This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת אילינוי. כל בעלי החיים שוכנו במתקני טיפול בבעלי החיים אושרו על ידי האגודה האמריקנית להסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים. כל נעשה ניסיון לצמצם את מספר בעלי החיים המשמשים ולהפחית את סבל בכל שלבי המחקר. 1. הכנה ולהסרה של מוח מהעכבר לחיתוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו לזלוף ודגירה פרוסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 30 דקות לפני חיתוך, להכין פתרון גבוה סוכרוז חיתוך וaCSF סידן הנמוך לדגירה של הפרוסה לפני הקלטה או הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את כל הכלים הדרושים (מספריים גדולים בוטים סוף, מספריים אביב קטנים, מלקחיים אנטומיים, מספריים או הגיליוטינה גדולים, איריס מספריים, מלקחיים תכשיטנים, מזרק 10 מיליליטר עם מחט 27G x 1/2 אינץ &#39;, חתיכה קטנה של 1 סנטימטר מסנן x 2 סנטימטר נייר, ונשבר פיפטה פסטר הטתה לslקרח העברה) לזלוף וחיתוך, ולהכין מגש טפטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה דוגרות קאמרי עם aCSF מחומצן באמבט המים C 32 O ומנת תרבות מלא בחיתוך פתרון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיתוך במה לחיתוך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חתיכה קטנה של אגר 3% כ 1 סנטימטר 3 להשתמש כבלימה למוח ושל 1.5 סנטימטרים X 1.5 מ&quot;מ x 3 מ&quot;מ לבליטה לשמש כדי לתמוך IC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביקים את הבלימה לבמה עם דבק cyanoacrylate כמו גם הבליטה בצד ימין של הבלימה כך שהם יוצרים זווית 80 o. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק להרדים P12-P20 עכבר (באופן אידיאלי p14-18) עם קטמין 100 מ&quot;ג / קילוגרם וxylaxine 3 מ&quot;ג / קילוגרם (הליך או אישר ועדת אתיקה דומה). הערה: ודא רמת הרדמה נכונה באמצעות חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן. כבעלי החיים נמצאים תחת הרדמה לזמן קצר, משחת עיניים הוא מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בוטהבסופו של מספריים, לחשוף את בית החזה מתהליך xiphoid לצוואר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את תהליך xiphoid, ולעשות חתך אופקי של כ -1.5 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני חתכים אנכיים מקצות החתך האופקי הקודם לכתפיים, כ -1.5 סנטימטרים כל אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך דרך הסרעפת וצומת costochondral כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים באביב קטנים, לעשות מ&quot;מ לחתוך בעלייה הימנית קטן, 2-5, מהגחון לצד הגבה של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 10 מיליליטר עם מחט 27G x 1/2 אינץ &#39;, להזריק החדר השמאלי וינקב את החיה עם פתרון חיתוך סוכרוז גבוה במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדם מפעיל ברור, להשתמש במספריים גדולים כדי להסיר את הראש. הערה: יש לנו לא באופן שיטתי להעריך את התועלת של זלוף. עם זאת, בניסיון שלנו, זלוף transcardiac בעכברים צעירים זה יכול להיעשות בהצלחה כמעט 100%, ויש לי היתרון של ביטול BL האדוםתאי OOD, אשר יכול לזרוח ולהפריע להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור כלפי מטה את קו האמצע לחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת המספריים איריס הכפופה, לחתוך את הגולגולת בין העיניים, ואז החל מהחתך בין העיניים, לחתוך בזהירות מקדמית לאחוריים לאורך טיפול לקיחת תפר קו האמצע שלא לפגוע במוח מתחת. הערה: הדורה בדרך כלל מגיעה מעם הגולגולת. אם יש צורך, להסיר את הדורה לפני הסרת המוח בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים תכשיטנים, לפתוח את הגולגולת ובזהירות להסיר את המוח, ואז למקם את המוח בחיתוך פתרון. דואג כדי למנוע נזק לקליפת המוח. </li></ol></li></ol> 2. הכנת המוח לחיתוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מוח להרכבה על vibratome שלב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שקופיות מסומנות בשני קווים ב -90 o וקו אלכסוני על 17 o מהחלק העליון משמאל לימין תחתון, מצטלב בו שתי השורות לעמוד, הנח את צד גב המוח עד, באמצעותסכין גילוח, להסיר 2-4 מ&quot;מ של מוח הסוף מקורי יצירת משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צד הזנב המוח על המשטח השטוח החדש שנוצר, וליישר את פני השטח הגבי של המוח עם אופקי וקו האמצע של המוח עם הקו האנכי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את סכין הגילוח עם קו 17 O, להטות את התער בזווית של 30 O ולהסיר כ 3 מ&quot;מ של זכות הקליפה בחתך אלכסוני כפול (17 o ממישור אופקי ו -60 o מהעטרה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה מוח על vibratome שלב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכה קטנה של נייר סינון 1 ס&quot;מ על 2 סנטימטר בצד הגחוני של המוח, כך שממד הזמן הוא בניצב לקו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות להחיל כמות קטנה של דבק cyanoacrylate לאזור מול הבלימה (ומהשמאל לבליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המוח לחתוך באלכסון הכפול על לדבק כך שחלק הזנב של המוח והמוח האחורי הם יחסי ציבורopped על הבליטה והצד הימני של המוח הוא נגד הבלימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ כלפי מטה בעדינות על המוח, על מנת להבטיח שכל השטח הוא במגע עם תא החיתוך. </li></ol></li></ol> 3. קבלת Colliculo-thalamocortical Slice <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לקחת את שלב החיתוך והמקום בvibratome, למלא את הבמה עם חיתוך פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הלהב עם הראש (צד הגחון) של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 1-1.5 מ&quot;מ מהחלק העליון של המוח, להסיר 300-500 מיקרומטר פרוסות ולהעריך עומק לאחר ההסרה. הערה: כאשר IC, מג&quot;ב, וגרעין רוחב ברך (LGN) כל ​​גלוי, והרכס המשונן יוצר צורה &quot;C&quot; לקחת 1-2 600 מיקרומטר פרוסות. ראה איור 3 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות מקום בתא מחומם (32 מעלות צלסיוס) מחזיק. </li></ol> 4. הדמיה של הפרוסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה להדמיה autofluorescence flavoprotein. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; הכן aCSF לטפטוף של הפרוסה בתא הקלטת אלקטרו סטנדרטי, aCSF בועה עם 95% O CO 2/5% 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך אלקטרודת זכוכית לגירוי. שים לב שאלקטרודות מרובות שונות המגרה ותצורות (זכוכית, טונגסטן, סיבי פחמן, monopolar, דו-קוטבית) כל העבודה טובה מאוד בשילוב עם ההדמיה autofluorescence flavoprotein. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב, מצלמה, micromanipulator, מקור אור, תוכנת גירוי, תוכנה ללכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse חדר ההקלטה עם aCSF מחומצן, למקם גשר מותאם אישית (עיצוב זמין בחומרים נוספים) כדי להעלות את הפרוסה בתא. הערה: שיעור זלוף יכול להשתנות עם כל אדם להגדיר; 5-15 מיליליטר / דקה משמשת כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פרוסה בתא, להפחית את רמת הנוזל בתא כדי למנוע את הפרוסה מההרמה מהגשר תוך שימת נבל שנבנה במיוחד על פרוסה, לטפל כדי למנוע הצבת מיתרי נבל על מסלולים של היתרest (איור 1 א). הגדל את רמת נוזל לכ 1-2 מ&quot;מ מעל הפרוסה כדי לשמור על זרימת aCSF מעל ומתחת פרוסה. הערה: אם יש צורך המיצוב מחדש, להשתמש בפיפטה פסטר הסוף נשברה או לאפשר רמת aCSF לעלות ולהשתמש במלקחיים בזהירות רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס אלקטרודה כלוריד כסף לאלקטרודת זכוכית מלאה בaCSF, הכנס את אלקטרודת הזכוכית לתוך micromanipulator ולהתחבר לגירוי מבודד, ולמקם את אלקטרודת זכוכית בIC / חומר לבן המוביל לתלמוס בזהירות (ראה איור 1 א). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Flavoprotein רכישת תמונת autofluorescence. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות ב 4 הרץ (באמצעות אובייקטיבי מאקרו-תיקן אינסוף 2X (NA 0.13)) ומצלמה ל105 שניות בזמן גירוי חשמלי (כל גירוי מורכב משניות 1 של רקמת פולסים 2 אלפיות שנייה 40 הרץ ב0.05 הרץ חמש פעמים) ואילו מאיר הרקמה עם ננומטר תכלת 470-490 ולכידה מעל 515 ננומטר. ודא שהתמונה היא לא לאיור ראה o כהה, ולא פוצץ את 3 עזב טור להתייחסות. הערה: זמן אוסף, תדירות אוסף, ותדירות גירוי ניתן לשנות כדי שיתאימו לניסוי, התכנית המותאמת אישית כלולה בחומרים משלימים יכול להיות שונה כאמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצוא תמונות לMatlab, ובאמצעות התכנית שנכתבה בהתאמה אישית בחומרים משלימים לנתח כוח רפאים של התמונות ב0.05 הרץ. התמונה המתקבלת תציג מסלולים מחוברים. הערה: התכנית המותאמת אישית משתמשת פורייה מהיר לשנות את ערכי פיקסל בסדרת הזמן כדי לייצר את התמונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה להדמיה סידן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא דגירה קטן באמצעות צלחת תרבות 3 סנטימטר וקרום התרבות העלה לאפשר aCSF להגיע גם חלק עליון ותחתון של הפרוסה, ומקום על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורה בכ 32 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא תא דגירה קטן עם aCSF החם ולאט בועה עם 95% O2/5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 2 μl של חומצת F-127 pluronic ו -50 מיקרוגרם של הפורע-2:00 מומסים בμl 48 של DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסת מקום בתא דגירה קטנה בקרום גדל ובאמצעות micropipette בזהירות להוסיף תערובת צביעה ישירות מעל מג&quot;ב (או מבנה אחר של עניין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות פרוסות כדי למנוע הלבנה לפני ההדמיה, ולאפשר פרוסות כדי לדגור על 45 דק &#39;- שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פרוסות לתא החזקה מחוממת למשך 10-15 דקות כדי לשטוף את החומר עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב 4.1.1 צעדים ל4.1.6 להכנה כדי לעורר ותמונה הפרוסה colliculo-thalamocortical. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונת סידן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות ב 10 הרץ (באמצעות אובייקטיבי 20x טבילה במים) במשך 25 שניות בזמן הגירוי חשמלי (כל גירוי מורכב מדופק 2 אלפיות שני אחת) רקמה על 0.2 הרץ חמש פעמים תוך מאיר את הרקמה עם 365 ננומטר אור ולכידת הקרינה מעל 510 ננומטר. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצוא תמונות לMatlab ושימוש בתכנית אישית בכתב זמינה בחומרים משלימים לנתח כוח רפאים של התמונות על 0.2 הרץ. התמונה המתקבלת תציג תאים פעילים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse.">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li><li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+(barrel)+cortex+in+vitro.">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li><li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro.">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li><li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway.">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li><li>MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+thalamocortical+slice.">A visual thalamocortical slice.</a> Nat meth. 3, 129-134 (2006).</li><li>Crabtree, J. W., Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+intrathalamic+pathways+allowing+modality-related+and+cross-modality+switching+in+the+dorsal+thalamus.">New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus.</a> J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).</li><li>McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attentional+Modulation+of+Thalamic+Reticular+Neurons.">Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons.</a> J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).</li><li>Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attentional+Orienting+Is+Impaired+by+Unilateral+Lesions+of+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+in+the+Rat.">Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat.</a> J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).</li><li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms.">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li><li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Paradigm+for+Optical+Imaging:+Temporally+Encoded+Maps+of+Intrinsic+Signal.">New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal.</a> Neuron. 38, 529-545 (2003).</li><li>Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+cortical+inhibition+in+an+aging+mouse+model+of+chronic+tinnitus.">Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus.</a> J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li><li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning.">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li><li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse:+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy.">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to...

במערכת השמיעה, אם כי יש עיבוד משמעותי של מידע בין הפריפריה החושית וcolliculus הנחות, יש עיבוד נוסף רב לפני שהוא מגיע לקליפת המוח השמיעתי. אנחנו יודעים מעט מאוד על איך העיבוד שנעשה ולכן קצת על איך שינוי שמאפשר למוח לפרש מידע חושי. למעט חוש ריח, כל אחד מהחושים יש ארגון דומה מאוד עם אותות היקפיים בתחילה שהעבירו עם איכות גבוהה שיורדת כאות עולה לקליפת המוח. הקליפה לאחר מכן שולחת תחזיות למבנים נמוכים יותר לווסת את המידע הנכנס נוסף. מערכת מורכבת זו נחקרה במגוון הדרכים in vivo, כמו גם במספר ההכנות במבחנה. בעבר, כל החיבורים שלמים, המאפשרים לחוקר לחקור כל מערכת של קשרים, תוך שליטה על הקלט החושי ומדידהתפוקה בכל אזור נתון. עם גישה זו, יש לא מעט שליטה על המגוון הרחב של תשומות אחרות, כוללים תשומות אחרות חושיות, עוררות, ותשומת לב, והוליד פלט עוצמה מורכב. במבחנה, פרוסות המוח קוצצו כדי ללכוד או קבוצה אחת של תחזיות, או שני אזורים במוח מקושרים, שתאפשרנה לחוקרים כדי לעורר ולהעריך שונים afferents או אזורים במוח. אלה הם בדרך כלל פרוסות או thalamocortical או tectothalamic בי או הקלט לתלמוס או התלמוס והתפוקה שלה לקליפת המוח נשמרים 2-5. הכנות אלו מאפשרות מגוון רחב של מניפולציות תרופתיות, חשמל, וoptogenetic. עם זאת רק עם שני אזורים במוח, הם בעיקר להעריך את העברת המידע וחוסר היכולת להעריך את הפיכתו של המידע כפי שהוא עובר דרך התלמוס. גם ההקרנה reticulo-התלמוס, שעשוי לשחק תפקיד באפנון תשומת לב היא 6-9 יחסי ציבורesent בפרוסה זו. כאן אנו מדגימים שיפורים על ההכנה הקודמת שלנו 1, המאפשרת שליטת חוקר תשומות שונות להתלמוס לתת נקודת מבט ייחודית של איך מידע שערי התלמוס ומסננים. אנחנו זוג הכנה זה רומן עם פרוסת ההדמיה autofluorescence flavoprotein להערכת קישוריות פרוסה וניתוח הפעלה בקנה מידה גדולה, הדמיה סידן בתלמוס לניתוח אוכלוסייה עצבית, והקלטת תא בודדת כדי למדוד את ההשפעה של התשומות השונות ברמה תא בודדת. כדי לסייע בשמירה על קשרים ענפים אלה יש לנו גם פיתחו מספר השינויים של עוגן פרוסה הרגיל (aka &quot;נבל&quot;) לקיום פרוסת המוח במקום וגשר לרומם את הפרוסה לזלוף משופר. הנבל מעוצב בצורת פרסה שונה כדי להקיף את הפרוסה ולאפשר לנקודות מצורפים להתאמה אישית למייתרי הנבל. שלושה מייתריםמצורף כזה ש) אחד טמון אופקי לאורך הקצה המדיאלי של הפרוסה, ii) אחד משתרע מקצה הזנב של IC לקצה הזנב של AC וiii) אחד משתרע באלכסון מהקצה המדיאלי של הפרוסה לאזור מקורי לAC (ראה איור 1 א). חריצים קטנים במסגרת הדבקה (עם דבק cyanoacrylate) של נבל מיתרים לאפשר לסכום ירידה של לחץ על הפרוסה כדי לעזור לשמור על שלמות פרוסה (ראו איור 1). על ידי שימוש בשלושה ממדי הדפסה, אנו מסוגלים נבלי עיצוב מותאמים אישית למפרטים שלנו הייחודיים, כמו גם גשרים המאפשרים זרימה אידיאלית של נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF) מעל ומתחת לרקמה. זה גם שומר על שטחים גדולים לאור לחדור לרקמות לאלקטרופיזיולוגיה מהדק תיקון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High sucrose cutting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low calcium aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Lot: 1572C502</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td>Lot: 144912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Lot: 1499369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large culture dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-757-13</td>
			<td>100x15mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td align="right">353001</td>
			<td>35x10mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raised culture membrane</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PICMORG50</td>
			<td>Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flavoprotein imaging fluorescence cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMNIB</td>
			<td>470&#8211;490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.&#160; We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium imaging fluorescence cube</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>BX-18</td>
			<td>XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for blocking brain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3% by weight in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viper si Stereo Lithography Apparatus</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

דוגמא של פרוסת מוח עכבר colliculo-thalamocortical שהתקבלה בעכבר P15 מוצגת באיור 2. פרוסה האידיאלית תכיל ארבעה מבנים גדולים והמוח תיכונים המוח הקדמי שמיעתיים IC, מג&quot;ב, טורנירים, וAC, כל שמופעלים כאשר IC מגורה (איור 2 א). באמצעות ניתוח פורייה, כוח הרפאים נמדד בתדירות ה...

Watch this Scientific Journal Video about Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging at JoVE.com

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

באמצעות מספר זוויות לחתוך את מוח גור עכבר, אנחנו לשפר פרוסת מוח חריפה שתואר אשר לוכדת את הקשרים בין רוב מבני המוח התיכון והמוח הקדמי השמיעתיים המרכזיים.

שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

modification-colliculo-thalamocortical-mouse-brain-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Views.  University of Illinois Urbana-Champaign.  באמצעות מספר זוויות לחתוך את מוח גור עכבר, אנחנו לשפר פרוסת מוח חריפה שתואר אשר לוכדת את הקשרים בין רוב מבני המוח התיכון והמוח הקדמי השמיעתיים המרכזיים. 

Video: Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של כבל עכבר השדרה

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

הדמיה 3-D וניתוח של נוירונים נגועים<em&gt; In vivo</em&gt; עם<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, typically 3 mm x 3 mm. This protocol introduces a method for creating a substantially larger 7 mm x 6 mm cranial window exposing most of a cerebral hemisphere over the mouse temporal and parietal cortices (e.g., bregma 2.5 - 4.5 mm, lateral 0 - 6 mm). To perform this surgery, the head must be tilted approximately 30&#176; and much of the temporal muscle must be retracted. Due to the large amount of bone removal, this procedure is intended only for acute experiments with the animal anesthetized throughout the surgery and experiment.
The main advantage of this innovative large lateral cranial window is to provide simultaneous access to both medial and lateral areas of the cortex. This large unilateral cranial window can be used to study the neural dynamics between cells, as well as between different cortical areas by combining multi-electrode electrophysiological recordings, imaging of neuronal activity (e.g., intrinsic or extrinsic imaging), and optogenetic stimulation. Additionally, this large craniotomy also exposes a large area of cortical blood vessels, allowing for direct manipulation of the lateral cortical vasculature.

This protocol presents a method for creating a large unilateral craniotomy over the temporal and parietal regions of the mouse cerebral cortex. This is especially useful for real time imaging over an expansive area of a cortical hemisphere.

נוהל Craniotomy Lateral גדול עבור דימות אופטי Mesoscale רחב בתחום של פעילות המוח

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.