The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

מחקרים בבעלי חיים בוצעו תחת פרוטוקול שאושר על ידי הטיפול בבעלי חיים המוסדי הוועדה השתמש בוירג&#39;יניה מכון הפוליטכני ואוניברסיטת מדינה. 1. הגדרות (זמן: ~ 45 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנויות הפשרה קפוא של 0.25% טריפסין, בידוד מאגר למיטוכונדריה (IBM) 1 וIBM2 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הזכוכית ומכשירים לנתח באתנול 70% ואחריו מים טוהר גבוהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.05% פתרון טריפסין 0.25% ממניות טריפסין על ידי דילול טריפסין חלק 1 ב 4 חלקים IBM1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים קוקטייל פרוטאז ומעכב phosphatase עם חיץ תמוגה תא (1: 100 יחס) בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge עם כובע בורג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מיליליטר aliquot (5 מיליליטר / עכבר) של טריפסין 0.05% לצינור פלסטיק 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנוע הגדר מונע homogenizer רקמות 80 סל&quot;ד. </li></ol> 2. בידוד של שרירי שלד מיטוכונדריה (זמן: ~ 90 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר על ידי CO 2 </suב משאיפת&gt;, ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שריר אדום מהארבעה הראשי והגסטרוקנמיוס השריר, הכולל את soleus (~ 75-100 כולל מ&quot;ג) כפי שמתואר בשלבים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף את העור לקראת העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כרית השומן על נקודת המוצא הארבע ראשי. חותך את גיד שריר הארבעה הראשי, שמצורף לפיקת הברך עם מספריים קנס היטה. הערה: ארבע ראשי מזוהה על ידי העמדה אנטומית שלה בחלק הקדמי של עצם הירך הפרוקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לגזור אָלָל בין העצם והשריר הארבע ראשי, תוך הימנעות עורק הירך, כדי לשחרר את השריר הארבעה הראשיים מהעצם. חותך את הגיד במספריים קנס היטה בנקודת המוצא בירך כדי לשחרר את השרירים הארבע ראשי ולמקם את השריר הארבע ראשי בPBS המקורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר רקמת שומן נראית לעין על פני הארבע ראשי במספריים. הפוך את השריר הארבעה הראשיים על כך שהחלק מהשריר שמעל עצם הירך פונה uעמ &#39;. פתח את השריר הארבע ראשי עם מלקחיים בתנועת פנינג. הסר את שני חלקי השריר אדומים גלויים מכל אונה עם מספריים עדינים היטה ומקום בכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר. הערה: שריר ארבע ראשי מופיע כשתי אונות עם פס של שריר אדום ממוקם בסמוך לקצה הלטרלי של כל אונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור שמעל גיד אכילס עם מספריים עדינים הטה ולקלף את העור כלפי העכבר. חותך את גיד אכילס החשוף ולקלף את השריר לכיוון הגוף של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הגיד בcondyles הרוחב והמדיאלי של עצם הירך במספריים קנס היטה לשחרר הגסטרוקנמיוס ולמקם את הגסטרוקנמיוס מצורף לגידים שלה בPBS הצונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הגסטרוקנמיוס שוב ולקלף את שריר הסוליה והמקום לכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר. מאוורר לפתוח הגסטרוקנמיוס. הסר את שלושת חלקים חזותיים אדומים שריר (שתי רצועות אדומות לרוחב והמדיאלי אחד שטחית) עם מספריים קנס היטהים ולהעביר אותם לכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ~ 75-100 מ&quot;ג אחר של שריר אדום מהרגל השנייה של העכבר (כמתואר בשלב 2.2) ומקום לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם קוקטייל פרוטאז ומעכב phosphatase וחיץ תמוגה תא (50 מ&quot;מ טריס-HCL, 1 mM EDTA, 150 מ&quot;מ NaCl, 1% סולפט dodecyl נתרן, 0.5% deoxycholate נתרן, 1% Polyoxyethylene (9) nonylphenylether, מסועף. מייד Flash-להקפיא מדגם השני בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר במערב סופג (ראה שלב 6.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים משטח טרום צונן, שטוח פלסטיק על קרח בדלי גדול. יוצקים ירידה של IBM1 על גבי משטח הפלסטיק ולהשתמש בפינצטה כדי למקם את כל השרירים האדומים מחולקים (שלב 2.2.4 ו2.2.7) בטיפת IBM1. לרכך את רקמת השריר למשך 2 דקות באמצעות 3 סכיני גילוח קצה אחד על ידי סכיני גילוח משתנים כל שנייה 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה הטחון לכוס חדשה עם 5 מיליליטר של IBM1 הטרי על ידי לחיצה על משטח הפלסטיק על הכוס דואר ומגרד את השריר לתוך הכוס עם סכין גילוח. קח את הפתרון הזה ולנקז אותו דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ממוקמת על צינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחוק את הרקמה עם מגב משימה עדין ולאחר מכן להעביר אותו לתוך 5 מיליליטר של פתרון טריפסין 0.05%. להשתמש בפינצטה כדי להסיר את הרקמה ממגב המשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמת השריר על קרח למשך 30 דקות ב0.05% פתרון טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 15 מיליליטר תערובת טריפסין / שרירים המכילים צינור חרוטי ב XG 200 דקות 3 על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant טריפסין לתוך מיכל פסולת וresuspend גלולה עם 3 מיליליטר של קרח IBM1 הקר. העברת הרקמה לצינור homogenizer זכוכית 45 מיליליטר. יש לשטוף את צינור חרוטי 15 מיליליטר עם 1.5 מיליליטר IBM1 אחר כדי לאסוף כל מדגם שנותר ולהוסיף את זה לצינור homogenizer הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור homogenizer הזכוכית לאמצע מילא מיכל כוס או פלסטיק עם קרח כדי homogenizer הזכוכית נע מינימאלי בתוך הכוס. </li><li&gt; Homogenize תערובת הרקמה / IMB1 עם העלי PTFE המצורף לhomogenizer רקמות מנוע מונע עם 10 מסירות ב 80 סל&quot;ד. החזק את החלק התחתון של כל מעבר ל~ 2 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את homogenate הרקמה לצינור 15 מיליליטר חרוטי חדש ולשטוף את צינור homogenizer הזכוכית עם 6.5 מיליליטר של IBM1. יוצקים את IBM1 לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל homogenate רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור חרוטי 15 מיליליטר ב 700 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בעדינות יוצק את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות חוזק גבוה זכוכית וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין supernatant מהצעד מעל ב 8000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant IBM1 מחדש להשעות את הכדור על ידי הוספת 500 μl של IBM2 לאט. לחתוך את הקצה של קצה פיפטה ועדינות homogenize גלולה בIBM2 עם ערבוב ובחישת תנועות. להוסיף עוד 4.5 מיליליטר של IBM2 לתערובת לאחר גלולה מושעה באופן מלא. הערה: הימנע מטחינה דקה מופרזת תוך שבירת חתיכות גלולה גדולות כמו tשלו עלול לגרום נזק לקרומי המיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין homogenate / רקמת IBM2 ב 8000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: שלב זה ניתן לחזור בצינור צנטריפוגות חוזק גבוה נקי לכימות חלבון מדויקת יותר של מיטוכונדריה המבודדת בשלב 4 מאז BSA שייר עשוי לתרום לכלל תכולת חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ועדינות, אבל לגמרי מחדש להשעות את הכדור על ידי הוספת שני 25 מרווחי μl של IBM2 עם קצה פיפטה עם הנקודה שלו מנותק. בעדינות מערבבים ולערבב את הכדור לאחר כל הוספה של 25 μl של IBM2. הנח מניית המיטוכונדריה זה על קרח. </li></ol> 3. Homogenization של כל הפריטים רקמות lysate (זמן: ~ 45 דקות, אפשר לעשות במהלך שלב 7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השריר שמהונח בחנקן הנוזלי מצעד 2.3 ודגירה בטמפרטורת חדר עד שהפשיר באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את הרקמה ל~ 30 שניות על קרח עם מספריים קנס היטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שני 100 סקופים μl של Zirconium חרוזים אוקסיד לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם פקק הברגה מהשלב 3.2 שמכיל רקמה הטחון. Homogenize הרקמות בhomogenizer רקמות טחנת חרוז באמצעות 02:58 5 מחזורי דקות בהגדרת מהירות של 4-6 (הגדרה בינונית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין את התערובת מצעד 3.3 ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant באמצעות קצה פיפטה 1,000 μl לאחר הספין וההעברה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. זורק את הכדור ומניח את supernatant על קרח. </li></ol> 4. קביעת חלבון (זמן: ~ 30 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז החלבון של כל lysate הרקמות (שלב 3.4) ומניית המיטוכונדריה (שלב 2.17) באמצעות ערכת assay חלבון BCA על פי המפרט של היצרן. </li></ol> 5. המיטוכונדריה ממברנה יושרה; ציטראט synthase פעילות (CS) (זמן: ~ 15 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני 1 נפרד: 20 דילולים של מניית המיטוכונדריה במים טוהר גבוהים. לְהוֹסִיף0.1% מטריטון 100-X למדגם אחד וsonicate אותו בעצמה נמוכה (765 ואט, המשרעת של 2). השאר את הדילול האחר על קרח. להחזיר את המדגם לקרח לאחר sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay synthase ציטראט עם שני שאינו sonicated וsonicated דילולים המיטוכונדריה באמצעות assay spectrophotometric כפי שתואר קודם לכן 11,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אחוז קרומי המיטוכונדריה שלמים באמצעות המשוואות הבאות: (פעילות CS ללא sonicated ÷ sonicated CS פעילות) * 100 </li></ol> 100 N (אחוזים הושגו מלמעלה) 6. איכות בידוד המיטוכונדריה; מערבי סופג (זמן: על פי פרוטוקול מעבדה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מערבי סופג בכל lysate הרקמה ומיטוכונדריה המבודדת כפי שתואר לעיל 12. הערה: נוגדנים ראשוניים השתמש לGAPDH (1: 1,000 דילול ב 5% BSA / TBS-T) וCOXIV (1: 1,000 דילול ב 5% דל שומןחלב / TBS-T) ואחריו האנטי-עז, ונוגדנים משני ארנב, בהתאמה (1: 10,000). </li></ol> 7. Respirometric Assay הפעלה (זמן: ~ 90 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מבחני respirometric רצויים באמצעות טכנולוגית microplate מבוססת O 2 צריכת מדידה כפי שתואר לעיל (ראה מאמר נלווה ורוג&#39;רס ואח &#39;8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את יחס שליטה בדרכי הנשימה (RCR) על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי המדינה 4O (RCR) או חלוקת 3U מדינה על ידי 4O המדינה. השתמש באחת נקודת האמצע (ממוצעת), או (3 המדינה) הגבוהה ביותר ומחירים נמוכים (4O מדינה) מעקבות נקודה לנקודה בעת קביעת RCR. </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics. , (2013).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li><li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence.">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).</li><li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance,+metabolic+flexibility,+and+mitochondrial+performance.">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS one. 6, e21746 (2011).</li><li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration.">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).</li><li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes.">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).</li><li>Hulver, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+stearoyl-CoA+desaturase-1+expression+in+skeletal+muscle+contributes+to+abnormal+fatty+acid+partitioning+in+obese+humans.">Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans.</a> Cell Metab. 2, 251-261 (2005).</li><li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+modulates+skeletal+muscle+substrate+metabolism.">Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> JoVE. , (2011).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).</li><li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization.">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).</li><li>Asmann, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mitochondrial+functions,+mitochondrial+DNA+copy+numbers,+and+gene+transcript+profiles+in+type+2+diabetic+and+nondiabetic+subjects+at+equal+levels+of+low+or+high+insulin+and+euglycemia.">Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia.</a> Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).</li><li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro.">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li></ol>

George Rogers is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument for which this protocol was modified.

השיטות שהוצגו במסמך זה מספקים תיאור מפורט של הליך בידוד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות (~ 75-100 מ&quot;ג) של שריר שלד עכבר. הליך בידוד זה מסוגל להניב בתפקוד גבוה, מיטוכונדריה הטהורה (~ 450 מיקרוגרם) כפי שמעיד O 2 שיעורי הצריכה, ערכי RCR, פעילות synthase ציטראט מקסימלי וביטוי חלבון מimmunoblotting. חשוב לציין, מיטוכונדריה מבודדת מהליך זה יכול לשמש למבחני respirometirc מרובים עם טכנולוגית microplate מבוססת O 2 הצריכה המאפשרת לתפוקה גבוהה. הבידוד של המיטוכונדריה שריר שלד לעתים קרובות דורש שיטות קשות לשחרר את המיטוכונדריה מרקמות חיבור וחלבונים מבניים 7,16. כתוצאה מכך, קרומי המיטוכונדריה יכולים להפוך שיבשו, ובכך לפגוע בפעילות (ובכך הדיוק) של O 2 צריכת המיטוכונדריה במהלך respirome הבאמבחני ש-בש. על ידי הכללת צעד נוסף של הרקמה המיותרת באמצעות סכיני גילוח לאחר כריתת רקמה לפרוטוקול שתואר קודם לכן 7, מהירות הרוטור מופחתת באופן משמעותי ליצירת הומוגניות מונעת במנוע הייתה אפשרית (סל&quot;ד לעומת 1,600 80 סל&quot;ד). טכניקות הומוגניזציה וresuspension העדינות אלה מובילים לשיעור גבוה של מיטוכונדריה עם קרומים (92.5 ± 2.0%), כפי שהוערכו מפעילות synthase ציטראט הבאה הליך הבידוד. הממצאים שלנו עולים בקנה אחד עם Asmann et al. 17, שדיווחו בין הכנות המיטוכונדריה שלמות 90-95% בעקבות בידוד משרירי שלד אנושיים. חשוב לציין כי מדידת פעילות synthase ציטראט היא מתאימה יותר למדידת שלמות פיזית של קרומי המיטוכונדריה ולא צריך לשמש כדי להעריך שלמות תפקודית של המיטוכונדריה המבודדת. מצד השני, יש להשתמש O 2 מבחני הצריכה ונחישות של RCR ממבחנים אלה למאה שבטוח הפונקציה של מיטוכונדריה המבודדת 1. בנוסף, RCR יכול לשמש גם כמדד למיטוכונדריה בשילוב. לכן, OCR ומדינות המיטוכונדריה בטווח אופייני מפירובט / assay Malate 8, ואת ערכי RCR הגבוהים המתקבלים ממגוון רחב של מבחני respirometric מצביעים על כך שהמיטוכונדריה נגזרת מפרוטוקול זה בחוזקה בשילוב ומאוד פונקציונלית. בידוד של המיטוכונדריה שלמה וטהורה יש השלכות חשובות על מבחני respirometic. הזיהום של חלבונים שאינן המיטוכונדריה בהכנת המיטוכונדריה הסופית יכול לגרום לטעינת כמויות שווה של חלבון המיטוכונדריה היטב כל אחד במהלך מדידות O 2 הצריכה, ובכך להקטין את הדיוק של כל השוואה בין ניסויים שבוצע באמצעות תכשירים שונים של המיטוכונדריה. יתר על כן, (, למשל peroxisomes) CA זיהום של הכנת המיטוכונדריה עם האברונים נושמים אחריםn נוסף להקטין את הדיוק של מדידות O 2 הצריכה. הנוכחות של החלבון הפנימי של המיטוכונדריה, COXIV, והיעדר בולט של להקת cytosolic (ופוטנציאל גרעיני) חלבון, GAPDH, בimmunoblotting הכנת המיטוכונדריה המבודד הבא היא מעיד על זיהום קטן ממקורות שאינן המיטוכונדריה במהלך הליך הבידוד . חשוב לציין כי למרות בידודה של הכנת המיטוכונדריה מטוהרת חשוב ביחס להוזכר לעיל, התחזוקה של שלמות המיטוכונדריה היא בעל חשיבות עליונה במבחני נשימה. קרום המיטוכונדריה החיצוני עלול להיפגע בקלות במהלך הליך הבידוד, שהוביל לבריחה של ציטוכרום C לחיץ בידוד ובכך הופך שיעור הגבלה בO 2 הצריכה וסינתזת ATP 18. לכן, את השלמות של מיטוכונדריה המבודדת ניתן להעריך עוד יותר על ידי כימות cytochromביטוי חלבון בר בsupernatant של הכנת המיטוכונדריה (שלב 2.15, לפני resuspension) ובמיטוכונדריה המבודדת עם מערבי סופג. ציטוכרום C לא צריך להיות נוכח בsupernatant הכנת המיטוכונדריה אם קרומי המיטוכונדריה הם שלמים הבאים נהלי הבידוד. כל הצעדים של פרוטוקול זה הם חשובים, עם זאת יש שלושה שלבים קריטיים לפרוטוקול זה. ראשית, ברר בשריר שלד אדום עם שלושה סכיני גילוח שונים (שלב 2.4) הוא קריטי משום שצעד זה מאפשר למהירויות הרוטור איטיות במהלך שלב הומוגניזציה (שלב 2.11). שנית, הביצועים של צעדים רבים על קרח או במאגרים מצוננים הוא קריטיים כדי לשמור על המיטוכונדריה במצב מנוחה לפני מבחני respirometric מבוססים microplate. לבסוף, resuspension העדין של גלולה מיטוכונדריה לIBM2 הוא בעל חשיבות עליונה. ערבוב עדין שומר על יושרה של המיטוכונדריה, שהוא חיוני לשו&quot;ת מדויקמבחני irometic. מגבלות מסוימות של טכניקה זו הן שווים אזכור. ראשית, כל הציוד הדרוש (למשל, ultracentrifuge, homogenizer מנוע מונע, וכו &#39;) כדי לבצע את הליך הבידוד יכול להיות יקר. בנוסף, יש צורך בשיטות בקרה איכות מרובות כדי להבטיח מיטוכונדריה נקייה ושלמה. עם זאת, ברגע שהחוקר הוא בקיא בהליך הבידוד, מיטוכונדריה איכות גבוהה הניבה שניתן להשתמש במספר רב של מדידות כוללים, אך לא מוגבל ל: כתמים מערביים, מבחני האנזימטית, RT-PCR, PCR, H 2 O 2 מבחני , ומדידות בדרכי הנשימה microplate תפוקה הגבוהה. חשוב לציין כי הליך בידוד זה כבר מותאם ושונה לכמויות קטנות של עכבר שריר ושלד זהירות יש לנקוט כאשר מנסה ליישם טכניקות בידוד מרקמות ניתנו מאותו המין (ואפילו לאותה רקמה ממינים שונים ) לרקמות אחרות / ספציפיes. לקבלת תוצאות אופטימליות, חיפוש בספרות יהיה האפשרות הטובה ביותר כאשר מנסים למצוא את השיטה הטובה ביותר עבור בידוד הרקמה / מינים המיועדים.

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies3-5.
Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays. 
Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several &#181;g per well8. Therefore, we present a modification of previously published methods7 to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O2 consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research9,10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/HCl</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5123</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride 
			White Crystals or Crystalline Powder 
			&#8805;99.0 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3581</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771&#160;</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6750&#160;</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>238651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352360</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Halt Protease &#38; Phosphatse Inhibitor Cocktail</td>
			<td rowspan="2">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="2">1861284</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1.5mL microcentrifuge tubes with screw cap</td>
			<td rowspan="2">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="2">3474</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Zirconium Oxide beads</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">C9012112</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody (1D4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-59540</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- COXIV antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4844s</td>
			<td>Any mitochondrial inner membrane protein will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td rowspan="2">Jackson ImmunoResearh</td>
			<td rowspan="2">711-035-152</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)</td>
			<td rowspan="2">Jackson ImmunoResearh</td>
			<td rowspan="2">115-001-003</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

מיטוכונדריה שריר שלד מתפקד לשחק תפקיד בחילוף חומרים שינו נצפו עם הזדקנות, השמנת יתר וסוכרת סוג II. מבחני respirometric מיטוכונדריאלי מהכנות המיטוכונדריה מבודדות מאפשרים ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה, כמו גם קביעת המנגנון (ים) של פעולה של תרופות וחלבונים המווסתים את חילוף חומרים. נהלי בידוד נוכחיים לעתים קרובות דורשים כמויות גדולות של רקמה להניב מיטוכונדריה באיכות גבוהה הנדרשת למבחני respirometric. השיטות שהוצגו במסמך זה מתארים כיצד באיכות גבוהה מטוהרת מיטוכונדריה (~ 450 מיקרוגרם) יכול להיות מבודדים מכמויות מינימליות (~ 75-100 מ&quot;ג) של שריר שלד עכבר לשימוש במדידות בדרכי הנשימה תפוקה גבוהה. אנחנו קבענו כי שיטת הבידוד שלנו מניבה 92.5 ± 2.0% המיטוכונדריה שלמה על ידי מדידת פעילות synthase ציטראט spectrophotometrically. בנוסף, ניתוח כתם מערבי במיטוכונדריה המבודדת הביא לביטוי הקלוש של cytosoחלבון Lic, GAPDH, והביטוי חזק של חלבון המיטוכונדריה, COXIV. היעדר להקת GAPDH בולט במיטוכונדריה המבודדת מעיד על זיהום קטן ממקורות שאינן המיטוכונדריה במהלך הליך הבידוד. והכי חשוב, מדידת שיעור O 2 הצריכה עם טכנולוגיה מבוססת מיקרו-צלחת וקביעת יחס הנשימה השליטה (RCR) למבחני מצמידים respirometric תערוכות בשילוב מאוד (RCR;&gt; 6 לכל מבחני) ומיטוכונדריה הפונקציונלית. לסיכום, התוספת של צעד זהיר, נפרד והפחתת מהירות הומוגניזציה מנוע מונע משיטה שדווחה בעבר באופן משמעותי אפשרה את הבידוד של איכות גבוהה ומיטוכונדריה המטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר, כי תוצאות במיטוכונדריה בשילוב מאוד כי לנשום עם פונקציה גבוהה במהלך מבחני respirometirc microplate מבוססים.

פעילות synthase ציטראט משמשת כמדד לשלמות קרום מאז synthase ציטראט ממוקם בקרום המיטוכונדריה הפנימי, ובכך לא צריך להיות נוכח במתלים של המיטוכונדריה עם קרומים. איור 1 מייצג פעילות synthase ציטראט בדגימות של המיטוכונדריה-sonicated הלא לעומת sonicated דגימות מאותו הבידוד. Sonicating תוצאות מיטוכונדריה בעלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית בפעילות synthase ציטרט (P &lt;0.01). חשוב לציין, 92.5 ± 2.0% של המיטוכונדריה היו שלמים הבאים הבידוד. איור 2 מתאר GAPDH וביטוי COXIV במיטוכונדריה המבודדת וכל lysate רקמת שריר השלד. GAPDH הוא חלבון הממוקם בcytosol, אבל ניתן למצוא גם בגרעין לאחר טרנסלוקציה, ואילו COXIV הוא חלבון הממוקם בקרום המיטוכונדריה הפנימי. ביטוי של GAPDH וCOXIV ניכרים בכל Tisslysate UE. במיטוכונדריה המבודדת, ביטוי של COXIV הוא ציין, בעוד שרק להקות קלושות של GAPDH ניכרות. ממצאים אלה מצביעים על בידודי המיטוכונדריה טובים, עם זיהום קטן ממרכיבים שאינן המיטוכונדריה במהלך הליך הבידוד. איור 3 הוא מעקב נציג של שיעורי O 2 הצריכה (OCR) לעומת זמן לassay צימוד (פירובט / 5 Malate מ&quot;מ 10 מ&quot;מ) שבוצעו ממיטוכונדריה מבודדת באמצעות פרוטוקול זה והופיע עם טכנולוגית צריכת microplate מבוססת O 2. כל פנל מייצג O 2 הצריכה במדינות שונות במיטוכונדריה כפי שתיארו סיכוי ו -13 וויליאמס. הפנל הראשון מייצג O 2 הצריכה בסיסית, או מדינת הפנל השני 2., לאחר ההזרקה של ADP, מייצג נשימה מקסימלי בשילוב, או מדינת הפנל השלישי 3., לאחר ההזרקה של oligomycin (מעכב של V מורכב), represeהנשימה NTS בשל דליפת פרוטון, או המדינה 4O. הפנל הרביעי, לאחר ההזרקה של FCCP, מייצג נשימה מקסימלי נחק, או 3U המדינה. לבסוף, הלוח החמישי, לאחר ההזרקה של Antimycin, מייצג את העיכוב של נשימה חמצוני. יחס הנשימה השליטה (RCR), מדד לתפקוד המיטוכונדריה 1, היה מחושב על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי מדינת 4O. לוח 4 דיווחי ערכי RCR הממוצע למבחני צימוד מצע חלופיים שניתן לבצע מתשואת המיטוכונדריה מפרוטוקול זה. חשוב לציין, צריכת O 2 ההתחקות וערכי RCR הגבוהים מייצגים מאוד לתפקד ומיטוכונדריה בשילוב. ערכי RCR דיווחו במסמך זה הם גבוהים יותר או דומים מאשר דווח בעבר תוך שימוש בפרוטוקולי בידוד דומים בשרירי שלד עכברי 7,14,15, ובכך מדגישים את האיכות הגבוהה של מיטוכונדריה מבודדת בהליך זה. איור 1: ציטראט synthase פעילות. פעילות אנזים ציטראט synthase כפי שנקבע בspectrophotometrically preps מיטוכונדריה-sonicated שאינו וsonicated. הערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM. ** P &lt;0.01. הנתונים מייצגים n = 3 לזווג משכפל ביולוגי והביע ביחס למ&quot;ג של חלבון. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53217/53217fig1.jpg" /> איור 2:. Cytosolic וביטוי חלבון המיטוכונדריה במיטוכונדריה המבודדת וlysate רקמה כל שתי מיטוכונדריה מבודדת וlysates רקמות השלם היו immunoblotted עם COXIV ונוגדני GAPDH. חלבון המיטוכונדריה, COXIV, היה ברור בשתי הדגימות, לעומת זאת GAPDH היה רק ​​קלוש ניכר במיטוכונדריה המבודדת. היעדר להקת GAPDH בולט בהמיטוכונדריה המבודדת הדואר מעידה על זיהום קטן ממקורות שאינן המיטוכונדריה במהלך הליך הבידוד. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53217/53217fig3.jpg" /> איור 3:. מעקב נציג של assay צימוד עם מיטוכונדריה מבודדת משרירי שלד עכבר 10 Malate מ&quot;מ פירובט / 5 מ&quot;מ בשילוב העתקים assay הנשימה המיטוכונדריאלי כפי שנקבע על ידי מדידה רב גם של O 2 הצריכה. הערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן. חלבון מיטוכונדריאלי העמוס בכל טוב היה 2.5 מיקרוגרם. OCR = O 2 שיעור הצריכה; ADP = diphosphate אדנוזין; אוליגו = Oligomycin; FCCP cyanide- = קרבוניל 4 - phenylhydrazone (trifluoromethoxy); אנטי-א = Antimycin <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"> מֵגִיב </td><td> ריכוז מניות </td><td><strong<html> &gt; MW </td><td> נפח סופי </td><td> מסה נוסף </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (G / mol) </td><td> (מיליליטר) </td><td> (ז) </td></tr><tr><td> טריס / HCl, pH 7.4 </td><td> 2 </td><td> 157.56 </td><td> 250 </td><td> 78.8 </td></tr><tr><td> טריס / HCl, pH 7.4 </td><td> 1 </td><td> 157.56 </td><td> 250 </td><td> 39.39 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 1 </td><td> 74.55 </td><td> 500 </td><td> 37.28 </td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> 1 </td><td> 121.14 </td><td> 100 </td><td> 12.11 </td></tr><tr><td> EDTA, pH 8 </td><td> 0.5 </td><td> 416.2 </td><td> 100 מיליליטר (1 M טריס בסיס) </td><td> 20.81 </td></tr><tr><td> EGTA, pH 7.2 </td><td> 0.1 </td><td> 380.35 </td><td> 100 (ב 1 M טריס בסיס) </td><td> 3.801 </td></tr></tbody></table> טבלת 1: הכנת פתרונות מניות. <table b</html style=";text-align:right;direction:rtl">כדי = cellpadding &quot;0&quot; = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> מֵגִיב </td><td> ריכוז מניות </td><td> מסה נוסף </td><td rowspan="2"> Molarity הסופי / אחוזים </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (ז או מיליליטר) </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> - </td><td> 11.47 גרם </td><td> 67 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> טריס / HCl, pH 7.4 </td><td> 2 </td><td> 12.5 מיליליטר </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 1 </td><td> 25 מיליליטר </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EDTA / טריס בסיס, pH 8 </td><td> 0.5 </td><td> 10 מיליליטר </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> בעיקרו של דבר FA BSA חינם </td><td> - </td><td> 1 גרם </td><td> 0.20% </td></tr><tr><td colspan="4"> pH 7.4, 500 מיליליטר: Aliquot 50 מיליליטר והקפאה </td></tr></tbody></table> טבלה 2: הכנת בידוד המאגר למיטוכונדריה 1 (IBM1).<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"> מֵגִיב </td><td> ריכוז מניות </td><td> מסה נוסף </td><td rowspan="2"> Molarity הסופי / אחוזים </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (ז או מיליליטר) </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> - </td><td> 10.9 גרם </td><td> 200 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> - </td><td> 7.188 גרם </td><td> 70 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EGTA / טריס בסיס </td><td> 0.1 </td><td> 15 מיליליטר </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> טריס- HCl, pH 7.4 </td><td> 1 </td><td> 3 מיליליטר </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td colspan="4"> pH 7.4, 300 מיליליטר: Aliquot 15 מיליליטר והקפאה </td></tr></tbody></table> טבלה 3: הכנת בידוד המאגר למיטוכונדריה 2 (IBM2). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody&gt; <tr><td> מצע בינוני </td><td> ריכוז סופי </td><td> RCR </td></tr><tr><td> פירובט / Malate </td><td> 10 מ&quot;מ / 5 מ&quot;מ </td><td> 16.2 ± 4.6 </td></tr><tr><td> Succinate / Rotenone </td><td> 10/2 מיקרומטר מ&quot;מ </td><td> 10.6 ± 3.8 </td></tr><tr><td> Palmitoyl-קרניטין / Malate </td><td> 40 מיקרומטר / 1 מ&quot;מ Malate </td><td> 6.7 ± 0.6 </td></tr><tr><td> גלוטמט / Malate </td><td> 10 מ&quot;מ / 10 מ&quot;מ </td><td> 8.6 ± 0.4 </td></tr></tbody></table> לוח 4: יחסי בקרת נשימה ליחסים יחד מיטוכונדריאלי נשימת מבחני נשימה שליטה כפי שנקבעו על ידי מדידת O 2 שיעורי הצריכה במבחני microplate מבוססים respirometric, ואחרי חלוקת נשימה מקסימלי בשילוב הראשון (ADP המאולץ המדינה 3) על ידי נשימה עקב דליפת פרוטון (Oligomycin. 4O מדינת תגובה). הערכים באים לידי ביטוי כSE ±. חלבון מיטוכונדריאלי העמוס בכל טוב היה 2.5 מיקרוגרם לפירובט / Malate וsuccinate / מבחני rotenone, ו -3.5 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה לכל גם ל- קרניטין / Malate palmitoyl ומבחני Malate גלוטמט /.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements at JoVE.com

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

isolation-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal-muscle

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  Virginia Tech. Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Video: Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...