This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.

모든 절차는 일리노이 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 동물 실험 동물 관리의 인증에 대한 미국 협회의 승인을 동물 보호 시설에 수용되었다. 모든 시도가 사용 동물의 수를 최소화하고 연구의 모든 단계에서의 고통을 감소시키기 위해 만들어졌다. 및 공격 태도를 보여준 마우스에서 뇌의 제거 1. 준비 <ol><li> 관류 및 슬라이스 배양을 위해 준비합니다. <ol><li> 약 30 분 슬라이스 전에 녹음 또는 영상 이전 슬라이스의 배양을위한 높은 크로스 커팅 솔루션 및 저 칼슘 ACSF을 준비합니다. </li><li> 모든 필요한 도구 (대형 무딘 끝 가위, 작은 봄 가위, 해부 포셉, 큰 가위 단두대, 홍채 가위, 보석상의 집게, 27G X 1/2 인치 바늘로 10 ML의 주사기, 1cm X 2cm 필터의 작은 조각을 배치합니다 종이 및 SL에 대한 깨진 팁 파스퇴르 피펫관류 및 슬라이싱 및 관류 트레이를 준비 얼음 전송). </li><li> 32 O C의 물을 욕조와 솔루션을 절단 가득 배양 접시에 산소 ACSF와 실을 배양 설정합니다. </li></ol></li><li> 공격 태도를 보여준 무대 절단 준비합니다. <ol><li> 약 1cm 3 범프의 뇌에 대한 역전과 1.5 cm X 1.5 mm X 3mm로 사용할 3 % 한천의 작은 조각을 잘라하는 IC를 지탱하는 데 사용합니다. </li><li> 시아 노 아크릴 레이트 접착제 스테이지뿐만 아니라 그들이 80 O 각도를 형성하도록 역전의 오른쪽에 범프 상 역전을 붙인다. </li></ol></li><li> 뇌를 제거합니다. <ol><li> 깊이 P12-P20 케타민 100 ㎎ / ㎏과 xylaxine 3 ㎎ / ㎏ (또는 유사한 윤리위원회의 승인 절차)와 (이상적 p14-18) 마우스를 마취. 참고 : 발가락 핀치에 응답의 부족을 통해 적절한 마취 수준을 확인합니다. 동물은 마취하에 간단히 바와 같이, 안연고는 불필요하다. </li><li> 무딘 사용가위를 종료 목에 칼 모양의 과정에서 갈비뼈를 노출. <ol><li> 칼 모양의 과정을 찾아 약 1.5 cm의 수평 절단을합니다. </li><li> 어깨에 이전 수평 절단의 끝에서 두 개의 수직 절단, 약 1.5 cm 각을 확인합니다. </li></ol></li><li> 다이아 프램 및 늑연골 접합을 극복하는 것은 마음을 노출. </li><li> 작은 스프링 가위, 마음의면을 지느러미에 복부에서 우심방으로 잘라 작은, 2-5mm합니다. </li><li> 1/2 인치 X 27G 바늘 10 ㎖ 주사기를 사용하여 좌심실을 주입하고 신속하게 높은 절삭 수크로오스 용액을 관류 동물. </li><li> 피가 명확한 실행하면, 머리를 제거하는 큰 가위를 사용합니다. 참고 : 우리는 체계적으로 관류의 유용성을 평가하지 않았습니다. 그러나, 우리의 경험에서,이 젊은 쥐 (rongeur)로 거의 100 % 성공을 함께 할 수 있고, 빨간색 (BL)을 제거하는 이점이 있는가형광 이미징 방해 할 수있는 짐 우드 세포. </li><li> 두개골을 노출하는 중간 선을 피부를 잘라. </li><li> 구부러진 홍채 가위를 사용하여 한 눈 사이의 절단, 조심스럽게 아래 뇌 손상되지 않도록 중간 선 봉합 돌보는 따라 전치부에서 잘라부터 눈 사이 두개골을 잘라. 참고 : 두라는 일반적으로 두개골과 떨어져 온다. 필요한 경우, 신중하게 뇌를 제거하기 전에 경질을 제거합니다. </li><li> 보석상의 집게 사용 놀리려는 두개골을 열고 조심스럽게 뇌를 제거하고 솔루션을 절단의 뇌를 놓습니다. 피질이 손상되지 않도록주의하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 공격 태도를 보여준 뇌를 준비 <ol><li> vibratome 무대에 장착 뇌를 준비합니다. <ol><li> 90 O에서 두 개의 라인으로 표시된 슬라이드 오른쪽 아래 왼쪽 상단에서 17 O에서 대각선을 사용하여, 두 선이 만나는 곳, 사용, 최대 뇌 등의 측면을 배치 교차면도날은, 평평한 표면을 생성 주동이의 끝 뇌의 2-4mm를 제거합니다. </li><li> 새로 만든 평평한 표면에 뇌 꼬리 쪽을 놓고 수평 및 수직 라인과 뇌의 중간 선으로 뇌의 등쪽 표면을 맞 춥니 다. </li><li> , 17 O 라인으로 면도날을 맞 춥니 다 (30) O 각도에서 면도칼을 기울이고 이중 대각선 컷 (관상에서 17 수평면에서 O와 60 O)의 오른쪽 피질의 약 3mm를 제거합니다. </li></ol></li><li> vibratome 무대에서 뇌를 장착. <ol><li> 긴 치수는 중심선에 수직이되도록 여과지 뇌의 복부 측 1cm X 2cm의 작은 조각을 배치했다. </li><li> 신중 백스톱 (및 범프의 좌측으로) 앞의 영역에 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 소량 적용. </li><li> 뇌와 후뇌의 꼬리 부분이되도록 홍보 접착제에에 두 번 대각선으로 잘라 뇌 얼굴을 배치범프에 opped 및 뇌의 우측에 대해 역전된다. </li><li> 섬세 전체면이 슬라이싱 챔버와 접촉하는 것을 보장하는, 뇌에 눌러. </li></ol></li></ol> 3. Colliculo-thalamocortical 슬라이스를 구하기 <ol><li> 신속하게 vibratome에서 절단 단계 및 발생하는 솔루션을 절단으로 무대를 채운다. </li><li> 뇌의 상단 (복부 측면)과 날을 맞 춥니 다. </li><li> 뇌의 상부로부터 1.5 mm를 제거 300-500 μm의 조각을 제거하고, 제거 후에 깊이를 평가한다. 참고 : IC, MGB 및 측면 geniculate 핵 (LGN)이 모두 볼 수 있습니다, 그리고 치아 이랑 (dentate gyrus)가 &#39;C&#39;모양이 600 μm의 슬라이스 한을 형성합니다. 도 3a를 참조하십시오. </li><li> 지주 (32 O를 C) 가열 된 챔버에 넣어 조각. </li></ol> 슬라이스 4. 영상 <ol><li> flavoprotein의자가 형광 이미징을위한 준비. <ol> &lt;리&gt; 표준 전기 생리 녹화 실에서 조각의 관류 ACSF을 준비, 95 %, O2 / 5 % CO 2와 버블 ACSF. </li><li> 자극 용 유리 전극을 당기십시오. 그 여러 가지 자극 전극 및 구성 (유리, 텅스텐, 탄소 섬유, 모노 폴라, 바이폴라) flavoprotein의자가 형광 이미징 모든 작업이 매우 잘 결합을합니다. </li><li> 컴퓨터, 카메라, 미세 조작기, 광원, 자극 소프트웨어, 이미지 캡처 소프트웨어를 켭니다. </li><li> 챔버에서 슬라이스를 상승 사용자 정의 다리 (보충 자료에서 사용할 수있는 디자인)를 배치, 산소 ACSF로 기록 챔버를 관류. 참고 : 관류 속도가 설정 개인에 따라 달라질 수 있습니다 5-15 ml의 / 분 여기에 사용됩니다. </li><li> 남북의 경로를 통해 하프 문자열을 배치하지 않도록주의하면서 조각을 통해 특별히 제작 된 하프를 배치하는 동안 다리를 들어 올려에서 슬라이스를 방지하기 위해 챔버 내의 액체 레벨을 낮추고, 챔버에서 슬라이스를 배치EST (그림 1A). 슬라이스 위와 아래 ACSF 흐름을 유지하기 위해 슬라이스 위의 약 1-2mm에 액체 수준을 높입니다. 주 : 재배치가 필요한 경우, 파손 단부 파스퇴르 피펫을 사용하거나 ACSF 레벨이 상승하고는 조심스럽게 집게를 사용하도록 허용. </li><li> (그림 1A 참조), ACSF 가득 유리 전극에 염화은 전극을 삽입 미세 조작기에 유리 전극을 삽입하고 아이솔레이터를 자극에 연결하고 조심스럽게 시상으로 이어지는 IC / 백질에 유리 전극을 배치합니다. </li></ol></li><li> 자가 형광 이미지 획득을 Flavoprotein. <ol><li> (무한 보정 2X 매크로 목표를 사용하여 (NA 0.13)) 4 Hz에서 이미지와 105 초 동안 카메라를 전기적으로 자극하면서 (각 자극이 0.05 Hz에서 40 Hz에서 2 밀리 초 펄스 조직의 1 초를 다섯 번으로 구성) 조명하면서 수집 푸른 빛 470-490 nm에서 515 nm의 위의 캡처와 조직. 이미지가 어느 쪽인지 확인O 어두운,도 터져 참조 그림 3 참조 열을 떠났다. 주 : 수집 시간, 컬렉션 주파수 및 자극 주파수는 실험과 같은 변형 될 수 부원료 포함 지정 프로그램에 적합하도록 변경 될 수있다. </li><li> matlab에, 및 보충 자료에서 사용할 수있는 사용자 작성 프로그램을 사용하여 내보내기 이미지는 0.05 Hz에서 이미지의 스펙트럼 전력을 분석합니다. 결과 이미지는 연결 경로를 표시합니다. 주 : 지정 프로그램은 화상을 생성하는 고속 푸리에 시계열의 화소 값의 변환을 이용한다. </li></ol></li><li> 칼슘 이미징을위한 준비. <ol><li> ACSF는 약 32 O C.을 온도를 유지하도록 가열 패드 상부 및 슬라이스의 아래쪽, 및 장소 모두에 도달 할 수 있도록 3cm 배양 접시에 올려 배양 막을 이용한 작은 배양 챔버를 준비 </li><li> 95 % O 따뜻한 ACSF 천천히 거품 작은 배양 챔버를 입력5분의 2 %의 CO 2. </li><li> 2 플루로 닉 F-127 산의 μL 및 DMSO 48 μL에 용해의 Fura - 오전 2시의 50 μg의 혼합. </li><li> 제기 막 조심스럽게 마이크로 피펫을 사용하여 작은 배양 챔버에 넣어 슬라이스 염색 직접 MGB 상기 혼합물 (또는 관심의 다른 구조)를 추가합니다. </li><li> 1 시간 - 이전 영상에 표백을 방지하고, 조각이 45 분 동안 배양 할 수 있도록 슬라이스를 커버. </li><li> 를 초과하는 물질을 씻어 10 ~ 15 분 동안 가열 보유 챔버 조각을 제거합니다. </li><li> 자극 준비와 이미지 colliculo-thalamocortical 슬라이스 4.1.6에 단계 4.1.1을 따르십시오. </li></ol></li><li> 칼슘 화상 취득. <ol><li> 365 nm의 빛과 조직을 조명 510 nm의 위에 형광을 캡처하는 동안 전기 0.2 Hz에서 (각 자극 한 2 밀리 초 펄스로 구성)를 다섯 번 조직을 자극하면서 25 초 동안 (20X 물 침지 목표를 사용) 10 Hz에서 이미지를 수집합니다. </lI&gt; <li> MATLAB과 보충 자료에서 사용할 수있는 사용자 작성 프로그램을 사용하여 내보내기 이미지는 0.2 Hz에서 이미지의 스펙트럼 전력을 분석합니다. 결과 이미지는 활성 셀을 보여줍니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse.">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li><li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+(barrel)+cortex+in+vitro.">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li><li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro.">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li><li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway.">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li><li>MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+thalamocortical+slice.">A visual thalamocortical slice.</a> Nat meth. 3, 129-134 (2006).</li><li>Crabtree, J. W., Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+intrathalamic+pathways+allowing+modality-related+and+cross-modality+switching+in+the+dorsal+thalamus.">New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus.</a> J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).</li><li>McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attentional+Modulation+of+Thalamic+Reticular+Neurons.">Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons.</a> J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).</li><li>Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attentional+Orienting+Is+Impaired+by+Unilateral+Lesions+of+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+in+the+Rat.">Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat.</a> J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).</li><li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms.">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li><li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Paradigm+for+Optical+Imaging:+Temporally+Encoded+Maps+of+Intrinsic+Signal.">New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal.</a> Neuron. 38, 529-545 (2003).</li><li>Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+cortical+inhibition+in+an+aging+mouse+model+of+chronic+tinnitus.">Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus.</a> J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li><li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning.">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li><li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse:+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy.">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to...

감각 주연부와 열등한 둔덕 간의 정보의 실질적인 처리가 있지만 그것이 청각 피질에 도달하기 전에 청각 시스템에서, 상당한 추가 처리가있다. 우리는 처리가 수행하고 변환 뇌가 들어오는 감각 정보를 해석 할 수 있습니다 방법에 대한 때문에 작은 방법에 대해 거의 알고있다. 후각을 제외한 각각의 감각은 초기 신호가 피질 상승으로 감소 높은 충실도로 중계되는 신호에 주연 매우 유사한 조직을 갖는다. 피질은 더 들어오는 정보를 조절하는 하부 구조에 대한 전망을 보냅니다. 이 복잡한 시스템은 생체 내뿐만 아니라 시험관 제제의 수가 다양한 방식으로 연구되어왔다. 전, 모든 연결은 감각 입력을 제어하고 측정하면서, 연결의 집합을 조사하기 위해 연구를 가능하게 그대로주어진 영역에서 출력. 이 방법을, 강렬 복잡한 출력 상승을주고, 다른 감각 입력, 각성,주의를 포함하여 다른 입력의 큰 다양성없이 제어에 거의 없다. 시험관, 뇌 조각이 하나의 세트를 캡처 잘라왔다 연구자들은 자극과 구 심성 또는 뇌 영역의 다양한 평가를 할 수 있도록 예측, 또는 두 개의 연결된 뇌 영역의. 이들은 종종 시상에 입력 또는 시상과 대뇌 피질에 출력 하나가 2-5 보존 thalamocortical 또는 tectothalamic 중 하나 조각입니다. 이러한 제제는, 약물, 전기 및 optogenetic 조작 다양한 허용한다. 그러나 두 개의 뇌 영역으로, 이들은 주로 정보의 전송을 평가하고 시상 통과함에 따라 정보의 변화를 평가하는 기능이 부족하다. 또한 주목 변조 역할을 세망 시상 투영은 6-9 인 PR이 조각에 ESENT. 여기에서 우리는 어떻게 시상 게이트 및 필터 정보의 독특한 관점을 제공하기 위해 시상에 다양한 입력의 연구자를 제어 할 수 있습니다 이전 준비 1시에 개선을 보여줍니다. 우리 커플 단일 세포 수준에서 다양한 입력의 영향을 측정하기 위해 슬라이스 연결 및 대규모 활성화 분석 뉴런 집단 분석 시상 칼슘 이미징 및 단일 세포 기록을 평가하기위한 flavoprotein 자기 형광 영상이 신규 슬라이스 제제. 이러한 광범위한 연결을 유지하는 데 도움을주기 위해 우리는 또한 강화 된 관류에 대한 슬라이스를 상승시키는 대신에 뇌 조각과 다리를 유지하는 일반 슬라이스 앵커 (일명 &quot;하프&quot;)의 수정을 개발했다. 하프는 슬라이스를 둘러싸고 하프 문자열에 대한 사용자 지정 부착 점 수 있도록 수정 된 말굽 모양으로 설계되어 있습니다. 세 개의 문자열은첨부 ⅰ) 하나 ⅱ) 하나가 AC의 꼬리 가장자리 IC의 꼬리 에지로부터 연장 ⅲ) 하나의 영역에 슬라이스의 내측 가장자리로부터 비스듬하게 연장되어, 슬라이스의 내측 가장자리를 따라 가로로 놓여 지도록 AC에 주동이 (도 1a 참조). 문자열 슬라이스 무결성을 유지할 수 있도록 슬라이스 압력 저하 량을 허용 하프 (시아 노 아크릴 레이트 접착제)을 붙이는 프레임에 작은 요철이 (도 1b 참조). 입체 인쇄를 사용하여, 우리는 조직의 상하 인공 뇌척수액 (ACSF)의 이상적인 흐름 수 있도록 우리 고유의 사양뿐만 아니라 다리에 사용자 정의 디자인 수금 할 수 있습니다. 이것은 또한 패치 클램프 전기 생리학의 조직에 침투하는 빛이 넓은 영역을 유지합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High sucrose cutting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low calcium aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Lot: 1572C502</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td>Lot: 144912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Lot: 1499369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large culture dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-757-13</td>
			<td>100x15mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td align="right">353001</td>
			<td>35x10mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raised culture membrane</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PICMORG50</td>
			<td>Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flavoprotein imaging fluorescence cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMNIB</td>
			<td>470&#8211;490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.&#160; We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium imaging fluorescence cube</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>BX-18</td>
			<td>XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for blocking brain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3% by weight in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viper si Stereo Lithography Apparatus</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

P15 마우스에서 얻은 colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 예는 그림 2에 나타나있다. 이상적인 슬라이스 IC가 자극 될 때 모든 활성화 된 네 개의 주요 중뇌와 전뇌 청각 구조 IC, MGB, TRN, 및 AC를 포함합니다 (도 2A). 푸리에 분석을 사용하여, 상기 스펙트럼 전력은 주기적으로 자극 주파수 (10)에 혼입 인 활성을 나타내는 접속 뇌 영역과, 전기 자극의 주파수에서 측정...

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Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

여러 각도를 사용하여 마우스 강아지의 머리를 잘라, 우리는 주요 청각 중뇌와 전뇌 구조의 가장 사이의 연결을 캡처 이전에 설명 급성 뇌 조각을 개선.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

modification-colliculo-thalamocortical-mouse-brain-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K 조회수.  University of Illinois Urbana-Champaign.  여러 각도를 사용하여 마우스 강아지의 머리를 잘라, 우리는 주요 청각 중뇌와 전뇌 구조의 가장 사이의 연결을 캡처 이전에 설명 급성 뇌 조각을 개선. 

비디오: Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

연구

신경과학

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 척수의 영상

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 톡소 포자충</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, typically 3 mm x 3 mm. This protocol introduces a method for creating a substantially larger 7 mm x 6 mm cranial window exposing most of a cerebral hemisphere over the mouse temporal and parietal cortices (e.g., bregma 2.5 - 4.5 mm, lateral 0 - 6 mm). To perform this surgery, the head must be tilted approximately 30&#176; and much of the temporal muscle must be retracted. Due to the large amount of bone removal, this procedure is intended only for acute experiments with the animal anesthetized throughout the surgery and experiment.
The main advantage of this innovative large lateral cranial window is to provide simultaneous access to both medial and lateral areas of the cortex. This large unilateral cranial window can be used to study the neural dynamics between cells, as well as between different cortical areas by combining multi-electrode electrophysiological recordings, imaging of neuronal activity (e.g., intrinsic or extrinsic imaging), and optogenetic stimulation. Additionally, this large craniotomy also exposes a large area of cortical blood vessels, allowing for direct manipulation of the lateral cortical vasculature.

This protocol presents a method for creating a large unilateral craniotomy over the temporal and parietal regions of the mouse cerebral cortex. This is especially useful for real time imaging over an expansive area of a cortical hemisphere.

두뇌 활동의 중규모 넓은 필드 광학 이미징에 대한 큰 측면 개두술 절차

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...