This work was performed under the auspices of the U.S. Department of Energy by Lawrence Livermore National Laboratory under Contract DE-AC52-07NA27344, and partially supported by LLNL&#8217;s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) program, 14-LW-077. The authors thank Michael Wilson, Mark Stenglein and Joe DeRisi at the Univeristy of California, San Francisco for generously providing GGV and Boa cell samples. EJF acknowledges support from the LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS acknowledges support from the UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

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The authors have nothing to disclose.

Este protocolo apresenta a integração em nível de sistema de dispositivos microfluídicos para equipamentos macroescala para executar o processamento automatizado amostra biológica. A modularidade desta plataforma permite que ele seja adaptável a qualquer dispositivo de fluxo contínuo, e, como um exemplo, o protocolo apresentado incide sobre a caracterização e optimização do desempenho de um dispositivo de separação de partículas acoustofluidic. Três grandes vantagens deste protocolo se destacam: (i) a modularidade e chip-to-world interface, (ii) caracterização robusta do desempenho do dispositivo, e (iii) tratamento automatizado de volumes de amostra precisamente calibrada para a separação de partículas. Eu. Modularidade e chip-to-world interface Como mostrado na Figura 2, o chip de microfluidos é montado sobre uma placa de ensaio personalizado para se adaptar facilmente para um estágio de microscópio de observação directa. A placa de ensaio contém # 6-40 UNF furos rosqueados em uma grade de 5 mm de passo, enabling do chip a ser protegido, e ligações de fluido a ser feita. As ligações de fluido são tubos PEEK com extremidades maquinadas, os quais vedam contra o chip fluídica com uma junta de vedação de borracha rosto e um colar de aço inoxidável. Este esquema interface torna fácil para a substituição chip e rápido redesenho dispositivo, exigindo poucas ou nenhumas alterações em outros componentes do sistema, pegadas de chips fornecidos estão de acordo com o formato da grade. Por exemplo, temos usado essa plataforma com chips microfluídicos para eletroforese de fluxo contínuo, a lise celular térmica, 29 rápido mistura de reagentes para a síntese química, e captura de uma única célula e interrogatório. II. Caracterização robusto de desempenho do dispositivo A fim de optimizar o rendimento de qualquer dispositivo de separação de microfluidos, o seu funcionamento deve primeiro ser completamente caracterizado. O sistema descrito aqui apoia o desenvolvimento de protocolos rápidos e automatizados para fazer isso. Para o examp específicale de dispositivos acústicos, focando a qualidade focando, freqüência de operação e posição das partículas focados no canal microfluídico devem ser medidos para cada dispositivo individual. Estas medições exigem que varre através de uma gama de frequências de accionamento piezocerâmico, tensões e as taxas de fluxo, para identificar as combinações de parâmetros óptimos para a separação de alta qualidade. O protocolo apresentado varia automaticamente esses parâmetros ajustáveis ​​e captura o relevante de dados ou seja, imagens fluorescentes de partículas fluindo no canal que são pós-processados ​​para gerar as medições necessárias de partícula com foco qualidade, frequência e posição (Figura 3). Caracterização completa do desempenho do dispositivo acústico exige repetir os passos 4.4 e 4.5, conforme necessário sob diferentes condições experimentais. Por exemplo, a posição de focagem absoluta de um chip é encontrado através da execução do varrimento de frequências com taxas relativamente baixas de fluxo e de alta tensãos para assegurar a migração completa para o local do nó. Além disso, essas varreduras de frequência podem avaliar a qualidade da montagem do dispositivo (quando executado com esferas de poliestireno de tamanho conhecido), ou para determinar como um tipo de partícula anteriormente desconhecido vai se comportar no sistema (após um chip tem sido caracterizada com contas). Um chip com boa transferência de energia do piezocerâmico ao canal microfluídico irá resultar em apertado concentrando a taxas de fluxo elevadas (&gt; 1 mL / min) e as tensões baixas (12-15 V pp), enquanto aqueles com baixa transferência de energia não incidirá mesmo a caudais baixos (&lt;100 ul / min) e altas voltagens (&gt; 20 V PP). Verificou-se que o contacto íntimo entre o chip de microfluidos e o piezocerâmico é crítica para a transferência eficiente de energia para o fluido. Outras investigações do melhor método de ligação do chip microfluídico eo piezocerâmico vai permitir a produção confiável de dispositivos de alto desempenho. Finalmente, uma completaimagem de operação de um dispositivo de acoustophoretic pode ser obtido através da combinação das medições de varrimento de frequências com base em imagens do passo 4 (e na Figura 3) com a contagem de partículas recolhidas a partir da SPO e LPO como funções dos parâmetros de funcionamento relevantes, a partir de experiências de separação realizadas com microesferas , tal como descrito no Passo 5. Como mostrado na Figura 6, uma tal série de experiências automatizados pode caracterizar-se rapidamente e tunability desempenho de um dispositivo individual, informando o utilizador do espaço de parâmetros óptima para operar o dispositivo para a separação das partículas. iii. Processamento de pequena amostra automatizado de separação de partículas Para o processamento da amostra baseada no chip microfluídico bem sucedida e precisa, é fundamental de forma confiável e com precisão do medidor, de carga, entregar e recolher os volumes de fluido à medida que passam. Esta precisão é especialmente importante quando o volume da amostra é pequeno(~ 0,1-1 ml), que é comum em ambientes laboratoriais clínicos ou de investigação. 30 manuseamento da amostra é preciso um desafio, em experiências de microfluidos tradicionais que empregam retirada manual da amostra dentro de uma seringa e a perfusão num dispositivo sem realimentação de quando a amostra tem sido separados e quando ele deve ser recolhido. O protocolo apresentado emprega automatizado amostra bobina de carga e distribuição juntamente com feedback em tempo real a partir de sensores de fluxo para permitir separações reprodutíveis de pequenos volumes de amostras. A Figura 5 mostra os perfis de fluxo medidos no SPO e LPO a partir de uma experiência típica de separação. Em primeiro lugar, levando tampão de pelo menos 35 uL é carregado para assegurar um fluxo estável antes de a amostra atinge o chip acústico. Os volumes de amostra inferiores a 100 uL não são recomendados para esta configuração do sistema, porque a diluição da amostra em função do tampão levando se torna excessiva. Um bujão de ar é utilizada no início do the o tampão de injecção antes levando a separar o bloco de amostras de fluido a partir do que se segue, impedindo a mistura e diluição da amostra e servindo como um indicador para os sensores de fluxo. Depois de um transiente inicial como fluido começa a se mover através do sistema, os sinais de aumento acentuado em ambos os outlets indicar a passagem da primeira bolha de ar. Estes transientes são seguidos por um longo período de fluxo estável como a amostra flui através do sistema, em seguida, um outro ponto quando a segunda bolha de ar passa, e, finalmente, uma eventual redução na taxa de fluxo para zero após a paragem da bomba de seringa. A passagem dos plugues de ar através dos sensores de fluxo é usado como pontos de gatilho para alternar as válvulas para iniciar e parar a coleta de amostras, minimizando, assim, amostra perdida e diluição por volumes de fluido não-amostrais. Medição de circuito fechado de volumes de amostra transformados elimina a necessidade de re-programar estes valores antes do início da experiência, cada vez que a amostra de entrada é alterada. Esse recurso éparticularmente importante quando o volume de amostra é limitado, por exemplo, no caso de muitas amostras clínicas. Monitoração do caudal em tempo real também auxilia na solução de problemas; um funcionamento pobre (por exemplo, formando uma obstrução num dos pontos de venda) é imediatamente evidente a partir dos perfis de fluxo resultantes, como na Figura 5b. Para demonstrar a flexibilidade e eficácia da separação acoustofluidic usando a arquitetura do sistema apresentado, DENV purificado e os lotes de vírus GGV foram incrementadas em ações celulares e separados por transformação através do chip microfluídico. Figura 7a mostra que as células Raji foram bem-separada do vírus, como 97 % de células Raji que saem do chip foram consideradas no POT, deixando assim uma amostra altamente enriquecida de DENV na SPO. Em comparação, a eficiência de separação foi DENV inferior, com 70% de DENV sair do chip encontrado na SPO. Isto pode ser atribuído a uma ligeira mistura convectiva induzida por as espiras do separatino canal, mas é mais provável que algumas partículas DENV migram juntamente com as células de Raji na LPO. As células que migram através de linhas de corrente arrastar lateralmente algum fluido com eles, mesmo a baixo número de Reynolds. Por este mecanismo, assim como a superfície de adsorção não específica, de partículas virais pode transferir para a LPO. No entanto, a amostra altamente enriquecida de DENV na SPO é um benefício significativo, por exemplo, quando de novo a sequenciação é utilizado para detectar e identificar vírus. A Figura 7b mostra que, em um ensaio experimental, apenas cerca de 70% de células Boa que saem do chip foram encontrados no POT, em comparação com cerca de 100% de eficiência de separação de células Raji. A diferença de desempenho separação entre os dois tipos de células pode ser atribuível a uma dimensão média menor ou uma menor densidade de células Boa em comparação com células de Raji, por conseguinte, resultando em forças acústicas menores. Para confirmar ou refutar essas suposições, o tamanho, a densidade e morfologia de BoaAs células em suspensão (que normalmente crescem aderentes) das células Boa devem ser medidos com exactidão, num esforço para uma investigação mais aprofundada. Nas mesmas experiências, de modo semelhante às experiências com DENV, a maior parte do GGV recuperado saiu da SPO, indicando um enriquecimento da fracção viral. Os dados apresentados destacam os desafios inerentes de engenharia plataformas amplamente aplicável para o processamento de uma variedade de amostras biológicas. Importante, as interações biológicas pode começar a desempenhar um papel tão grande como os efeitos físicos e mecânicos. No entanto, esses experimentos preliminares também demonstram o poder ea promessa de usar esta arquitetura de sistema para o processamento da amostra em aplicações clínicas e de pesquisa. Como um sistema robusto, bem caracterizada engenharia, esta plataforma oferece a capacidade de procurar respostas para novas perguntas científicas.

Amostra separação e fracionamento é uma das áreas mais promissoras da aplicação de tecnologias microfluídicos. Tais etapas de manipulação de amostras são essenciais para o diagnóstico eficazes clínicos, desenvolvimento de terapêutica, os esforços biosurveillance e progresso na pesquisa de ciências da vida e tecnologia. A miríade de estratégias de separação de microfluidos foram demonstradas para as partículas suspensas e colóides de líquido, bem como para as espécies químicas e biológicas; vários comentários fornecem visões gerais dos progressos recentes e os desenvolvimentos nestes domínios 1 - 9. Embora muitas dessas tecnologias de separação microfluídicos (doravante referidos como &quot;dispositivos de núcleo&quot;) têm sido amplamente caracterizada, alguns relatórios têm considerado o problema da separação da amostra a nível de sistema. Os dispositivos de núcleo são tipicamente fritas centímetro escala individuais, interligados à tubulação fluoropolímero, com fluido entregue por uma bomba de deslocamento ou pressão.No entanto, se a promessa de microfluídica - incluindo uma maior automatização, confiabilidade e redução de volumes de amostra - é tornar-se realidade, pelo menos, um esforço equivalente deve ser dedicada à concepção de um sistema de separação completa em que o dispositivo de núcleo é integrado . Além disso, um grande desafio para abordagens microfluídicos para biodetection é a macro a micro interface. Isto refere-se não só às conexões físicas de um dispositivo microfluídico para componentes macroescala &quot;mundo-a-chip&quot;, e à incompatibilidade entre os volumes típicos de amostra clínica ou analítica (~ 0,1-10 ml) e o volume interno de chips microfluídicos (~ 0,01-10 ul), mas também para as limitações de amostragem estatísticos que derivam de colmatar essas escalas de tamanho. Estas questões contribuem para a percepção de que a amostra de pré-processamento e preparação são o &quot;elo mais fraco&quot; do biodetection. 10 A plataforma descrito neste trabalho taKES grandes passos em direção a enfrentar esses desafios. Tendo uma visão de nível de sistema, este protocolo detalha o processamento confiável de volumes analítica escala precisamente calibrada-(variando de 0,15 a 1,5 ml) em ~ 10 min prazos. Esta é uma operação &quot;one-button&quot;: uma vez que o frasco fonte contendo os frascos de amostra e de destino para recolha de fracções são colocados no sistema, o comando &quot;run&quot; inicia o procedimento, e todos os passos são controlados por computador. No final de um ciclo, os frascos de recolha pode ser retirado do sistema para análise a jusante das fracções separadas. O dispositivo de núcleo neste sistema é um chip acoustophoresis que extrai (5-20 uM) de células de partículas de tamanho de mamífero a partir da amostra. Acoustophoretic separação é escolhido aqui principalmente porque é de alto rendimento (até 100s de l / min), livre-label, e sem contato, oferecendo assim vantagens em separar Viru viávelses a partir de células que algumas outras técnicas microfluídicos pode igualar. A física de partícula acústico focagem têm sido amplamente descrito, 11-13 e não são o foco deste protocolo, mas um breve resumo dos conceitos subjacentes segue para ajudar a compreender a aplicação à separação microfluídico. Ultra-som ondas estacionárias ressoando em microcanais cheios de líquido produzem campos de pressão, que dão origem a forças que impulsionam as partículas em direção a nós de baixa pressão. O módulo da força depende do volume da partícula, e em um factor de contraste acústica derivada das densidades relativas e de compressibilidade da partícula e o fluido de suspensão. 14 Como tal, acústica de focagem é idealmente adequado para a separação de células de tamanho (~ 7-15 mm) a partir de (~ 50-200 nm) partículas de vírus de tamanho. As partículas maiores migram para um nó de pressão; No entanto, uma vez que o módulo da força é muito pequeno parapartículas menores que de 2-3 uM, estas pequenas partículas ou espécies dissolvidas praticamente não se movem de todo. A implementação específica de separação acústica, conforme descrito anteriormente, 15 incorpora uma parede fina para subdividir o canal de fluido e permite sintonizável, a colocação assimétrica da posição de focagem. Isso adiciona flexibilidade no projeto do dispositivo, e os benefícios de desempenho, incluindo-o aumento da qualidade de separação e velocidade estão completamente descritos em outros lugares 16,17. No entanto, uma vantagem importante da abordagem de design de nível de sistema descrito neste trabalho é que é adaptável a uma grande variedade de dispositivos de núcleo de microfluidos. Por exemplo, a maioria dos outros modos de separação de fluxo contínuo, incluindo inercial, o fluxo de campo fracionamento, deslocamento lateral determinista (DLD), e vários tipos de dispositivos eletrocinéticos pode ser facilmente incorporada, com ajustes apropriados feitos para contabilizar as alterações no entrada de configuração / saída , as taxas de fluxo,e os volumes de amostra. Dispositivos com vários tipos de campos on-chip (elétricos, magnéticos) ou gradientes (térmicos, químicos) podem requerer conexões adicionais para o chip, ou a integração de hardware adicional, que esta plataforma acomoda. Este protocolo fornece as etapas necessárias para projetar um dispositivo de separação de microfluidos, e para fabricar chips de silício de vidro por uma profunda gravação iónica reactiva (DRIE, um processo plasma-etch disponível em muitas instalações de microfabricação, que usa ciclos de decapagem e passivação alternada para alcançar profunda características com paredes laterais verticais 18). Em seguida, descreve-se a caracterização do dispositivo acoustofluidic para determinar os parâmetros de funcionamento óptimas para a separação, e, finalmente, o sistema de separação detalhe totalmente integrado e o procedimento para o processamento de amostras biológicas. Típicas resultados da caracterização dispositivo e processamento de dados de amostra são então apresentadas e discutidas, e as principais vantagens desta aproach são destacadas, incluindo modularidade, robustez, precisão e automação.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Polished Silicon Wafer</td>
			<td>Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td>100 mm &#60;100&#62;&#160; prime wafer</td>
			<td>1-20 ohm-cm, 495 +/- 25&#181;m Double-side polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wafer</td>
			<td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td>
			<td>100mmx0.5mm Boro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 1518</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 1518</td>
			<td>Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 4620</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 4620</td>
			<td>Photoresist to define fluidic and via mask patterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE plasma etcher</td>
			<td>STPS, Newport, NP, United Kingdom</td>
			<td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Bonder</td>
			<td>Electronic Visions Group,&#160; St.Florian am Inn, Austria</td>
			<td>EVG 501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicing saw</td>
			<td>Kulicke &#38; Soffa Industries, Singapore</td>
			<td>K&#38;S 982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy kit</td>
			<td>Epoxy Technology, Billerica, MA, USA</td>
			<td>EPO-TEK 301</td>
			<td>Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PZT piezoceramic&#160;</td>
			<td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td>
			<td>PSI-5A4E</td>
			<td>37.5 &#215; 10 &#215; 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 AWG Kynar-insulated solid wire</td>
			<td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td>
			<td>UL1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part silver epoxy&#160;</td>
			<td>MG Chemicals, Surrey, BC, Canada</td>
			<td>8331</td>
			<td>Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-edit</td>
			<td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td>
			<td>Ledit v15.1 64-bit</td>
			<td>CAD software for mask layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>PHD ULTRA Series, 703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringes</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer to Threaded port adapter</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-659</td>
			<td>Connects syringe to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-623</td>
			<td>Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.&#160; Can also use webbed&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160; 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-202</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; OD Fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1912L</td>
			<td>Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.&#160; Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03&#34; ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ID fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1476-20</td>
			<td>Used for Flow restrictors: 0.006&#34; ID, 1/16&#34; OD FEP&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connects from chip to fluoropolymer tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling fan</td>
			<td>Multicomp, Leeds, England</td>
			<td>MC19663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF amplifier</td>
			<td>ENI, Rochester, NY</td>
			<td>325 LA</td>
			<td>Must be able to amplify signals from &#60;1V&#160; in the range of 1-2MHz to 25 Vpp to the piezo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucscon, AZ, USA</td>
			<td>CoolSnap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axiovert S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Tech, VT, USA</td>
			<td>SP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, 10x</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>ACHROPLAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, OR, USA</td>
			<td>TDS3014B</td>
			<td>To monitor voltage output by RF amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks, Natick, MA, USA</td>
			<td>R2014a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW</td>
			<td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td>
			<td>SITK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 &#181;m Beads</td>
			<td>Bangs Laboratory, IN, USA</td>
			<td>FS06F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Additional materials required for Step 5: Automated Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiport valves</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>C25Z-3180EUHA</td>
			<td>In the current configuration 4 valves are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensors</td>
			<td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td>
			<td>SLI-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoropolymer tubing, .01 and .03&#34; ID</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1902L and 1912L</td>
			<td>High purity PFA preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160;</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZN1PK-10</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and valves.&#160; Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZGF1PK-10</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and valves.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td>LabVIEW Professional Development system</td>
			<td>Laboratory Automation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Teknova, Hollister, CA, USA</td>
			<td>P0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raji Cells</td>
			<td>ATTC, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CCL86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boa Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DENV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Jose Pena at LLNL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter Z2</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td>Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td>
			<td>0267151B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for precision small-volume sample processing and its use to size separate biological particles with an acoustic microdevice

Uma grande vantagem dos microcanais é a capacidade para manipular pequenos volumes de amostra, reduzindo deste modo os resíduos de reagente e amostra a preservação precioso. No entanto, para alcançar a manipulação da amostra robusta é necessário abordar a integração de dispositivos com o ambiente de macroescala. Para realizar a separação de partículas repetível, sensível com dispositivos microfluídicos, este protocolo apresenta uma plataforma microfluídica automatizado e integrado completo que permite o processamento preciso de 0.15-1.5 ml amostras utilizando dispositivos microfluídicos. Aspectos importantes deste sistema incluem o layout modular dispositivo e acessórios robustos, resultando em mundo confiável e flexível para chip conexões, e manuseio de fluidos totalmente automatizada que realiza a coleta de amostras em circuito fechado, limpeza do sistema e priming passos para garantir a operação repetível. Diferentes dispositivos microfluidicos podem ser utilizados indiferentemente com esta arquitectura. Aqui nós incorporar um dispositivo acoustofluidic, detalhe sua characterizção, otimização de performance, e demonstrar a sua utilização para o tamanho-separação de amostras biológicas. Usando feedback em tempo real durante as experiências de separação, coleta de amostras é otimizado para conservar e concentrar amostra. Embora exigindo a integração de múltiplas peças de equipamento, as vantagens desta arquitetura incluem a capacidade de processar amostras desconhecidas sem otimização adicional do sistema, a facilidade de substituição do dispositivo, e, robusto processamento preciso de amostra.

As principais características do projeto do dispositivo acústico-microfluídica estão em destaque na Figura 1, e descreveu completamente em outro lugar. 15 Em breve, side-by-side fluxo de duas correntes de fluido em um canal de separação, separado de um canal de desvio paralelo por uma parede de silicone fino. Uma vez que o módulo da força de radiação primária escalas com o volume de partículas, as partículas grandes migrar para fora do fluxo de entrada mista-amostra para o nó de pressão acústica localizados na corrente de fluido de recuperação adjacente, enquanto que as partículas pequenas permanecem na corrente original (Figura 1B, C). A arquitetura de dois canais subdividido melhora a separação de partículas 17 e permite o ajuste da posição de nó utilizando diferentes fluidos do canal de derivação. 16 A placa de ensaio de fluidos e acessórios fornece uma plataforma robusta para o mundo de chip conexões, eo design modular permite a mudança rápida entre chips fluídicos (Figura 2). Este cONFIGURAÇÃO igualmente permite conexões de fluidos reversíveis, que vedam até 1.000 psi, a ser feita com rapidez e confiabilidade (Figura 2B, E). Os ressonantes frequência f res de um chip pode ser estimada utilizando cálculos analíticos 1D simples (Passo 1.1.1). A partir de um modelo de elementos finitos 2D mais completa da nossa secção transversal do dispositivo, a posição de focagem 16 esperado para a ressonância 2-nó é de 225 uM a partir da parede e a frequência esperada é 1,68 MHz. No entanto, f res de dispositivos reais podem variar em ± 100 kHz, dependendo da temperatura de funcionamento e de ressonâncias de acoplamento longitudinal e lateral. Por conseguinte, após a montagem do dispositivo, res de f deve ser verificado empiricamente a taxas de fluxo obtidas, assim como as tensões de accionamento piezoeléctrico, tal como descrito no Passo 4 do protocolo. A Figura 3 mostra as verificações frequência representativa tomadas a 200 ul / min,<html> com água nos canais principais e de bypass, e 20 V pp fornecido ao piezo. Quando o acoplamento entre o dispositivo de microfluidos piezo e é bom, as partículas irão concentrar firmemente na frequência de ressonância, o que resulta em um pico evidente na intensidade fluorescente e migração para a posição de focagem esperado (Figura 3A). Em contraste, quando não é pobre de acoplamento, as partículas não se concentrar bem e os resultados da análise de frequência será semelhante ao da Figura 3B. Em tais dispositivos, o transdutor piezo podem precisar de ser re-montado, se um adesivo reversível foi usado; caso contrário, este dispositivo não é adequado quando de alta qualidade de focagem ou de fluxo rápido são críticas para a aplicação desejada. Os dados da Figura 3 informar a escolha de frequência de operação para experiências posteriores, ea tensão e fluxo intervalo de taxa eficiente disponível para separação de partículas. files / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. automatizado de processamento da amostra. (A) Esquema de amostra carregada na bobina amostra. (B) perfil de fluxo Representante de uma experiência de separação bem-sucedida. (C) Fluxo perfil a partir de uma separação executado durante o qual a tomada SPO obstruído em cerca de 220 ​​seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Após a identificação de fichas que são separadores eficazes, eles são incorporados no sistema ilustrado na Figura 4. Sistema de cilindrada total é minimizada por meio de um tubo com 0,01 &quot;de diâmetro interior ao longo do caminho de fluxo principal (linhas azul). A Figura 5A ilustra a maquilhagem de um tampão de amostra típica infundido através do sistema. Uma pequena quantidade de &quot;tampão líder&quot; (~ 35 ul) é necessário para precede a amostra no fluxo para eliminar as flutuações de fluxo, enquanto a amostra se move através do chip separação. A Figura 5B mostra dados de fluxo resultantes a partir de uma experiência de separação acústica automatizado bem sucedido. As principais características de uma temporada de sucesso incluem: (1) um aumento transitório da taxa de fluxo, tanto no LPO e SPO como a pressão aumenta e líquido começa a fluir através do sistema, (2) um aumento acentuado indicando a passagem de uma bolha de ar (o inserção mostra um perfil expandido de uma única bolha), que devem ser recebidas pela SPO antes de LPO, devido ao fluxo desigual das duas saídas, (3) o fluxo estável através de ambas as saídas de entre as duas bolhas de ar medida que a amostra se move através do sistema, e (4) um decréscimo gradual na velocidade de fluxo em ambas as saídas depois o volume da amostra completa é fornecido ao sistema. Runs problemáticos são imediatamente aparentes a partir de perfis de fluxo semelhante ao da Figura 5C, onde parece que a SPO ficaram obstruídos depois de cerca de 220 ​​segundos. Em thi<html> s caso, um procedimento de limpeza semelhante ao descrito no Passo 5.3 deve ser executado para desobstruir o canal. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> Figura 6. Dispositivo tunability: dimensão das partículas e Efeitos de tensão. Percentagem de microesferas de poliestireno extraídos no POT depende do tamanho de partícula e a voltagem fornecida ao piezocerâmica. Cada linha corresponde a uma tensão de operação diferente na frequência de ressonância, determinada como descrito no Passo 4. caudal total através do aparelho é de 200 ul / min, com frequências de accionamento aplicados entre 1,62 e 1,64 MHz. As barras de erro representam o desvio padrão de pelo menos três experiências separadas. Reproduzido e modificado com permissão da The Royal Society of Chemistry de http://pubs.rsc.org / en / Content / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A Figura 6 mostra compilados resultados de separação usando vários tamanhos de partículas de poliestireno e piezo condução tensões que demonstram os parâmetros operacionais necessárias para a separação eficiente. Em geral, as tensões mais elevadas (isto é, forças acústicas superiores) são necessárias para extrair as partículas menores, conforme o esperado. Tensões unidade não pode ser indefinidamente aumentada, no entanto, devido a maior dissipação de calor e os efeitos crescentes de transmissão acústica. 13 O enredo serve como um guia geral para tamanhos de partículas separação de partículas que mostram recuperação significativamente diferente a uma tensão unidade específica (por exemplo, 10 e partículas de 2 mícrons de 8,8 V PP) vai separar bem. Em geral, as populações de partículas com uma grande diferença de tamanho, tais como os vírus (~ 100 nm) e as células (10 ~ ^ M) pode ser separado rápida e eficientemente, como podem as células de different tamanhos (por exemplo, 6-8 uM discoidais eritrócitos e leucócitos 8-15 uM). As condições específicas necessárias para trabalhar com outros tipos de células deve ser determinada empiricamente, tal como a forma da célula, a densidade e a compressibilidade afectar o seu contraste acústico, para além do tamanho das células. Para este fim, os procedimentos do Passo 4 são úteis para determinar as condições de separação utilizáveis ​​para qualquer nova célula ou tipo de partículas, e não apenas para avaliar a qualidade de um dispositivo acoustophoresis particular. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> Figura 7. eficiência de separação de Cell-Virus amostras enriquecidas. Resultados de separação de (a) células Raji incrementadas com o vírus da dengue (DENV) e (B) células Raji e células de rim Boa enriquecida com Golden Gate Virus (GGV). Percentagens recolhidos são definidas como a fracção de vírus ou células que saem de uma determinadatomada em relação à quantidade total que sai do chip. As barras de erro para (A) são o desvio padrão de 3 ensaios, ao passo que as amostras em (B), apenas foram processadas uma vez que, devido às pequenas quantidades disponíveis. 1x PBS foi utilizado como o tampão de amostra de fluido e de recuperação, com água no canal de desvio para todas as experiências. Freqüências de operação de chips variou entre 1,60 e 1,64 MHz, com tensões de acionamento entre 16 e 20 V pp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Para demonstrar a utilidade desta plataforma para a separação de partículas biológicas, que primeiro usou para processar amostras biológicas bem caracterizados: células Raji humanas (10 5 células / ml, diâmetro médio de 8-10 mm 25) enriquecida com vírus da dengue (DENV, 10 5 pfu / ml, diâmetro aproximado de 50 nm, 26). Figura 7A mostra a percentagem de células Raji e DENV recolhidos tanto na SPO e LPO (definido como a fracção de cada tipo de partículas recolhidas a partir de cada ponto de comparação com a quantidade total de cada uma das partículas recolhidas a partir do chip). A experiência foi repetida em triplicado, e as células Raji foram quantificados utilizando um contador Coulter, enquanto DENV foi quantificada utilizando uma polimerase de transcrição reversa-reacção em cadeia quantitativa (qPCR-RT). Em seguida, o desempenho do sistema foi testado num cenário que é mais realista para o processamento de amostras clínicas, em que as características físicas exactas das partículas podem ser desconhecidos, e as quantidades de amostra disponíveis são mais baixos. Aqui, nós avaliamos a separação do vírus golden gate-identificados recentemente (GGV), uma cobra patógeno infectando células de rim boa constrictor. 27 O tamanho da partícula do vírus GGV ainda não foi medido, mas desde GGV pertence à família Arenaviridae, ele é susceptível de umtamanho semelhante, entre 100 e 150 nm. 28 Nós processadas amostras com GGV cravado (10 4 ufc / ml) em células Raji humanos (e não um alvo infecção para o vírus), e células boa renais (alvo infecção por GGV, tamanho aproximado 10 27 uM), com ambos os tipos de células em 10 4 células / ml. Como estas amostras estavam disponíveis em pequenas quantidades, a separação resulte apenas uma corrida experimental são relatados neste trabalho. A Figura 7B mostra a percentagem de células Raji, células Boa, e GGV coletadas a partir do SPO e LPO. As células foram quantificados nestes experimentos por contagem num hemacitómetro e vírus foram quantificados por RT-qPCR.

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A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Uma plataforma microfluídica para processamento de precisão de pequeno volume de amostra e respectiva utilização para Tamanho partículas biológicas separadas com um microdispositivos Acústico

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K visualizações.  Lawrence Livermore National Laboratory. This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15–1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Vídeo: A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice