אמפירית. Common זרעים: יחסי מצע המועסקים לשמור על סך נפח תגובה של 100 μl וכוללים 1:99 μl, 2:98 μl ו5:95 μl. עבור מרבית היישומים, זרע 5:95 μl: יחס מצע הנפח מתאים והוא מה שמוצג בההוא פרוטוקול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלוש דגימות בקרה לסוכן TSE נבדקות באופן הבא: (א) להוסיף 5 μl של 10% פתרון זרע TSE הנגוע לחיץ המרה 95 μl כביקורת למיל PRP קלט; להוסיף למאגר המרה 5 μl 95 מצע μl מוכן בpH (ב) 3.5 pH ו( ג) 7.4 כפקדים לגיור שאינו ספציפי, שאינה בתבניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת מדגם זה בצינור PCR הסגור שלה כדי לערבב זרע ומצע היטב. פעל עם דופק רגעי במיני-צנטריפוגה גבי ספסל במהירות נמוכה כדי להסיר כל נפח של תערובת התגובה לכודה במכסה צינור PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טען בצינורות PCR בנפרד כותרת לתרם-אכר העליון ספסל מצויד לקבל צינורות PCR. Shake דגימות ב 1000 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טלטול, להוסיף sarkosyl לריכוז סופי של 2% (w / v) וPK לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר. דגימות Digest ב 1000 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בתרם-אכר. NOTE: תוספת של sarkosyl לדגימות עזרים שלאחר המרה בעיכול PK של PRP C. אותות חיוביים כוזבים בדגימות unseeded (שלב 4.5) בוטלו כמעט על ידי תוספת של sarkosyl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ מדגם SDS-PAGE, דגימות חום עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולפתור מיל PRP שנותר בכל דגימה על ידי SDS-PAGE 16 ואחרי 17 immunoblotting. הערה: לאחר תוספת של חיץ מדגם וחימום, דגימות עשויה להיות מעובד או ניתן לאחסן דגימות ב -20 ° C או -80 ° C לפני immunoblotting מייד. כל הנתונים שהוצגו כאן היו שנוצרו באמצעות מערכות ג&#39;ל והעברת Novex NuPAGE. דוגמאות בודדות מassay CER טופלו במאגר מדגם וצמצום סוכן על פי הוראות יצרן. דגימות היו מחוממות לאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו -30 μl של כל דגימה היה עמוסה לג&#39;לי טרומי bis-טריס 12%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את יחס יעילות המרה (CER) כאמצעישל מחסום מינים. רמות מדד מיל PRP על ידי צפיפות 17 ולחלק את הצפיפות הכוללת של מדגם pH 7.4 ידי שמדגם 3.5 pH. להכפיל ב -100 לייצר אחוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתונים ממשכפל ניסיוני עצמאי כדי ליצור CER סטיית תקן ממוצע ± למינים עם סוכן TSE נתון. </li></ol>

<ol>
	<li>Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833 (2011).</li><li>Hill, A. F., Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+strains+and+species+barriers.">Prion strains and species barriers.</a> Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).</li><li>Scott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+hamster+prion+protein+produce+species-specific+scrapie+infectivity+and+amyloid+plaques.">Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques.</a> Cell. 59 (5), 847-857 (1989).</li><li>Prusiner, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenetic+Studies+Implicate+Interactions+between+Homologous+Prp+Isoforms+in+Scrapie+Prion+Replication.">Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication.</a> Cell. 63, 673-686 (1990).</li><li>Telling, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+Propagation+in+Mice+Expressing+Human+and+Chimeric+Prp+Transgenes+Implicates+the+Interaction+of+Cellular+Prp+with+Another+Protein.">Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein.</a> Cell. 83, 79-90 (1995).</li><li>Hill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+same+prion+strain+causes+vCJD+and+BSE.">The same prion strain causes vCJD and BSE.</a> Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).</li><li>Torres, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+modulating+the+prion+species+barrier+and+its+passage+consequences.">Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences.</a> PLoS One. 9 (3), e89722 (2014).</li><li>Groschup, M. H., Buschmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+for+prion+diseases.">Rodent models for prion diseases.</a> Vet Res. 39 (4), 32 (2008).</li><li>Korth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abbreviated+incubation+times+for+human+prions+in+mice+expressing+a+chimeric+mouse-human+prion+protein+transgene.">Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).</li><li>Kocisko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+specificity+in+the+cell-free+conversion+of+prion+protein+to+protease-resistant+forms:+a+model+for+the+scrapie+species+barrier.">Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).</li><li>Raymond, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+molecular+barrier+limiting+susceptibility+of+humans,+cattle+and+sheep+to+chronic+wasting+disease.">Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease.</a> EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).</li><li>Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+the+transmission+barrier.">In vitro studies of the transmission barrier.</a> Prion. 3 (4), 220-223 (2009).</li><li>Zou, W. Q., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+detergents+enhance+in+vitro+conversion+of+human+brain+PrPC+to+a+PrPSc-like+form.">Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form.</a> J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).</li><li>Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+barriers+for+chronic+wasting+disease+by+in+vitro+conversion+of+prion+protein.">Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).</li><li>Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+prion+protein+conversion+suggests+risk+of+bighorn+sheep+(Ovis+canadensis)+to+transmissible+spongiform+encephalopathies.">In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies.</a> BMC Vet Res. 9, 157 (2013).</li><li>Chandler, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalopathy+in+mice+produced+by+inoculation+with+scrapie+brain+material.">Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material.</a> Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).</li><li>Browning, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+prions+from+mule+deer+and+elk+with+chronic+wasting+disease+to+transgenic+mice+expressing+cervid+PrP.">Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP.</a> J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).</li><li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+infection+of+sheep+and+goats+with+transmissible+mink+encephalopathy+virus.">Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus.</a> Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).</li><li>Rubenstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+surveillance+and+antigen+conformation+determines+humoral+immune+response+to+the+prion+protein+immunogen.">Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen.</a> J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).</li><li>Castilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+species+barrier+by+PrP(Sc)+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions.">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134 (5), 757-768 (2008).</li><li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).</li><li>Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quaking-induced+conversion:+a+highly+sensitive+assay+for+prion+detection.">Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection.</a> Prion. 5 (3), 150-153 (2011).</li><li>Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaking+Alone+Induces+De+Novo+Conversion+of+Recombinant+Prion+Proteins+to+beta-Sheet+Rich+Oligomers+and+Fibrils.">Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils.</a> PLoS One. 9 (6), e98753 (2014).</li><li>Mathiason, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease.">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li><li>Seelig, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lesion+Profiling+and+Subcellular+Prion+Localization+of+Cervid+Chronic+Wasting+Disease+in+Domestic+Cats.">Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats.</a> Vet Pathol. , (2014).</li><li>Stewart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predictions+of+prion+disease+susceptibility+in+carnivore+species+based+on+variability+of+the+prion+gene+coding+region.">Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region.</a> PLoS One. 7 (12), e50623 (2012).</li><li>Russell, W. M., Burch, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , (1959).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

לסיום מוצלח של פרוטוקול זה, יש לשים לב לרמות PRP C ברקמות מוח נגוע משמשות להכנת מצע (שלב 2.1.2) והזרע למצע יחס לתגובות המרה (שלב 4.4.2). מניסיוננו, ניתן לחלץ את המוח לשימוש כמצע CER לאחר נתיחה שלאחר מות תקופה משמעותית, כל עוד PRP C נמצא על ידי immunoblotting (איור 4). למ?...

&quot;ספגות מוח מדבק (TSEs, מחלות פריון) הוא קבוצה של מחלות ניווניות קטלניות עם תקופות דגירה ממושכות המשפיעות על מגוון רחב של בעלי חיים ובני אדם. סוכן etiological המשוער של TSEs מורכב מהאיזומר misfolded של חלבון פריון מארח (PRP), כי הוא מסוגל התפשטות עצמית על ידי המרה מונעת תבנית של הטופס הסלולרי הרגיל של PRP (PRP C) ל, הקשורים למחלות זיהומיות טופס (PRP TSE) המצטבר ברקמות מערכת עצבים מרכזיות של המארח הנגוע 1. פריונים יונקים זיהומיות בדרך כלל להעביר ממארח ​​למארח באופן מינים ספציפיים, דבר שהוביל לרעיון של &quot;מחסום מיני TSE&quot; הגבלת אירועי שידור interspecies 2. הגורמים הביולוגיים של מחסום מיני פריון אינם מובנה היטב. דמיון רצף חומצות האמיניות בין PRP TSE זיהומיות והמארח ג PRP Cמאוד משפיע אם הגיור מתקיים 3-5, אבל נשאר מספיק כדי להסביר את כל אירועי שידור הפריון נצפו in vivo 6,7. לפיכך, אפיון חסמי מיני TSE הסתמך במידה רבה על מחקרים בבעלי החיים אתגר: חשיפת בעלי חיים תמימים ממין נתון לפריונים מאחרים ומדידת זמן דגירה וכתוצאה מכך להתפרצות מחלה ושיעור התקפת כאינדיקטורים של יעילות העברת. עכברים להביע PRP C ממיני Heterologous משמשים גם לסוג זה של מחקר 8. העלויות כרוכות בייצור מהונדס עכבר וbioassays פריון הממושך, כמו גם שיקולים אתיים של שימוש בבעלי חיים, הם מכשולים בדרך לחקירה ניסויית של מחסומי מיני TSE. הערכה של מכשול המין האנושי לTSEs מסתמכת על עכברים שהונדסו אדם PRP C. עכברים אלה דורשים תקופות דגירה ארוכות להיכנע לTSEs או שינויים כדי לא אנושייםהוא מולקולת PRP C בבני אדם למחלה מהירה תחילת 9. תקופות דגירה לTSEs לא אנושי בעכברים אלה עשויות להאריך את תוחלת החיים מעבר לעכבר הרגיל עושה פרשנות של תוצאות שליליות מאתגרות. פרימטים שאינם בני אדם יש גם שימשו כשליחים ללימוד מחסומי מין אנושיים, אך מחקרים אלה הם טומנים בחובה אותם האתגרים כמו סוגים אחרים של ניסויים בבעלי חיים וקופים שאינם בני אדם עשוי שלא בדיוק לשחזר מחלה כפי שהוא ממשיך במארח האנושי. bioassays בעלי החיים יישאר בשיטה &quot;תקן זהב&quot; למדידת הרגישות של מינים לTSE, אבל המכשולים, העלויות והאתיקה של מחקרים בבעלי החיים חיים אלה אילצו את חקירת חלופות. מספר מבחני במבחנה, המבוססים על הערכת ההמרה של מארח PRP C לproteinase K (PK) מדינת -resistant (מיל PRP) כאשר שנזרעו על ידי PRP TSE, פותחו ושימוש כדי לחקור sp TSEמחסומי ecies 10-12. דוגמאות למבחנים במבחנה כוללות מבחני תא ללא המרה, חלבון misfolding הגברה מחזורית (PMCA), ויחס יעילות המרת assay (CER) 10-14. למרות שאף אחד ממבחנים אלה לקחת בחשבון גורמים היקפיים המעורבים במחסומי מינים לאחר הדבקה טבעית, כולם יכולים להיות שימושיים כדי לזהות מארחים פוטנציאליים רגישים לTSEs. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור assay CER, שבו שני מצעי PRP C מפוגלים נגזרים מhomogenates המוח הנורמלית משמשים בתגובות המרת פריון העליונה ספסל (איור 1) 13. PRP C במצע המפוגל ב- pH 7.4 ניתן להמיר רק למיל PRP ידי PRP TSE זורעים לתוך התגובה בהיעדר מחסום מינים 14. בניגוד לכך, denaturation של PRP C במצע האחר ב- pH 3.5 מאפשר לה להיות מומר לדגירה הבאה מיל PRPעם PRP TSE מכל מינים ומשמש כביקורת לגיור. יחס ההמרה של PRP C למיל PRP בpH 7.4 ביחס מצע לזה של מצע 3.5 pH מספק מדד של מחסום המינים. מצאנו כי assay CER מנבא ידוע מחסומי מינים של עכברי מעבדה לTSEs השונים והשתמש assay במאמצים כדי לחזות את מחסום המינים של מינים רבים של יונקים, כוללים איל בר, למחלה כרונית לבזבז (CWD) וTSEs האחר 14, 15. חוקרים מעוניינים בכלי המאפשר סינון מהיר של מחסומים או הערכה של המרת PRP C מיל -כדי-PRP מיני TSE ימצא מתודולוגיה זו שימושית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:205px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:287px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">12% Bis-Tris SDS-PAGE gels</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td style="width:205px;">Next Advance</td>
			<td style="width:157px;">ZROB05&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Other varieties of beads are also effective</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:296px;">Antibodies</td>
			<td style="width:205px;">various suppliers</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;">Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bead homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Next Advance</td>
			<td style="width:157px;">BBY24M</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:157px;">369434</td>
			<td style="width:287px;">High speed with temperature control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:205px;">any brand</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cotton-tipped applicator</td>
			<td style="width:205px;">Uline</td>
			<td style="width:157px;">S-18991</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Cuphorn sonicator</td>
			<td style="width:205px;">Heat Systems-Ultrasonics</td>
			<td style="width:157px;">W-380</td>
			<td style="width:287px;">Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:296px;">Densitometry software program</td>
			<td style="width:205px;">UVP</td>
			<td style="width:157px;">Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software</td>
			<td style="width:287px;">Other programs, such as NIH ImageJ, will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:157px;">885300</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">End-over-end mixer</td>
			<td style="width:205px;">Labnet International</td>
			<td style="width:157px;">H5600</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetra acetic acid</td>
			<td style="width:205px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:157px;">P-770</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine hydrochloride, 8M</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">24115</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating block</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">11-718</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">435570</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: strong acid</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4X</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0008</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin &#38; respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Methanol</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">A454-4</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:205px;">any brand</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-centrifuge</td>
			<td style="width:205px;">Labnet International</td>
			<td style="width:157px;">C1301</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">L-5125</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:205px;">Amresco</td>
			<td style="width:157px;">M158</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin irritation, eye damage</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:296px;">SDS-PAGE gel system</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NuPAGE electrophoresis system</td>
			<td style="width:287px;">Other SDS-PAGE systems will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">PCR tubes (low-binding)</td>
			<td style="width:205px;">Axygen</td>
			<td style="width:157px;">PCR-02-L-C</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Pestle homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">03-392-106</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">pH meter</td>
			<td style="width:205px;">Sentron</td>
			<td style="width:157px;">SI600</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyvinyldifluoride membrane</td>
			<td style="width:205px;">Millipore</td>
			<td style="width:157px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:157px;">V3021</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin &#38; eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:296px;">Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10X</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0009</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">D6750</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">28364</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">S5881</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemica; strong base</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Syringe</td>
			<td style="width:205px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:157px;">various</td>
			<td style="width:287px;">Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Syringe needles</td>
			<td style="width:205px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:157px;">various</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Thermoshaker (PCR tube shaker)</td>
			<td style="width:205px;">Hangzhou All Sheng Instruments</td>
			<td style="width:157px;">MS-100</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Tris base</td>
			<td style="width:205px;">Bio Basic&#160;</td>
			<td style="width:157px;">77-86-1</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:205px;">Integra Chemical Company</td>
			<td style="width:157px;">T756.30.30</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Vortexer</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">12-812</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing transmissible spongiform encephalopathy species barriers with an in vitro prion protein conversion assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

שימוש מוצלח של assay CER תלוי במידה רבה על האיכות של זוגות המצע המשמשים בתגובות המרה. מסיבה זו, בעקבות הליכים להכין זוגות מצע CER, immunoblot בקרת איכות צריכה להתבצע (איור 2). עבור שני מצעים, assay 10-25 μl על ידי immunoblotting. PRP C צריך להיות בקלות לזיהוי בכל מצע ורמות PRP C ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay at JoVE.com

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay המרת חלבון הפריון

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

assessing-transmissible-spongiform-encephalopathy-species-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

7.7K Views.  USGS National Wildlife Health Center. Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Video: Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

בידוד של oligomers PRP המסיס ובלתי מסיס במוח האנושי הרגיל

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

הדמיית הלבלב Neuroplasticity:<em&gt; במבחנה</em&gt; Dual-נוירון פלסטיות Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

דגם חזרזיר של ילודים חוסר חמצן-איסכמי אנצפלופתיה

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best advance translational objectives and uncover new therapeutic strategies for brain injury associated with preterm birth, preclinical models of EoP must include similar mechanisms of prenatal global injury observed in humans and involve multiple components of the maternal-placental-fetal system. Ideally, models should produce a similar spectrum of functional deficits in the mature animal and recapitulate multiple aspects of the pathophysiology. To mimic human systemic placental perfusion defects, placental underperfusion and/or chorioamnionitis associated with pathogen-induced inflammation in early preterm birth, we developed a model of prenatal transient systemic hypoxia-ischemia (TSHI) combined with intra-amniotic lipopolysaccharide (LPS). In pregnant Sprague Dawley rats, TSHI via uterine artery occlusion on embryonic day 18 (E18) induces a graded placental underperfusion defect associated with increasing CNS damage in the fetus. When combined with intra-amniotic LPS injections, placental inflammation is increased and CNS damage is compounded with associated white matter, gait and imaging abnormalities. Prenatal TSHI and TSHI+LPS prenatal insults meet several of the criteria of an EoP model including recapitulating the intrauterine insult, causing loss of neurons, oligodendrocytes and axons, loss of subplate, and functional deficits in adult animals that mimic those observed in children born extremely preterm. Moreover, this model allows for the dissection of inflammation induced by divergent injury types.

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

דוגמנות אנצפלופתיה של פגות שימוש בהריון היפוקסיה-איסכמיה עם lipopolysaccharide Intra-השפיר בחולדות

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key element is the quantitative determination of a tumor-specific genetic alteration in relation to a universal sequence using a dual-probe digital PCR assay and the subsequent calculation of the proportion of tumor cells. The assay is carried out on a culture containing tumor cells of an established line and spiked-in non-tumor cells. The mixed culture is treated with a test drug at various concentrations. After the treatment, DNA is prepared directly from the survived adhesive cells in wells of 96-well plates using a simple and inexpensive method, and subjected to a dual-probe digital PCR assay for measuring a tumor-specific genetic alteration and a reference universal sequence. In the present demonstration, a heterozygous deletion of the NF1 gene is used as the tumor-specific genetic alteration and a RPP30 gene as the reference gene. Using the ratio NF1/RPP30, the proportion of tumor cells was calculated. Since the dose-dependent change of the proportion of tumor cells provides an in vitro indication for specificity of the drug, this genetic and cell-based in vitro assay will likely have application potential in drug discovery. Furthermore, for personalized cancer-care, this genetic- and cell-based tool may contribute to optimizing adjuvant chemotherapy by means of testing efficacy and specificity of candidate drugs using primary cultures of individual tumors.

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

The goal of this protocol is to assess specificity of anticancer drugs in vitro using mixed cultures containing both tumor and non-tumor cells.

הערכה ספציפית של תרופות נגד הסרטן<em&gt; במבחנה</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...