This work was performed under the auspices of the U.S. Department of Energy by Lawrence Livermore National Laboratory under Contract DE-AC52-07NA27344, and partially supported by LLNL&#8217;s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) program, 14-LW-077. The authors thank Michael Wilson, Mark Stenglein and Joe DeRisi at the Univeristy of California, San Francisco for generously providing GGV and Boa cell samples. EJF acknowledges support from the LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS acknowledges support from the UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

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The authors have nothing to disclose.

Ce protocole présente l&#39;intégration au niveau du système de dispositifs microfluidiques à l&#39;équipement macroscopique pour effectuer le traitement automatique de l&#39;échantillon biologique. La modularité de cette plate-forme lui permet d&#39;être adaptable à tout appareil à flux continu, et, à titre d&#39;exemple, le protocole présenté met l&#39;accent sur la caractérisation et l&#39;optimisation des performances d&#39;un dispositif de séparation de particules acoustofluidic. Trois avantages majeurs de ce protocole sont mis en évidence: (i) la modularité et de la puce-à-monde interfaçage, (ii) la caractérisation robuste des performances de l&#39;appareil, et (iii) le traitement automatisé des volumes d&#39;échantillons dosées avec précision pour la séparation de particules. je. Modularité et puce-à-monde interfaçage Comme le montre la figure 2, la puce microfluidique est monté sur une planche à pain de commande pour adapter facilement sur ​​une platine de microscope pour l&#39;observation directe. La planche à pain contient # 6-40 trous filetés UNF sur une grille 5 mm à pas, enabling la puce d&#39;être fixé, et les raccordements de fluides à faire. Les connexions de fluide sont PEEK tubes avec extrémités usinées, qui joint contre la puce fluidique avec un joint d&#39;étanchéité en caoutchouc face et un collier en acier inoxydable. Ce schéma d&#39;interface fait pour faciliter le remplacement de la puce et la refonte de l&#39;appareil rapide, nécessitant peu ou pas de changements à d&#39;autres composants du système, fournis empreintes de puces conformes au format de la grille. Par exemple, nous avons utilisé cette plate-forme avec des puces microfluidiques pour l&#39;électrophorèse à flux continu, la lyse cellulaire thermique, 29 un mélange rapide des réactifs pour la synthèse chimique, et la capture une seule cellule et les interrogatoires. je je. La caractérisation de la performance robuste de l&#39;appareil Afin d&#39;optimiser la performance de tout dispositif de séparation microfluidique, son fonctionnement doit d&#39;abord être caractérisé à fond. Le système décrit ici soutient le développement de protocoles rapides et automatisées pour ce faire. Pour l&#39;Exemp spécifiquele de dispositifs acoustiques se concentrant, la qualité en mettant l&#39;accent, fréquence de fonctionnement, et la position des particules concentrées dans le canal microfluidique doit être mesurée pour chaque dispositif individuel. Ces mesures nécessitent balayant une gamme de fréquences d&#39;entraînement piézocéramique, des tensions et des débits, d&#39;identifier les combinaisons de paramètres optimaux pour la séparation de haute qualité. Le protocole présenté varie automatiquement ces paramètres accordables et capture l&#39;pertinent de données à-dire, des images fluorescentes de particules circulant dans le canal qui sont post-traitées pour générer les mesures requises de particules de focalisation qualité, la fréquence et la position (Figure 3). Caractérisation complète de la performance du dispositif acoustique nécessite la répétition des étapes 4.4 et 4.5 que nécessaire dans différentes conditions expérimentales. Par exemple, la position de focalisation absolue d&#39;une puce se trouve en exécutant le balayage de fréquence à des débits relativement faibles et haute tensions afin d&#39;assurer une migration complète de l&#39;emplacement du noeud. En outre, ces analyses de fréquence peuvent évaluer la qualité de l&#39;assemblage de l&#39;appareil (lorsqu&#39;il est exécuté avec des billes de polystyrène de taille connue), ou pour déterminer comment un type de particules précédemment inconnue va se comporter dans le système (après une puce a été caractérisé avec des perles). Une puce avec un bon transfert d&#39;énergie à partir de la piézocéramique au canal microfluidique entraînera concentrant serrée à débits élevés (&gt; 1 ml / min) et de faibles tensions (12-15 V pp), tandis que ceux avec un transfert d&#39;énergie pauvres ne se concentrer encore à des débits faibles (&lt;100 pi / min) et des tensions élevées (&gt; 20 V pp). Nous avons trouvé que le contact intime entre la puce microfluidique et de la piézocéramique est essentiel pour le transfert efficace de l&#39;énergie dans le fluide. Une enquête plus approfondie de la méthode optimale de collage de la puce microfluidique et de la piézocéramique permettra une production fiable de dispositifs de haute performance. Enfin, un système completimage du fonctionnement d&#39;un dispositif acoustophoretic peut être obtenu en combinant le balayage de fréquence des mesures de l&#39;étape 4 (et la figure 3) le nombre de particules collectées à partir de la SPO et la LPO en fonction de paramètres de fonctionnement pertinents basés sur l&#39;image, à partir d&#39;expériences de séparation effectuées avec des microsphères , comme décrit dans l&#39;étape 5. Comme le montre la figure 6, une telle série d&#39;expériences automatisés peut rapidement caractériser la performance d&#39;accordabilité et un dispositif individuel, informer l&#39;utilisateur de l&#39;espace de paramètres optimal pour faire fonctionner le dispositif pour la séparation de particules. iii. Le traitement automatisé de petits échantillons pour la séparation de particules Pour le traitement des échantillons microfluidique à base de copeaux de succès et précis, il est essentiel de manière fiable et précise mètres, charge, délivre, et de recueillir les volumes de fluide à mesure qu&#39;ils traversent. Cette précision est particulièrement importante lorsque le volume d&#39;échantillon est petit(~ 0,1-1 ml), ce qui est commun dans les paramètres de laboratoire cliniques ou de recherche. 30 manipulation de l&#39;échantillon précis est difficile dans des expériences microfluidiques traditionnels qui emploient le retrait manuel de l&#39;échantillon dans une seringue et de perfusion dans un dispositif sans évaluations de quand l&#39;échantillon a été séparé et quand il doit être recueilli. Le protocole présenté emploie automatisé échantillon bobine de chargement et de distribution couplée avec une rétroaction en temps réel à partir de capteurs de débit pour permettre aux séparations reproductibles de petits volumes d&#39;échantillons. La figure 5 montre les profils de débit mesurés à la SPO LPO et à partir d&#39;une expérience typique de séparation. Premièrement, leader tampon d&#39;au moins 35 pi est chargé d&#39;assurer l&#39;écoulement stable avant de l&#39;échantillon atteint la puce acoustique. Exemples de volumes inférieurs à 100 pi ne sont pas recommandés pour cette configuration du système, parce que la dilution des échantillons en raison de la mémoire tampon leader devient excessive. Une prise d&#39;air est utilisé au début de the injection avant que le tampon de premier plan pour séparer la fiche de l&#39;échantillon de fluide qui en résulte, ce qui empêche le mélange et la dilution de l&#39;échantillon et servant d&#39;indicateur pour les capteurs de débit. Après une transitoire initiale comme fluide commence à se déplacer à travers le système, les signaux pointus pic dans les deux points indiquent le passage de la première bulle d&#39;air. Ces transitoires sont suivies d&#39;une longue période de flux stable que l&#39;échantillon traverse le système, puis un autre pic lorsque la seconde bulle d&#39;air passe, et enfin une éventuelle diminution du débit à zéro après l&#39;arrêt de la pompe à seringue. Le passage des bouchons d&#39;air à travers les capteurs de débit est utilisé comme points de déclenchement pour commuter les vannes pour démarrer et arrêter la collecte d&#39;échantillons, minimisant ainsi l&#39;échantillon perdue et la dilution par les volumes de fluides non-échantillons. Closed-loop dosage de volumes d&#39;échantillons transformés élimine le besoin de re-programmer ces valeurs avant le début de l&#39;expérience, chaque fois que l&#39;échantillon d&#39;entrée est modifiée. Cette fonctionnalité estparticulièrement important lorsque le volume de l&#39;échantillon est limitée, par exemple dans le cas d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons cliniques. La surveillance du débit en temps réel contribue également à dépannage; une mauvaise série (par exemple, un sabot de formation dans l&#39;un des points de vente) est immédiatement évident à partir des profils de flux qui en résultent, comme dans la figure 5b. Pour démontrer la flexibilité et l&#39;efficacité de la séparation acoustofluidic utilisant l&#39;architecture du système présenté, MENV purifiée et GGV stocks de virus ont été dopés dans les stocks de cellules et séparé par un traitement par la puce microfluidique. Figure 7a montre que les cellules Raji ont été bien séparés des virus, comme 97 % des cellules Raji sortant de la puce ont été jugés dans le LPO, laissant ainsi un échantillon hautement enrichi du MENV dans le SPO. En comparaison, l&#39;efficacité du MENV séparation était plus faible, avec 70% du MENV quitter la puce trouvé dans le SPO. Cela peut être attribué à un léger mélange de convection induite par les tours de la separatisur le canal, mais plus probablement à des particules de DENV migrateurs avec les cellules Raji dans la LPO. Les cellules migrent latéralement à travers les lignes de courant traînent un peu de liquide avec eux, même à faible nombre de Reynolds. Par ce mécanisme, ainsi que l&#39;adsorption non spécifique de la surface, les particules virales transfert dans la LPO. Néanmoins, l&#39;échantillon hautement enrichi de MDE dans le SPO est un avantage important, par exemple lorsque le séquençage de novo est utilisé pour détecter et identifier les virus. Figure 7b montre que, dans un essai expérimental, seulement environ 70% des cellules Boa sortant de la puce ont été trouvés dans la LPO, comparativement à près de 100% d&#39;efficacité de séparation des cellules Raji. La différence de rendement de séparation entre les deux types de cellules peut être attribuable à une taille moyenne inférieure ou une densité plus faible de cellules Boa par rapport aux cellules Raji, donc résultant en des forces acoustiques plus petites. Pour confirmer ou réfuter ces suppositions, la taille, la densité et la morphologie de Boacellules en suspension (qui poussent normalement adhérente) des cellules Boa doivent être mesurés avec précision, un effort pour complément d&#39;enquête. Dans les mêmes expériences, de manière similaire aux expériences de MDE, la majeure partie de la GGV récupéré est sorti du SPO, indiquant un enrichissement de la fraction virale. Les données présentées mettent en lumière les défis inhérents à l&#39;ingénierie des plates-formes largement applicables pour-traitement d&#39;une variété d&#39;échantillons biologiques. Surtout, les interactions biologiques peuvent commencer à jouer en tant que grand rôle que les effets physiques et mécaniques. Cependant, ces expériences préliminaires montrent également la puissance et la promesse d&#39;utiliser cette architecture de système pour le traitement des échantillons dans des applications cliniques et de recherche. Comme un système robuste, bien caractérisé d&#39;ingénierie, cette plate-forme offre la possibilité de chercher des réponses à de nouvelles questions scientifiques.

La séparation de l&#39;échantillon et le fractionnement est l&#39;un des domaines les plus prometteurs de l&#39;application des technologies microfluidiques. Ces étapes de manipulation des échantillons font partie intégrante des diagnostics cliniques efficaces, le développement de produits thérapeutiques, les efforts de biosurveillance, et les progrès dans la recherche et la technologie des sciences de la vie. Une des stratégies de séparation microfluidiques myriade Il a été démontré pour les particules et colloïdes en suspension fluide, ainsi que des espèces chimiques et biologiques; plusieurs commentaires donnent un aperçu des progrès et des développements récents dans ces domaines 1 - 9. Bien que beaucoup de ces technologies de séparation microfluidiques (ci-après dénommé «Périphériques de base») ont été largement caractérisé, quelques rapports ont considéré le problème de la séparation de l&#39;échantillon à un niveau du système. Les appareils de base sont généralement individuels puces à l&#39;échelle centimétrique, interfacés à un tube de polymère fluoré, avec fluide délivré par un déplacement ou une pression pompe.Pourtant, si la promesse de la microfluidique - y compris l&#39;automatisation, la fiabilité, et la réduction augmenté dans des volumes d&#39;échantillon - est de devenir une réalité, au moins un effort équivalent doit être consacré à la conception d&#39;un système de séparation complet dans lequel le Core dispositif est intégré . En outre, un défi majeur pour les approches microfluidiques à biodétection est le macro au micro interface. Cela concerne non seulement les connexions physiques &quot;monde-à-puce&quot; d&#39;un dispositif microfluidique aux composants macroscopiques, et à l&#39;inadéquation entre les volumes typiques de l&#39;échantillon clinique ou analytique (~ 0,1-10 ml) et le volume interne de puces microfluidiques (~ 0,01 à 10 pi), mais aussi des limitations d&#39;échantillonnage statistique de pontage résultant de ces échelles de taille. Ces problèmes contribuent à la perception que le pré-traitement et de préparation de l&#39;échantillon sont le «maillon faible» de biodétection. La plate-forme 10 décrit dans ce travail TAkes grands pas vers relever ces défis. Prenant une vue de niveau système, ce protocole détaille le traitement fiable des volumes d&#39;analyse à l&#39;échelle précise-dosées (allant de 0,15 à 1,5 ml) sur des échelles de temps ~ 10 min. Cette opération est &quot;un bouton&quot;: une fois le flacon de source contenant les échantillons et de destination des flacons pour la collecte de fractions sont placés dans le système, la commande &quot;Exécuter&quot; initie la procédure, et toutes les étapes sont contrôlés par l&#39;ordinateur. A la fin d&#39;un cycle, les flacons de collecte peuvent être retirés du système d&#39;analyse en aval des fractions séparées. La base périphérique dans ce système est une puce de acoustophorèse qui extrait (5-20 um) des particules de cellules de mammifères de taille de l&#39;échantillon. Acoustophoretic séparation est choisie ici principalement parce qu&#39;il est à haut débit (jusqu&#39;à 100s de pi / min), l&#39;étiquette-libre, et sans contact, offrant ainsi des avantages à séparer viru viableSES à partir de cellules que peu d&#39;autres techniques microfluidiques peuvent égaler. La physique des particules acoustique mise au point ont été largement décrits 11 - 13 et ne sont pas l&#39;objet de ce protocole, mais un bref résumé des concepts sous-jacents suivants pour aider à comprendre l&#39;application à la séparation microfluidique. Les ondes stationnaires ultrasonores de résonance dans des microcanaux remplis de liquide produisent des champs de pression, qui donnent naissance à des forces qui animent particules vers les nœuds de basse pression. L&#39;ampleur de la force dépend du volume de la particule, et sur ​​un facteur de contraste acoustique provenant des densités relatives et des compressibilités de la particule et le fluide de mise en suspension. 14 En tant que tel, acoustique de focalisation est parfaitement adapté à une séparation de taille des cellules (~ 15/07 um) de 50 à 200 nm (~) des particules virales moyenne. Les particules les plus grosses migrent vers un noeud de pression; Toutefois, étant donné l&#39;ampleur de la force est très petit pourparticules de taille inférieure 2-3 pm, ces petites particules ou espèces dissoutes à peine bouger du tout. Notre mise en œuvre spécifique de séparation acoustique, tel que décrit précédemment, comprend 15 une paroi mince pour subdiviser le canal de fluide et permet accordable, le placement asymétrique de la position de focalisation. Cela ajoute flexibilité dans la conception de l&#39;appareil, et les avantages, y compris la performance amélioration de la qualité de la séparation et la vitesse sont entièrement décrits ailleurs. 16,17 Cependant, un avantage majeur de l&#39;approche de conception au niveau du système décrit dans ce travail est qu&#39;il est adaptable à une grande variété de dispositifs microfluidiques de base. Par exemple, la plupart des autres modes de séparation à flux continu, y compris inertielle, de champ d&#39;écoulement fractionnement, déplacement latéral déterministe (DLD), et divers types de dispositifs électrocinétiques peuvent être facilement incorporés, avec les ajustements appropriés effectués pour tenir compte des changements dans la configuration d&#39;entrée / sortie , les débits,et des volumes d&#39;échantillons. Les appareils avec différents types de champs sur puce (électrique, magnétique) ou des gradients (thermiques, chimiques) peuvent nécessiter des connexions supplémentaires à la puce, ou l&#39;intégration de matériel supplémentaire, qui accueille cette plate-forme. Ce protocole prévoit les étapes nécessaires à la conception d&#39;un dispositif de séparation microfluidique, et pour fabriquer des puces silicium-verre par gravure profonde par ions réactifs (DRIE, un processus plasma gravure disponibles dans de nombreux établissements de microfabrication, qui utilise des cycles de gravure et de passivation alternatif pour atteindre profonde caractéristiques avec des parois latérales verticales 18). Ensuite, nous décrivons la caractérisation du dispositif acoustofluidic pour déterminer les paramètres de fonctionnement optimales pour la séparation, et enfin en détail le système de séparation entièrement intégré et la procédure de traitement des échantillons biologiques. Résultats de la caractérisation de dispositif typiques et des données de traitement des échantillons sont ensuite présentés et discutés, et les avantages clés de cette approACH sont mis en évidence, notamment la modularité, robustesse, de précision et d&#39;automatisation.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Polished Silicon Wafer</td>
			<td>Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td>100 mm &#60;100&#62;&#160; prime wafer</td>
			<td>1-20 ohm-cm, 495 +/- 25&#181;m Double-side polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wafer</td>
			<td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td>
			<td>100mmx0.5mm Boro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 1518</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 1518</td>
			<td>Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 4620</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 4620</td>
			<td>Photoresist to define fluidic and via mask patterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE plasma etcher</td>
			<td>STPS, Newport, NP, United Kingdom</td>
			<td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Bonder</td>
			<td>Electronic Visions Group,&#160; St.Florian am Inn, Austria</td>
			<td>EVG 501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicing saw</td>
			<td>Kulicke &#38; Soffa Industries, Singapore</td>
			<td>K&#38;S 982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy kit</td>
			<td>Epoxy Technology, Billerica, MA, USA</td>
			<td>EPO-TEK 301</td>
			<td>Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PZT piezoceramic&#160;</td>
			<td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td>
			<td>PSI-5A4E</td>
			<td>37.5 &#215; 10 &#215; 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 AWG Kynar-insulated solid wire</td>
			<td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td>
			<td>UL1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part silver epoxy&#160;</td>
			<td>MG Chemicals, Surrey, BC, Canada</td>
			<td>8331</td>
			<td>Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-edit</td>
			<td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td>
			<td>Ledit v15.1 64-bit</td>
			<td>CAD software for mask layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>PHD ULTRA Series, 703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringes</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer to Threaded port adapter</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-659</td>
			<td>Connects syringe to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-623</td>
			<td>Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.&#160; Can also use webbed&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160; 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-202</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; OD Fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1912L</td>
			<td>Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.&#160; Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03&#34; ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ID fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1476-20</td>
			<td>Used for Flow restrictors: 0.006&#34; ID, 1/16&#34; OD FEP&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connects from chip to fluoropolymer tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling fan</td>
			<td>Multicomp, Leeds, England</td>
			<td>MC19663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF amplifier</td>
			<td>ENI, Rochester, NY</td>
			<td>325 LA</td>
			<td>Must be able to amplify signals from &#60;1V&#160; in the range of 1-2MHz to 25 Vpp to the piezo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucscon, AZ, USA</td>
			<td>CoolSnap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axiovert S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Tech, VT, USA</td>
			<td>SP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, 10x</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>ACHROPLAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, OR, USA</td>
			<td>TDS3014B</td>
			<td>To monitor voltage output by RF amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks, Natick, MA, USA</td>
			<td>R2014a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW</td>
			<td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td>
			<td>SITK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 &#181;m Beads</td>
			<td>Bangs Laboratory, IN, USA</td>
			<td>FS06F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Additional materials required for Step 5: Automated Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiport valves</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>C25Z-3180EUHA</td>
			<td>In the current configuration 4 valves are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensors</td>
			<td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td>
			<td>SLI-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoropolymer tubing, .01 and .03&#34; ID</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1902L and 1912L</td>
			<td>High purity PFA preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160;</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZN1PK-10</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and valves.&#160; Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZGF1PK-10</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and valves.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td>LabVIEW Professional Development system</td>
			<td>Laboratory Automation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Teknova, Hollister, CA, USA</td>
			<td>P0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raji Cells</td>
			<td>ATTC, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CCL86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boa Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DENV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Jose Pena at LLNL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter Z2</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td>Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td>
			<td>0267151B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for precision small-volume sample processing and its use to size separate biological particles with an acoustic microdevice

Un avantage majeur de dispositifs microfluidiques est la capacité de manipuler petits volumes d&#39;échantillons, réduisant ainsi les déchets de réactif et la préservation de précieux échantillons. Cependant, pour atteindre la manipulation de l&#39;échantillon robuste, il est nécessaire d&#39;aborder l&#39;intégration de l&#39;appareil avec l&#39;environnement macroscopique. Pour réaliser la séparation des particules reproductible, sensible avec des dispositifs microfluidiques, ce protocole présente une plate-forme microfluidique automatisée et intégrée complète qui permet un traitement précis de 0.15-1.5 ml échantillons en utilisant des dispositifs microfluidiques. Les aspects importants de ce système comprennent conception modulaire de l&#39;appareil et des accessoires robustes résultant dans le monde fiable et flexible à puce connexions, et la manipulation de liquide entièrement automatisé qui réalise le prélèvement d&#39;échantillons en boucle fermée, le nettoyage du système et d&#39;amorçage des mesures pour assurer un fonctionnement reproductible. Dispositifs microfluidiques différents peuvent être utilisés de façon interchangeable avec cette architecture. Ici, nous incorporons un dispositif acoustofluidic, détail son characterization, optimisation des performances, et de démontrer son utilisation pour la taille-séparation des échantillons biologiques. En utilisant la rétroaction en temps réel au cours des expériences de séparation, la collecte de l&#39;échantillon est optimisée pour conserver et concentrer l&#39;échantillon. Bien que nécessitant l&#39;intégration de plusieurs pièces d&#39;équipement, les avantages de cette architecture comprennent la capacité de traiter des échantillons inconnus sans aucune optimisation supplémentaire du système, la facilité de remplacement de l&#39;appareil, et précis, le traitement des échantillons robuste.

Les principales caractéristiques de la conception du dispositif acoustique-microfluidique sont mis en évidence dans la figure 1, et décrits en détail ailleurs. 15 En bref, côte-à-côte deux courants de fluide écoulement dans un canal de séparation, séparé d&#39;un canal de dérivation parallèle par une paroi mince de silicium. Etant donné que la magnitude de la force de rayonnement primaire évolue avec le volume des particules, les grosses particules migrent hors du flux d&#39;entrée mixte-échantillon vers le noeud de pression acoustique situé dans le flux de fluide de récupération adjacente, tandis que les petites particules restent dans le flux initial (figure 1B, C). L&#39;architecture à deux canaux subdivisé améliore la séparation des particules 17 et permet l&#39;ajustement de la position de noeud à l&#39;aide de différents fluides du canal de dérivation. 16 La planche à pain et appareils fluidique fournit une plate-forme robuste pour monde à la puce connexions, et la conception modulaire permet un changement rapide entre les puces fluidiques (Figure 2). Ce configuration permet également des connexions fluides réversibles, qui joint jusqu&#39;à 1000 psi, être prises rapidement et de manière fiable (Figure 2B, E). La fréquence de résonance f res d&#39;une puce peuvent être estimées en utilisant des calculs analytiques 1D simples (voir l&#39;étape 1.1.1). De plus complète d&#39;un modèle par éléments finis 2D de notre section transversale de l&#39;appareil, 16 la position de focalisation attendue pour une résonance à 2 225 um noeud est de la paroi et la fréquence attendue est 1,68 MHz. Cependant, f res de dispositifs réels peuvent varier de ± 100 kHz, en fonction de la température de fonctionnement et du couplage de résonances longitudinales et latérales. Par conséquent, après le montage de l&#39;appareil, f res doivent être vérifiées empiriquement à des débits pertinents et des tensions de commande piézoélectrique, tel que décrit dans l&#39;étape 4 du protocole. La figure 3 montre balayages en fréquence représentant prises à 200 pi / min,<html> avec de l&#39;eau dans les principales et de dérivation des canaux, et 20 V pp fourni à la piézo. Lors de l&#39;accouplement entre le piézo et dispositif microfluidique est bonne, les particules vont se concentrent étroitement à la fréquence de résonance, ce qui entraîne un pic clair dans l&#39;intensité de la fluorescence et la migration vers la position de focalisation prévu (figure 3A). En revanche, quand il ya un mauvais couplage, les particules ne se concentrera pas bien et les résultats de l&#39;analyse de fréquence seront similaires à la figure 3B. Dans de tels dispositifs, le transducteur piézoélectrique peut avoir besoin d&#39;être ré-montée, si un adhésif réversible a été utilisé; autrement, ce dispositif est inadapté quand de haute qualité en mettant l&#39;accent ou le débit rapide sont essentiels pour l&#39;application requise. Les données de la figure 3 informent le choix de la fréquence de fonctionnement pour des expériences ultérieures, et la tension et de la plage de débit disponible pour les particules efficace séparation. fichiers / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; Figure 5. automatisé de traitement de l&#39;échantillon. (A) Schéma d&#39;échantillon chargé dans la bobine de l&#39;échantillon. (B) de profil d&#39;écoulement Représentant d&#39;une expérience de séparation réussie. (C) Débit profil d&#39;une séparation de fonctionner au cours de laquelle la sortie SPO bouché à environ 220 sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Après avoir identifié les puces qui sont des séparateurs efficaces, ils sont incorporés dans le système représenté sur la figure 4. Système Volume total balayé est minimisée en utilisant des tubes avec 0,01 &quot;de diamètre intérieur le long du trajet d&#39;écoulement principal (lignes bleues). La figure 5A illustre le maquillage d&#39;un bouchon d&#39;échantillon typique infusé à travers le système. Une petite quantité de &quot;leader tampon&quot; (~ 35 pi) est nécessaire pour Precede l&#39;échantillon dans le flux d&#39;éliminer les fluctuations de débit tandis que l&#39;échantillon se déplace à travers la puce de séparation. La figure 5B montre les données de flux résultant d&#39;une expérience réussie de séparation acoustique automatisé. Principales caractéristiques d&#39;une course réussie comprennent: (1) une augmentation transitoire du débit à la fois dans la LPO et le SPO que la pression monte et le liquide commence à couler à travers le système, (2) un pic aigu indiquant le passage d&#39;une bulle d&#39;air (la encart montre un profil élargi d&#39;une seule bulle), qui devrait atteindre le SPO avant la LPO en raison de l&#39;écoulement inégale des deux points, (3) flux stable à travers les deux points entre les deux bulles d&#39;air que l&#39;échantillon se déplace à travers le système, et (4) une diminution progressive du débit dans les deux points après que le volume de l&#39;échantillon complet est remis au système. Essais problématiques sont immédiatement apparents à partir de profils d&#39;écoulement similaires à la figure 5C, où il apparaît que le SPO est devenu bouché après environ 220 secondes. Dans thi<html> s cas, une procédure de nettoyage analogue à celle décrite à l&#39;étape 5.3 doit être exécuté pour déboucher le canal. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> Figure 6. Dispositif accordabilité: taille des particules et des effets de tension. Pour cent des microsphères de polystyrène extraites dans la LPO dépend de la taille des particules et la tension fournie à la piézocéramique. Chaque ligne correspond à une tension de fonctionnement différent à la fréquence de résonance, déterminée comme décrit à l&#39;étape 4. Le débit total à travers le dispositif est de 200 pi / min, avec des fréquences d&#39;entraînement appliquée entre 1,62 et 1,64 MHz. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart type d&#39;au moins trois expériences séparées. Reproduit et modifié par la permission de la Société royale de chimie de http://pubs.rsc.org / fr / content / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. La figure 6 montre les résultats compilés de séparation à l&#39;aide de différentes tailles de particules de polystyrène et des tensions d&#39;entraînement piézo-électriques qui illustrent les paramètres nécessaires pour une séparation efficace de fonctionnement. En général, des tensions plus élevées (à savoir, les forces acoustiques plus) sont nécessaires pour extraire les particules plus petites, comme prévu. Tensions d&#39;entraînement ne peuvent pas être indéfiniment augmenté, cependant, en raison d&#39;une meilleure dissipation de la chaleur et de plus en plus des effets de la diffusion acoustique. 13 L&#39;intrigue sert de guide général pour les tailles de séparation de particules particules qui montrent la récupération significativement différents à une tension de commande spécifique (par exemple, 10 et les particules de 2 um à 8,8 V pp) se séparent ainsi. Généralement, les populations de particules avec une grande différence de taille, tels que les virus (~ 100 nm) et les cellules (~ 10 um) peuvent être séparés rapidement et efficacement, tout comme les cellules de différentes tailles (par exemple, 6-8 pm érythrocytes discoïdes et 8-15 pm leucocytes). Les conditions spécifiques requises pour travailler avec d&#39;autres types de cellules doivent être déterminées empiriquement, que la forme des cellules, la densité et la compressibilité affecter son contraste acoustique, en plus de la taille de la cellule. À cette fin, les procédures de l&#39;étape 4 sont utiles pour déterminer les conditions de séparation utilisables pour tout nouveau type de cellule ou de particules, et non seulement pour évaluer la qualité d&#39;un dispositif de acoustophorèse particulier. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> Figure 7. efficacité de séparation de Cell-Virus échantillons enrichis. Séparation résulte de (A) cellules Raji dopés avec des virus de la dengue (DENV) et (B) cellules Raji et les cellules de rein de Boa dopés avec Golden Gate Virus (GGV). Les pourcentages sont collectées sont définies comme la fraction de virus ou de cellules sortant un spécifiquela sortie par rapport à la quantité totale sortant de la puce. Les barres d&#39;erreur pour (A) sont l&#39;écart type de 3 essais, tandis que les échantillons de (B) ont été traitées uniquement une fois en raison des faibles quantités disponibles. 1x PBS a été utilisé comme fluide de tampon d&#39;échantillon et de récupération, avec de l&#39;eau dans le canal de dérivation pour toutes les expériences. Fréquences de fonctionnement de Chip variaient entre 1,60 et 1,64 MHz, avec des tensions d&#39;entraînement entre 16 et 20 V pp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Pour démontrer l&#39;utilité de cette plate-forme pour la séparation de particules biologiques, nous avons d&#39;abord utilisé pour traiter des échantillons biologiques bien caractérisés: les cellules humaines Raji (10 5 cellules / ml, diamètre moyen 8-10 um 25) dopés par le virus de la dengue (de MENV, 10 5 pfu / ml, diamètre d&#39;environ 50 nm 26). Figure 7A montre le pourcentage de cellules Raji et DENV recueillies à la fois dans le SPO LPO (définie comme la fraction de chaque type de particules ont été recueillies à partir de chaque orifice de sortie par rapport à la quantité totale de chaque particule collectées depuis la puce). L&#39;expérience a été répétée en triple exemplaire, et des cellules Raji ont été quantifiés en utilisant un compteur Coulter, tandis que MDE a été quantifiée en utilisant une réaction en chaîne polymerase à transcription inverse quantitative (RT-qPCR). Ensuite, les performances du système a été testé dans un scénario qui est plus réaliste pour le traitement d&#39;échantillons cliniques, dans lequel les caractéristiques physiques exactes des particules peut être inconnue, et les quantités d&#39;échantillons disponibles sont plus faibles. Ici, nous avons évalué la séparation du virus de la porte d&#39;or récemment identifiés (GGV), un serpent pathogène infectant des cellules de rein boa constrictor. 27 La taille de la particule virale GGV n&#39;a pas encore été mesurée, mais depuis GGV appartient à la famille Arenaviridae, il est susceptible d&#39;untaille similaire, entre 100 et 150 nm. 28 Nous avons traité des échantillons avec GGV dopés (10 4 pfu / ml) dans les cellules Raji humaines (pas une cible de l&#39;infection par le virus), et les cellules boa rénaux (cible de l&#39;infection pour GGV, taille approximative 10 27 um), avec deux types de cellules à 10 4 cellules / ml. Comme ces échantillons étaient disponibles en faibles quantités, la séparation résulte de seulement un essai expérimental sont rapportés dans ce travail. La figure 7B montre le pourcentage de cellules Raji, cellules Boa, et GGV collectées auprès de la SPO et la LPO. Les cellules ont été quantifiées dans ces expériences par comptage sur un hémacytomètre et les virus ont été quantifiés par RT-qPCR.

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A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Une plate-forme microfluidique pour le traitement de précision de petit volume échantillon et son utilisation pour Taille séparer les particules biologiques avec un Microdevice acoustique

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

a-microfluidic-platform-for-precision-small-volume-sample-processing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K vues.  Lawrence Livermore National Laboratory. This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15–1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Vidéo: A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice