This work was performed under the auspices of the U.S. Department of Energy by Lawrence Livermore National Laboratory under Contract DE-AC52-07NA27344, and partially supported by LLNL&#8217;s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) program, 14-LW-077. The authors thank Michael Wilson, Mark Stenglein and Joe DeRisi at the Univeristy of California, San Francisco for generously providing GGV and Boa cell samples. EJF acknowledges support from the LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS acknowledges support from the UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

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The authors have nothing to disclose.

Questo protocollo presenta l&#39;integrazione a livello di sistema di dispositivi microfluidici per attrezzature macroscala per eseguire l&#39;elaborazione automatizzata campione biologico. La modularità di questa piattaforma permette di essere adattabile a qualsiasi dispositivo flusso continuo, e, come esempio, il protocollo presentato concentra sulla caratterizzazione e ottimizzare le prestazioni di un dispositivo di separazione delle particelle acoustofluidic. Tre grandi vantaggi di questo protocollo sono evidenziati: (i) la modularità e chip-to-mondo interfacciamento, (ii) caratterizzazione affidabile di prestazioni del dispositivo, e (iii) il trattamento automatizzato dei volumi di campione precisamente misurate per la separazione di particelle. io. Modularità e chip-to-mondo interfacciamento Come mostrato in Figura 2, il chip microfluidico è montato su una basetta per misura facilmente su un palco microscopio per l&#39;osservazione diretta. Il tagliere contiene # 6-40 fori filettati UNF su una griglia di 5 mm a passo, enabling il chip da fissare, e le connessioni del fluido da effettuare. Le connessioni del fluido sono PEEK tubi con estremità lavorate, che tenuta contro il chip fluidico con una gomma faccia guarnizione di tenuta e un collare di acciaio inossidabile. Questo schema interfaccia rende per una facile sostituzione di chip e rapida riprogettazione dispositivo, che richiedono poche o nessuna modifica al altri componenti del sistema, impronte di chip forniti conformi al formato griglia. Ad esempio, abbiamo utilizzato questa piattaforma con chip microfluidici per elettroforesi a flusso continuo, lisi cellulare termico, 29 rapida miscelazione di reagenti per la sintesi chimica, e la cattura cella singola e interrogatori. ii. Caratterizzazione robusta di prestazioni del dispositivo Per ottimizzare le prestazioni di qualsiasi dispositivo di separazione microfluidi, il suo funzionamento deve prima essere accuratamente caratterizzata. Il sistema qui descritto supporta lo sviluppo di protocolli rapidi e automatici per farlo. Per il examp specificale di dispositivi acustici di messa a fuoco, la qualità di messa a fuoco, la frequenza di funzionamento, e la posizione delle particelle focalizzate nel canale microfluidica deve essere misurato per ogni singolo dispositivo. Queste misure richiedono spazzare attraverso una gamma di frequenze di trasmissione piezoceramico, tensioni e portate, per identificare le combinazioni ottimali dei parametri per la separazione di alta qualità. Il protocollo presentato varia automaticamente questi parametri sintonizzabili e cattura pertinente Data-ie, immagini fluorescenti di particelle che scorre nel canale che sono post-elaborati per generare le misure delle particelle richiesti focalizzazione qualità, frequenza, e la posizione (figura 3). Caratterizzazione completa delle prestazioni del dispositivo acustico richiede passaggi ripetuti 4.4 e 4.5, se necessario in diverse condizioni sperimentali. Ad esempio, la posizione di messa a fuoco assoluta di un chip è trovato eseguendo la scansione di frequenza a portate relativamente bassa e alta tensiones per garantire una completa migrazione alla posizione di nodo. Inoltre, tali scansioni frequenza possono valutare la qualità del montaggio del dispositivo (quando eseguito con perle di polistirene di dimensioni note), o per determinare come un tipo di particelle precedentemente sconosciuta si comporterà nel sistema (dopo un chip è stato caratterizzato con perline). Un chip con buon trasferimento di energia dal piezoceramico al canale microfluidico comporterà stretto focalizzazione a portate elevate (&gt; 1 ml / min) e bassa tensione (12-15 V pp), mentre quelli con scarso trasferimento di energia non si concentrerà anche a basse portate (&lt;100 l / min) e tensioni elevate (&gt; 20 V pp). Abbiamo scoperto che il contatto intimo tra il chip microfluidica e piezoceramico è fondamentale per un efficiente trasferimento di energia nel fluido. Ulteriori analisi del metodo ottimale incollaggio del chip microfluidico e piezoceramico consentirà produzione affidabile di dispositivi ad alte prestazioni. Infine, un completoimmagine di funzionamento di un dispositivo acoustophoretic può essere ottenuto combinando le misurazioni di scansione di frequenza basati su immagini di Fase 4 (e figura 3) con numeri di particelle raccolte dalla SPO e LPO come funzioni dei parametri operativi relativi, da esperimenti di separazione effettuate con microsfere , come descritto nel passaggio 5. Come mostrato in figura 6, una tale serie di esperimenti automatizzate può rapidamente caratterizzare le prestazioni di un singolo dispositivo e sintonizzabilità, informare l&#39;utente dello spazio ottimale parametro per azionare il dispositivo per la separazione di particelle. iii. Di trattamento automatizzato di piccolo-campione per la separazione di particelle Per l&#39;elaborazione del campione di successo e preciso basato su chip microfluidica, è fondamentale in modo affidabile e preciso metro, carico, consegnare, e raccogliere le quantità di liquidi che passano attraverso. Questa precisione è particolarmente importante quando il volume del campione è piccola(~ 0,1-1 ml), che è comune in laboratorio clinico o di ricerca. 30 precisa manipolazione del campione è impegnativo in esperimenti tradizionali microfluidici che impiegano ritiro manuale del campione in una siringa e l&#39;infusione in un dispositivo senza valutazioni di quando il campione è stata separata e quando devono essere raccolti. Il protocollo presentato impiega automatizzato campione bobina di carico e erogazione accoppiato con feedback in tempo reale da sensori di flusso per consentire separazioni riproducibili di piccoli volumi di campione. La Figura 5 mostra i profili di flusso misurata in SPO e LPO da un tipico esperimento separazione. Innanzitutto, portando tampone di almeno 35 microlitri viene caricato per garantire un flusso stabile prima che il campione raggiunge il chip acustica. Volumi di campione inferiori 100 pl non sono raccomandati per questa configurazione del sistema, perché diluizione del campione dovuta al buffer principale diventa eccessiva. Una spina di aria viene utilizzata all&#39;inizio del the iniezione prima che il buffer porta per separare la spina campione dal fluido che segue, impedendo la miscelazione e la diluizione del campione e servire come indicatore per i sensori di flusso. Dopo un transitorio iniziale come fluido comincia a muoversi attraverso il sistema, segnali spike taglienti in entrambe le uscite indicano il passaggio del primo bolla d&#39;aria. Questi transitori sono seguiti da un lungo periodo di flusso stabile come il campione scorre attraverso il sistema, poi un&#39;altra punta quando la seconda bolla d&#39;aria passa, e infine un eventuale calo di portata a zero dopo la pompa si ferma siringa. Il passaggio delle spine aria attraverso i sensori di flusso viene utilizzato come punti di innesco per commutare le valvole per avviare e arrestare la raccolta del campione, riducendo così al minimo campione perduta e diluizione con volumi di fluido non-campione. Ciclo chiuso misurazione di volumi di campione trasformati elimina la necessità di riprogrammare questi valori prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento ogni campione in ingresso viene cambiato. Questa caratteristica èparticolarmente importante quando il volume del campione è limitato, per esempio nel caso di molti campioni clinici. Monitoraggio del flusso in tempo reale aiuta anche nella risoluzione dei problemi; una cattiva esecuzione (ad esempio, uno zoccolo formando in uno dei punti vendita) è immediatamente evidente dai profili di flusso risultanti, come nella figura 5b. Per dimostrare la flessibilità e l&#39;efficacia della separazione acoustofluidic utilizzando l&#39;architettura del sistema presentato, DENV purificato e le riserve di virus GGV sono stati aggiunti in azioni di celle e separate da lavorazione attraverso il chip microfluidico. Figura 7a mostra che le cellule Raji erano ben separati-da virus, come 97 % di cellule Raji escono chip sono risultati essere in LPO, lasciando così un campione altamente arricchito di DENV nel SPO. In confronto, l&#39;efficienza della separazione DENV era inferiore, con il 70% di DENV uscita del chip trovato nel SPO. Ciò può essere attribuito alla leggera miscelazione convettiva indotto dalle spire della Separatisul canale, ma più probabile che alcune particelle DENV migrano insieme con le cellule Raji nel LPO. Cellule che migrano lateralmente attraverso linee di corrente trascinano un fluido con loro, anche a basso numero di Reynolds. Con questo meccanismo, così come aspecifico adsorbimento superficie, particelle virali trasferire nella LPO. Tuttavia, il campione altamente arricchito di DENV nel SPO è un vantaggio significativo, per esempio quando de novo sequencing è utilizzato per rilevare e identificare i virus. Figura 7b mostra che in una prova sperimentale, solo circa il 70% delle cellule Boa escono chip sono stati trovati nella LPO, rispetto a quasi il 100% di efficienza di separazione per cellule Raji. La differenza di prestazioni di separazione tra i due tipi di cellule può essere attribuibile a una dimensione più piccola o media densità inferiore di cellule Boa rispetto alle cellule Raji, quindi con conseguente forze acustiche più piccole. Per confermare o smentire queste ipotesi, le dimensioni, la densità e la morfologia di Boale cellule in sospensione (che normalmente crescere aderenti) di cellule Boa devono essere misurati con precisione, uno sforzo per ulteriori indagini. Negli stessi esperimenti, analogamente agli esperimenti con DENV, il grosso del GGV recuperato uscita dal SPO, indicando un arricchimento della frazione virale. I dati presentati evidenziano le sfide inerenti di ingegneria piattaforme di ampia applicazione per l&#39;elaborazione di una serie di campioni biologici. È importante sottolineare che le interazioni biologiche può cominciare a giocare come un grande ruolo gli effetti fisici e meccanici. Tuttavia, questi esperimenti preliminari dimostrano anche la potenza e la promessa di utilizzare questo sistema per la trasformazione dell&#39;architettura campione applicazioni cliniche e di ricerca. Come un robusto sistema progettato, ben caratterizzato, questa piattaforma offre la possibilità di cercare le risposte alle nuove questioni scientifiche.

Separazione del campione e frazionamento è una delle aree di applicazione più promettenti per le tecnologie microfluidici. Tali fasi di manipolazione del campione sono parte integrante per la diagnostica clinica, lo sviluppo efficaci terapie, gli sforzi Biosurveillance e progressi nella ricerca delle scienze della vita e della tecnologia. Una miriade di strategie di separazione microfluidica sono state dimostrate per il particolato e colloidi fluide in sospensione, così come per le specie chimiche e biologiche; diverse recensioni forniscono una panoramica delle recenti progressi e gli sviluppi in questi settori 1 - 9. Anche se molte di queste tecnologie di separazione microfluidica (di seguito denominati &quot;Core Devices&quot;) sono stati ampiamente caratterizzato, pochi studi hanno preso in considerazione il problema di separazione del campione a livello di sistema. I dispositivi core sono in genere singoli chip centimetri scala, interfacciati a tubi fluoropolimero, con fluido erogato da una pompa o pressione.Tuttavia, se la promessa di microfluidica - tra cui una maggiore automazione, affidabilità e riduzione dei volumi di campione - è di diventare realtà, almeno uno sforzo equivalente deve essere dedicata alla progettazione di un sistema di separazione completa in cui è integrato il dispositivo del centro . Inoltre, una grande sfida per gli approcci alla microfluidica biorilevazione è il macro al micro interfaccia. Questo si riferisce non solo alle connessioni fisiche &quot;mondo-truciolo&quot; di un dispositivo a microfluidi ai componenti macroscala, e per la mancata corrispondenza tra tipici volumi di campione clinico o analitico (~ 0,1-10 ml) e il volume interno di chip microfluidica (~ 0,01-10 microlitri), ma anche le limitazioni di campionamento statistico derivanti da colmare queste scale dimensionali. Questi problemi contribuiscono alla percezione che la pre-elaborazione e preparazione del campione sono il &quot;anello debole&quot; della biorilevazione. 10 La piattaforma descritta in questo lavoro taKES grandi passi verso affrontare queste sfide. In una prospettiva a livello di sistema, i dettagli di questo protocollo il trattamento affidabile di precisione-misurate volumi analitico scala (che variano da 0,15 a 1,5 ml) su scale temporali ~ 10 min. Si tratta di una operazione &quot;un solo pulsante&quot;: una volta che la fiala sorgente contenente le fiale di campione e di destinazione per la raccolta delle frazioni vengono inseriti nel sistema, il comando &quot;Esegui&quot; avvia la procedura, e tutte le fasi sono controllati dal computer. Alla fine di una corsa, le fiale di raccolta possono essere rimossi dal sistema di analisi valle delle frazioni separate. Il Device Core in questo sistema è un chip acoustophoresis che estrae (5-20 micron) particelle di cellule di mammifero dimensioni dal campione. Separazione Acoustophoretic è scelto qui soprattutto perché è high-throughput (fino a 100s di microlitri / min), senza etichetta e senza contatto, offrendo così vantaggi nel separare viru praticabileses dalle cellule che poche altre tecniche microfluidici possono eguagliare. La fisica della particelle acustico messa a fuoco sono stati ampiamente descritti, 11 - 13 e non sono il focus di questo protocollo, ma un breve riassunto dei concetti di base segue per aiutare a comprendere l&#39;applicazione alla separazione microfluidica. Ultrasuoni onde stazionarie risonanti in microcanali piene di liquido producono campi di pressione, che danno origine a forze che guidano le particelle verso i nodi di bassa pressione. La grandezza forza dipende dal volume della particella, e su un fattore di contrasto acustico derivante dai relativi densità e compressibilities della particella e il fluido di sospensione. 14 In quanto tale, concentrandosi acustico è ideale per la separazione delle cellule di dimensioni (~ 7-15 micron) da (~ 50-200 nm) particelle virus-dimensioni. Le particelle più grandi migrano verso un nodo di pressione; tuttavia, poiché l&#39;intensità della forza è molto piccolo perparticelle di dimensioni inferiori a 2-3 micron, queste piccole particelle o specie disciolte difficilmente muoversi. La nostra implementazione specifica di separazione acustica, come precedentemente descritto, 15 incorpora una parete sottile per suddividere il canale del fluido e permette sintonizzabile, posizionamento asimmetrico della posizione di messa a fuoco. Questo aggiunge flessibilità nella progettazione di dispositivi, e dei benefici, tra cui una maggiore qualità delle prestazioni di separazione e la velocità sono perfettamente descritte altrove. 16,17 Tuttavia, uno dei principali vantaggi del metodo di progettazione a livello di sistema descritto in questo lavoro è che è adattabile ad una grande varietà di dispositivi microfluidici core. Ad esempio, la maggior parte delle altre modalità di separazione a flusso continuo, tra cui inerziale, flow-campo di frazionamento, spostamento laterale deterministico (DLD), e vari tipi di dispositivi elettrocinetiche possono essere facilmente incorporati, con opportuni aggiustamenti fatti per tener conto delle variazioni nella configurazione di ingresso / uscita , portate,e volumi di campione. I dispositivi con vari tipi di campi on-chip (elettrico, magnetico) o gradienti (termici, chimici) possono richiedere ulteriori collegamenti al chip, o l&#39;integrazione di hardware aggiuntivo, che questa piattaforma può ospitare. Questo protocollo definisce i passaggi indispensabili per la progettazione di un dispositivo di separazione microfluidica, e per fabbricare chip di silicio di vetro da una profonda ion etching reattiva (DRIE, un processo al plasma etch disponibili in molte strutture di microfabbricazione, che utilizza cicli di incisione e passivazione alternati per raggiungere in profondità caratteristiche con pareti laterali verticali 18). Successivamente, descriviamo la caratterizzazione del dispositivo acoustofluidic per determinare i parametri di funzionamento ottimali per la separazione, e infine dettaglio il sistema di separazione completamente integrato e la procedura per il trattamento di campioni biologici. Risultati caratterizzazione dispositivo tipici e l&#39;elaborazione dei dati del campione vengono poi presentati e discussi, ed i vantaggi di questo approach sono evidenziati, tra cui la modularità, robustezza, precisione e automazione.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Polished Silicon Wafer</td>
			<td>Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td>100 mm &#60;100&#62;&#160; prime wafer</td>
			<td>1-20 ohm-cm, 495 +/- 25&#181;m Double-side polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wafer</td>
			<td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td>
			<td>100mmx0.5mm Boro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 1518</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 1518</td>
			<td>Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 4620</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 4620</td>
			<td>Photoresist to define fluidic and via mask patterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE plasma etcher</td>
			<td>STPS, Newport, NP, United Kingdom</td>
			<td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Bonder</td>
			<td>Electronic Visions Group,&#160; St.Florian am Inn, Austria</td>
			<td>EVG 501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicing saw</td>
			<td>Kulicke &#38; Soffa Industries, Singapore</td>
			<td>K&#38;S 982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy kit</td>
			<td>Epoxy Technology, Billerica, MA, USA</td>
			<td>EPO-TEK 301</td>
			<td>Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PZT piezoceramic&#160;</td>
			<td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td>
			<td>PSI-5A4E</td>
			<td>37.5 &#215; 10 &#215; 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 AWG Kynar-insulated solid wire</td>
			<td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td>
			<td>UL1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part silver epoxy&#160;</td>
			<td>MG Chemicals, Surrey, BC, Canada</td>
			<td>8331</td>
			<td>Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-edit</td>
			<td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td>
			<td>Ledit v15.1 64-bit</td>
			<td>CAD software for mask layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>PHD ULTRA Series, 703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringes</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer to Threaded port adapter</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-659</td>
			<td>Connects syringe to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-623</td>
			<td>Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.&#160; Can also use webbed&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160; 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-202</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; OD Fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1912L</td>
			<td>Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.&#160; Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03&#34; ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ID fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1476-20</td>
			<td>Used for Flow restrictors: 0.006&#34; ID, 1/16&#34; OD FEP&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connects from chip to fluoropolymer tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling fan</td>
			<td>Multicomp, Leeds, England</td>
			<td>MC19663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF amplifier</td>
			<td>ENI, Rochester, NY</td>
			<td>325 LA</td>
			<td>Must be able to amplify signals from &#60;1V&#160; in the range of 1-2MHz to 25 Vpp to the piezo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucscon, AZ, USA</td>
			<td>CoolSnap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axiovert S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Tech, VT, USA</td>
			<td>SP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, 10x</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>ACHROPLAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, OR, USA</td>
			<td>TDS3014B</td>
			<td>To monitor voltage output by RF amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks, Natick, MA, USA</td>
			<td>R2014a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW</td>
			<td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td>
			<td>SITK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 &#181;m Beads</td>
			<td>Bangs Laboratory, IN, USA</td>
			<td>FS06F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Additional materials required for Step 5: Automated Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiport valves</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>C25Z-3180EUHA</td>
			<td>In the current configuration 4 valves are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensors</td>
			<td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td>
			<td>SLI-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoropolymer tubing, .01 and .03&#34; ID</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1902L and 1912L</td>
			<td>High purity PFA preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160;</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZN1PK-10</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and valves.&#160; Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZGF1PK-10</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and valves.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td>LabVIEW Professional Development system</td>
			<td>Laboratory Automation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Teknova, Hollister, CA, USA</td>
			<td>P0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raji Cells</td>
			<td>ATTC, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CCL86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boa Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DENV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Jose Pena at LLNL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter Z2</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td>Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td>
			<td>0267151B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for precision small-volume sample processing and its use to size separate biological particles with an acoustic microdevice

Un vantaggio importante di dispositivi microfluidici è la capacità di manipolare piccoli volumi, riducendo così sprechi di reagente e conservazione del campione prezioso. Tuttavia, per raggiungere robusta manipolazione campionatura è necessario affrontare l&#39;integrazione dei dispositivi con l&#39;ambiente macroscala. Per realizzare ripetibili, la separazione di particelle sensibili con dispositivi microfluidici, questo protocollo presenta una completa piattaforma microfluidica automatizzata e integrata che consente l&#39;elaborazione precisa dei 0.15-1.5 ml campioni utilizzando dispositivi microfluidici. Aspetti importanti di questo sistema comprendono struttura modulare dispositivo e infissi robusti conseguente mondo affidabile e flessibile di chip connessioni, e la gestione dei fluidi completamente automatizzata che compie campionario circuito chiuso, sistema di pulizia e adescamento misure per garantire il funzionamento ripetibile. Diversi dispositivi microfluidici possono essere usati in modo intercambiabile con questa architettura. Qui incorporiamo un dispositivo acoustofluidic, particolare la sua characterizzione, ottimizzazione delle prestazioni, e dimostrare il suo uso per dimensioni-separazione dei campioni biologici. Utilizzando feedback in tempo reale durante gli esperimenti di separazione, la raccolta dei campioni è ottimizzato per conservare e concentrare campione. Sebbene richiede l&#39;integrazione di più apparecchiature, i vantaggi di questa architettura includono la capacità di trattare i campioni sconosciuti senza ulteriore ottimizzazione del sistema, facilità di sostituzione del dispositivo, e preciso, campione di trasformazione robusto.

Le caratteristiche principali del disegno dispositivo acustico-microfluidica sono evidenziati in Figura 1, e descritte dettagliatamente altrove. 15 In breve, side-by-side due correnti di fluido flusso in un canale di separazione, separato da un canale di bypass in parallelo da una parete sottile di silicio. Poiché il primario forza di radiazione ampiezza scale con volume di particelle, le particelle più grandi migrano dal flusso di input mista campione verso il nodo di pressione acustica situata nella corrente fluida recupero adiacenti, mentre le piccole particelle rimangono nel flusso originale (Figura 1B, C). Il suddivisa architettura a due canali migliora separazione delle particelle 17 e permette la regolazione della posizione nodo utilizzando diversi fluidi canale di by-pass. 16 Il tagliere fluidica e infissi fornisce una solida piattaforma per mondo a scheggiare le connessioni, e il design modulare consente un rapido cambio tra i chip fluidici (Figura 2). Questo cONFIGURAZIONE permette altresì collegamenti del fluido reversibili, che sigillano fino a 1000 psi, da effettuare in modo rapido e affidabile (Figura 2B, E). I risonanti res frequenza f di un chip può essere stimata utilizzando semplici calcoli analitici 1D (fare riferimento al punto 1.1.1). Da un modello più completo 2D agli elementi finiti del nostro dispositivo sezione 16, la posizione del fuoco previsto per 2 nodi risonanza è 225 micron dalla parete e la frequenza attesa è 1.68 MHz. Tuttavia, res f di dispositivi reali può variare di ± 100 kHz, a seconda della temperatura di funzionamento e l&#39;accoppiamento di risonanze longitudinali e laterali. Pertanto, dopo il montaggio del dispositivo, res f devono essere verificate empiricamente a portate rilevanti e le tensioni di unità piezoelettrica, come descritto al punto 4 del protocollo. La figura 3 mostra le scansioni di frequenza rappresentante prese a 200 ml / min,<html> con acqua in principali e bypass canali, e 20 V pp fornita al piezo. Quando l&#39;accoppiamento tra il dispositivo e piezo microfluidi è buona, particelle si concentrano strettamente alla frequenza di risonanza, causando un picco dell&#39;intensità fluorescente e migrazione verso la posizione di messa a fuoco atteso (Figura 3A). Al contrario, quando vi è scarsa accoppiamento, particelle si concentrano bene ei risultati di scansione di frequenza saranno simili alla Figura 3B. In tali dispositivi, il trasduttore piezoelettrico può essere necessario ri-montato, se è stato usato un adesivo reversibile; altrimenti il ​​dispositivo non è adatto quando l&#39;alta qualità di messa a fuoco o flusso veloce sono fondamentali per l&#39;applicazione richiesta. I dati della figura 3 informano la scelta della frequenza di funzionamento per esperimenti successivi, e la tensione e campo di portata disponibili per la separazione di particelle efficiente. file / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. di trattamento automatizzato di Campione. (A) Schema di campione caricato nella bobina campione. (B) profilo del flusso Rappresentante di un esperimento di successo di separazione. (C) Portata profilo da una separazione eseguire durante il quale l&#39;uscita SPO intasato a circa 220 secondi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Dopo aver identificato chip che sono separatori efficaci, sono incorporati nel sistema illustrato nella figura 4. Totale sistema cilindrata viene minimizzato usando tubi con 0.01 &quot;diametro interno lungo il percorso di flusso principale (linee blu). Figura 5A illustra il make-up una spina di campione tipico infuso attraverso il sistema. Una piccola quantità di &quot;leader cuscinetto&quot; (~ 35 ml) è necessario per precede il campione nel flusso per eliminare fluttuazioni di flusso mentre il campione si muove attraverso il chip di separazione. La figura 5B mostra i dati di flusso risultanti da un esperimento separazione acustica automatizzato successo. Caratteristiche principali di una corsa di successo includono: (1) un aumento transitorio della portata sia nel LPO e SPO come pressione aumenta e fluido inizia a fluire attraverso il sistema, (2) un picco tagliente che indica il passaggio di una bolla d&#39;aria (il inserto mostra un profilo esteso di una singola bolla), che dovrebbe raggiungere la SPO prima della LPO dovuta al flusso disuguale dalle due uscite, (3) stabile flusso attraverso entrambe le uscite tra le due bolle di aria mentre il campione si muove attraverso il sistema, e (4) una graduale diminuzione della portata in entrambe le uscite dopo che il volume totale del campione viene consegnato al sistema. Piste problematici sono immediatamente evidenti dai profili di flusso simile alla Figura 5C, qualora risulti che la SPO diventato intasato dopo circa 220 secondi. In thi<html> s caso, una procedura di pulizia simile a quello descritto nella Fase 5.3 deve essere eseguito per sbloccare il canale. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> Figura tunability 6. Dispositivo: dimensione delle particelle ed effetti di tensione. Percentuale di microsfere di polistirene estratti nel LPO dipende dalla dimensione delle particelle e la tensione fornita al piezoceramico. Ogni riga corrisponde ad una tensione di esercizio diverso alla frequenza di risonanza, determinato come descritto al punto 4. portata totale attraverso il dispositivo è di 200 ml / min, con frequenze di trasmissione applicata tra 1,62 e 1,64 MHz. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di almeno tre esperimenti separati. Riprodotto e modificato con il permesso di The Royal Society of Chemistry da http://pubs.rsc.org / it / Contenuti / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. La figura 6 mostra compilati separazione è il risultato utilizzando varie granulometrie polistirolo e piezo guida tensioni che dimostrano i parametri di funzionamento necessari per la separazione efficiente. In generale, tensioni superiori (cioè maggiori forze acustici) sono necessari per estrarre le particelle più piccole, come previsto. Tensioni unità non può essere a tempo indeterminato aumentati, però, a causa di una maggiore dissipazione del calore e crescenti effetti di streaming acustico. 13 La trama serve come guida generale per particelle dimensioni separazione delle particelle che mostrano il recupero significativamente diversa ad una tensione un&#39;unità specifica (ad esempio, 10- e le particelle a 2 micron a 8.8 V pp) si separeranno bene. In generale, le popolazioni di particelle con una grande differenza di dimensioni, come ad esempio i virus (~ 100 nm) e le cellule (~ 10 micron) possono essere separati rapido ed efficiente, così come le cellule di diffdimensioni erenti (ad esempio, 6-8 micron eritrociti discoidali e 8-15 micron leucociti). Le condizioni specifiche necessarie per lavorare con altri tipi di cellule devono essere determinato empiricamente, come forma delle cellule, densità e compressibilità influenzare il contrasto acustica, oltre alla dimensione della cella. A tal fine, le procedure nel passaggio 4 sono utili per determinare condizioni di separazione utilizzabili per qualsiasi nuovo tipo cellulare o particelle, e non solo per valutare la qualità di un particolare dispositivo acoustophoresis. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> Figura 7. La separazione efficienza di Cell-Virus campioni addizionati. Separazione è il risultato di (A) Raji cellule addizionati con il virus Dengue (DENV) e (B), le cellule Raji e cellule renali Boa a spillo con il Golden Gate Virus (GGV). Percentuali raccolti sono definiti come la frazione di virus o cellule in uscita da una specificaoutlet rispetto alla quantità totale in uscita dal chip. Le barre di errore per (A) sono la deviazione standard di 3 studi, mentre i campioni in (B) sono stati trattati solo una volta a causa delle basse quantità disponibili. 1x PBS è stato usato come fluido tampone campione e recupero, con acqua nel canale di bypass per tutti gli esperimenti. Frequenze di funzionamento di chip erano compresi tra 1,60 e 1,64 MHz, con tensioni di unità tra i 16 ei 20 V pp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per dimostrare l&#39;utilità di questa piattaforma per la separazione di particelle biologiche, in primo luogo abbiamo usato per processare campioni biologici ben caratterizzati: cellule Raji umane (10 5 cellule / ml, diametro medio 8-10 micron 25) narcotizzati dai virus della dengue (DENV, 10 5 pfu / ml, diametro approssimativo di 50 nm 26). Figura 7A mostra la percentuale di cellule Raji e DENV raccolti sia nel SPO e LPO (definito come la frazione di ciascun tipo di particella raccolti da ogni uscita rispetto alla quantità totale di ciascuna particella raccolti dal chip). L&#39;esperimento è stato ripetuto in triplicato, e cellule Raji sono stati quantificati usando un contatore Coulter, mentre DENV stata quantificata utilizzando una trascrizione inversa polymerase chain reaction quantitativa (RT-qPCR). Successivamente, le prestazioni del sistema è stato testato in uno scenario che è più realistico per la lavorazione di campioni clinici, in cui le caratteristiche fisiche delle particelle esatte possono essere sconosciuti, e le quantità di campione disponibili sono inferiori. Qui, abbiamo valutato la separazione del virus golden gate recentemente identificati (GGV), un serpente patogeno di infettare cellule renali boa constrictor. 27 La dimensione della particella virale GGV non è ancora stata misurata, ma dal momento che GGV appartiene alla famiglia Arenaviridae, esso è probabile di undimensioni simili, tra 100 e 150 nm. 28 Abbiamo elaborato campioni GGV spillo (10 4 pfu / ml) in cellule Raji umane (e non un obiettivo di infezione per il virus), e le cellule boa renali (bersaglio dell&#39;infezione per GGV, dimensione approssimativa 10 27 micron), con entrambi i tipi di cellule a 10 4 cellule / ml. Poiché questi campioni erano disponibili in piccole quantità, separazione è il risultato di un solo periodo sperimentale sono riportati in questo lavoro. La figura 7B mostra la percentuale di cellule Raji, cellule Boa, e GGV raccolti da SPO e LPO. Le cellule sono state quantificate in questi esperimenti contando su un emocitometro e virus sono stati quantificati mediante RT-qPCR.

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A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Una piattaforma per l&#39;elaborazione di precisione Microfluidic piccola Volume del campione e il suo uso per Dimensione particelle biologiche separate con un Microdevice Acoustic

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K Views.  Lawrence Livermore National Laboratory. This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15–1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Video: A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice