אקוסטופורזיס מיקרופלואידי להפרדת זרימה של חיידקים גראם-שליליים באמצעות חרוזי זיקה של אפטמר

פרוטוקול זה מתאר את טכנולוגיית האקוסטופורזיס המיקרופלואידית שלנו, שיכולה לשמש להפרדה מהירה ויעילה של חיידקים גראם-שליליים ממדיום באמצעות חרוזי מיקרו שעברו עיבוד אפתמר. מערכות אקוסטופורזיס מיקרופלואידיות מאפשרות הפרדת חיידקים גראם-שלילית עם תפוקה סבירה ובידוד תאים ללא מגע. ניתן לייעל את האקוסטופורזיס המיקרופלואידי לבידוד חיידקים מדגימות רפואיות וסביבתיות.

כדי להתחיל, תכננו שבב אקוסטופורזיס מיקרופלואידי שאוסף חרוזי PS בשקע היעד ומשליך את השאר לאחר הזרקת תערובת דגימת PS לכניסת הדגימה. מכינים שבב כשהשכבות מעל ומתחת לשכבת הסיליקון מחוברות לזכוכית הבורוסיליקט. ושכבת זכוכית בורוסיליקט שלישית, באמצעות אנודיזציה, מוסיפה 1000 וולט ו 400 מעלות צלזיוס.

חברו PZT לשכבת הזכוכית הבורוסיליקטית לאורך התעלה המיקרופלואידית באמצעות פחות מ-10 מיקרוליטרים של דבק ציאנואקרילט. לחסן את חיידקי ה-GN וה-GP במדיום לוריא-ברטני ולדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-220 סיבובים לדקה למשך 16 שעות. צנטריפוגה של חיידקים מתורבתים ב 9, 056 RCF במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן יש לשטוף פעמיים עם מאגר PBS 1X. הכן את חיידקי ה- GN וה- GP שנבחרו לניתוח על ידי החייאתם מחדש במאגר הקשירה. יש להשהות את תערובת המיקרו-חרוזים המצופה בסטרפטווידין בגודל 10 מיקרומטר לפני השימוש.

מערבבים את התערובת במשך 20 שניות. הכינו את האפטמר על ידי דנאטציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, ולאחר מכן החזירו אותו לאפס מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. העבירו 250 מיקרוליטרים של תערובת מיקרו-חרוזים מצופה סטרפטאווידין לצינור של 1.5 מיליליטר והוסיפו 100 מיקרוליטרים של אפטמר DNA ביוטינילי לצינור.

לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות תוך סיבוב במהירות של 25 סיבובים לדקה. צנטריפוגה של תערובת התגובה ב 9, 056 RCF במשך 40 שניות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את הצינור פעמיים עם 200 microliters של חיץ Tris-HCl.

הוסיפו 10 מיקרוליטרים של 100 מיליגרם למיליליטר BSA לצינור הדגימה השטוף ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך סיבוב במהירות של 25 סיבובים לדקה. לבסוף, יש לשטוף את חרוזי המיקרו שעברו שינוי אפטמר פעמיים בחיץ Tris-HCl על ידי צנטריפוגה ב-9, 056 RCF למשך 40 שניות בטמפרטורת החדר. חבר צינורות PEEK לשני הפתחים להזרקת שתי דגימות וחיץ, ושני השקעים לאיסוף ופריקה של פסולת.

באמצעות מזרק של 10 מיליליטר, מלאו את תעלת האקוסטופורזיס המיקרופלואידית במים שעברו דה-מינרליזציה ללא בועות. הכן בקר לחץ מדויק עם שני ערוצי יציאה או יותר כדי לשלוט בזרימת הנוזל. לאחר הכנת המכשיר, הזרקת הדגימה והמאגר על ידי הפעלת לחץ של שני קילו-פסקלים על כניסת הדגימה וארבעה קילו-פסקלים לכניסת החיץ באמצעות התקן בקרת הלחץ המדויק.

באמצעות מיקרוסקופ, התמקדו בחרוז והזיזו אותו למרכז התעלה המיקרופלואידית באמצעות ה-PZT. צור תדר תהודה של 3.66 מגה-הרץ באמצעות מחולל פונקציות ערוץ יחיד והגבר אות טיפוסי ב-16 דציבלים באמצעות מגבר הספק. שימו לב לתהליכי ההפרדה וההעשרה על השבב האקוסטופלואידי עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצלמה במהירות גבוהה הפועלת בקצב של 1, 200 פריימים לשנייה.

השבב האקוסטופורטי שהוצג במחקר זה אישר כי ככל שהמתח של ה- PZT גדל, הריכוז המרכזי של החרוזים בגודל 10 מיקרומטר גדל. בחמישה וולטים של מתח PZT, רוב החרוזים בגודל 10 מיקרומטר התרכזו במרכז. היחס בין מספר החרוזים שנאספו בשקע למספר הכולל של חרוזים מוזרקים בגודל 10 מיקרומטר נקרא קצב ההתאוששות.

היחס בין מספר החרוזים בגודל 10 מיקרומטר למספר הכולל של החרוזים שנאספו נקרא טוהר. התוצאות הצביעו על כך שלמכשיר הייתה יעילות הפרדה גבוהה לחרוזים בגודל של 10 מיקרומטר. המספרים של חיידקי GN ו-GP הקשורים לכל חרוז מיקרו שעבר שינוי אפטמר נמדדו באמצעות מיקרוסקופ עם מצלמה במהירות גבוהה.

כל חמשת חיידקי ה-GN נקשרו לחרוזים, בעוד שפחות חיידקי GP נקשרו באופן משמעותי לחומרים שנבדקו. עוצמת האות הייתה שונה באופן משמעותי בין חיידקי ה-GN וה-GP. יש להשתמש בדבק המשמש לחיבור ה- PZT מעט ככל האפשר לדיוק הקורוגציה וה- PZT והמיקרו-ערוץ צריכים להיות מקבילים.

מכשיר זה יכול לשמש לאיתור סמנים ביולוגיים חיים או חיידקים שמקורם בתקופה של אבחון מוקדם של מחלות זיהומיות חיידקיות.