The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

Hayvan çalışmaları Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış bir protokol çerçevesinde gerçekleştirilen ve Virginia Politeknik Enstitüsü ve Eyalet Üniversitesi&#39;nde Committee bulundu. 1. Kurulum (Saat: ~ 45 dk) <ol><li> 37 ° C su banyosunda Mitokondri (IBM) 1 ve IBM2 için% 0.25 tripsin, İzolasyon Tampon çözülme dondurulmuş saklar. </li><li> Cam ve yüksek saflıkta su ile,% 70 etanol içinde kesme durulayınız. </li><li> 4 bölümden IBM1 1 kısım tripsin seyrelterek% 0.25 tripsin stokundan% 0.05 tripsin çözüm hazırlayın. </li><li> Vidalı kapaklı 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde (100 oranı 1) hücre liziz tamponu ile proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl karıştırın. </li><li> Kısım 5 ml 15 ml&#39;lik plastik tüp içine% 0.05 tripsin (5 ml / fare). </li><li> Set Motor 80 RPM doku homojenleştirici tahrik. </li></ol> İskelet Kası Mitokondri 2. izolasyonu (Saat: ~ 90 dk) <ol><li> CO 2 ile bir fare Euthanize </suservikal dislokasyon b&gt; inhalasyon. </li><li> Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi soleus (~ 75-100 mg toplam) içeren kuadriseps ve gastroknemius kasının, kırmızı kas kaldırın: <ol><li> Fare doğru cilt soyma. </li><li> Kuadriseps kökenli noktası üzerinde yağ yastığı çıkarın. Ince uçlu makasla patella bağlı olduğu kuadriseps tendonu kesin. Not: quadriceps proksimal femur ön kısmı üzerindeki anatomik pozisyonuna ile tanımlanır. </li><li> Kemik kuadriseps kurtarmak için, femoral arter kaçınarak Yavaşça, kemik ve kuadriseps arasındaki künt snip. Kuadriseps kas özgürleştirmek ve soğutulmuş PBS kuadriseps kas yerleştirmek için femur üzerinde orijin noktasında ince uçlu makasla tendon kesin. </li><li> Makasla kuadriseps üzerinde görünür yağ dokusu çıkarın. Yani femur örten oldu kas kısmı u bakacak şekilde çevirin üzerinde kuadrisepss. Bir yelpaze hareket forseps ile kuadriseps kas açın. Soğutulmuş IBM1 5 ml içeren bir cam kapta ince uçlu makas ve yer ile her lobdan iki görünür kırmızı kas kısımlarını çıkarın. Not: kuadriseps her lobun yan kenarında bulunan kırmızı bir kas şeridi ile iki lob olarak görünür. </li><li> İnce uçlu makasla Aşil tendonu örten deri kesin ve fare doğru cilt soyma. Maruz Aşil tendonu kesin ve fare gövdesine doğru kas soyun. </li><li> Gastroknemius serbest ve soğutulmuş PBS kendi tendon bağlı gastrocnemius yerleştirmek için ince uçlu makasla femur lateral ve medial kondil de tendon kesin. </li><li> Üzerinde gastroknemius ve soleus kas çevirin kalkmasına ve soğutulmuş IBM1 5 ml içeren beher içine yerleştirin. Fan gastroknemius açın. Ince uçlu makas ile üç görsel kırmızı kas kısımlarını (iki yanal ve bir medial yüzeysel kırmızı şeritler) çıkarıns ve soğutulmuş IBM1 5 ml ihtiva eden bir behere aktarın. </li></ol></li><li> (Adım 2.2 de tarif edildiği gibi) fare diğer bacak kırmızı kas diğer ~ 75-100 mg çıkarın ve proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli ve hücre liziz tamponu (50 mM Tris-HCl, 1 ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirmek mM EDTA, 150 mM NaCl,% 1 sodyum dodesil sülfat,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 1 polioksietilen (9) nonilfenileter. hemen Western blotlama daha sonra kullanmak için sıvı azot içinde bu ikinci örnek flaş dondurularak dallanmış (adım 6.1). </li><li> Büyük bir kova buz üzerinde önceden soğutulmuş, düz plastik yüzeyi yerleştirin. Plastik yüzeye IBM1 bir damla dökün ve IBM1 damlacık içinde bölümlere kırmızı kas (adım 2.2.4 ve 2.2.7) tüm yerleştirmek için cımbız kullanın. Değişen jilet ile 3 tek kenar jilet her 40 saniye ile 2 dakika süreyle kas dokusu kıyma. </li><li> Th plastik yüzey tutarak taze IBM1, 5 ml ile yeni bir behere kıyılmış doku transfere beher ve bir jilet ile beher içine kas kazıma. Bu çözümü alın ve 50 ml konik tüp yerleştirilir 100 mikron hücre süzgecinden boşaltın. </li><li> Bir hassas bir görev silecek ile doku Blot ve daha sonra% 0.05 tripsin solüsyonu 5 ml aktarın. Görev silecek doku kaldırmak için cımbız kullanın. </li><li> % 0.05 tripsin solüsyonu içinde 30 dakika için buz üzerinde kas dokusu inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 200 x g&#39;de 15 ml konik tüp içeren tripsin / kas karışımı dönerler. </li><li> Bir atık kabına tripsin süpernatant dökün ve buz 3 ml soğuk IBM1 ile pelletini. 45 ml&#39;lik bir cam homojenizatör tüp doku aktarın. Kalan numune toplamak ve cam homojenleştirici tüp bu eklemek için başka bir 1.5 ml IBM1 ile 15 ml konik tüp durulayın. </li><li> Cam homogenizer beher içinde minimal hareket yani buz ile bir bardak ya da plastik kap dolu yarım içine cam homojenizatör tüp yerleştirin. </li><li&gt; 80 rpm&#39;de 10 geçişle bir motor tahrikli doku homojenleştirici bağlı PTFE havan ile doku / IMB1 homojen bir karışım. ~ 2 saniye, her geçişte alt tutun. </li><li> Yeni 15 ml konik tüp doku Homojenat aktarın ve IBM1 6.5 ml cam homojenizatör tüp durulayın. Doku Homojenat içeren 15 ml konik tüp içine IBM1 dökün. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 700 g&#39;de 15 ml konik bir tüp dönerler. Yavaşça cam yüksek mukavemetli santrifüj tüpüne süpernatant dökün ve pelet atın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 8000 x g&#39;de, yukarıdaki aşamada elde edilen süpernatant dönerler. </li><li> IBM1 Süpernatantı ve yavaşça IBM2 500 ul ekleyerek pelet yeniden askıya. Bir pipet ucunu kesti ve hafifçe karıştırma ve hareketleri karıştırılarak IBM2 pelet homojenize. Pelet tamamen askıya sonra karışıma IBM2 başka 4,5 ml ilave edilir. T gibi büyük pelet parçaları kırarak aşırı öğütme kaçının: Notonun mitokondriyal zarlarının zarar verebilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 8000 x g&#39;de IBM2 / doku Homojenat dönerler. Not: Bu adım, toplam protein içeriğinin katkıda bulunabilir bakiye BSA yana Aşama 4 izole mitokondri daha doğru bir protein ölçümü için temiz bir yüksek mukavemetli santrifüj tüpüne tekrarlanabilir. </li><li> Nazikçe Süpernatantı ve kaldırmak, ancak tamamen kesilmiş olan nokta ile bir pipet ile IBM2 iki 25 ul artışlarını ekleyerek pelet yeniden askıya. Yavaşça karıştırın ve IBM2 25 ul her bir ilaveden sonra pelet karıştırın. Buz üzerinde bu mitokondriyal stok yerleştirin. </li></ol> Tüm Doku Lizat 3. Homojenizasyon (Saat: ~ 45 dakika; Adım sırasında Yapılabilir 7) <ol><li> Bu adım 2.3 sıvı azot içine yerleştirilmiştir gelen kas çıkarın ve tam çözülmüş kadar oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Ince uçlu makasla buz üzerinde ~ 30 saniye için doku kıyma. </li><li> Zirco iki 100 ul kepçe eklemekıyılmış doku içeren adım 3.2 vidalı kapaklı 1.5 ml mikrosantrifüj tüp uranyum Oksit Boncuk. 4-6 (orta ayar) bir hız ayarında iki 5 ila üç dakika döngüleri kullanarak bir boncuk değirmeni doku homojenleştiricide doku homojenize. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 12.000 x g&#39;de aşama 3,3 karışımın dönerler. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine spin ve transferden sonra 1000 ul pipet kullanarak süpernatantı. Pelet atın ve buz üzerinde supernatant yerleştirin. </li></ol> 4. Protein Tayini (süre: ~ 30 dakika) <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre BCA Protein tahlil kiti kullanılarak tüm doku lizat (adım 3.4) ve mitokondriyal stokunun (adım 2.17) protein konsantrasyonu belirleyin. </li></ol> 5. Mitokondri Membran Bütünlüğü; Sitrat Sentaz (CS) Etkinlik (Saat: ~ 15 dk) <ol><li> Yüksek saflıkta su mitokondriyal stokunun 20 dilüsyonları: iki ayrı 1 yapın. EklemekTek örnek Triton 100 X% 0,1 ve düşük ayarda (765 Watt, 2 genlik) it at ses dalgalarına maruz. Buz üzerinde başka seyreltme bırakın. Sonikasyon sonra buza örneği dönün. </li><li> Olan bir sitrat sintaz deneyi gerçekleştirmek hem sigara soniklendi ve daha önce tarif edildiği gibi 11,12 bir spektrofotometrik deneyle mitokondriyal dilüsyonları sonike edilmiştir. </li><li> Aşağıdaki denklemleri kullanarak sağlam mitokondri zarlarının yüzdesini belirleyin: (Non-soniklendi CS faaliyeti ÷ soniklendi CS aktivitesi) * 100 </li></ol> 100- N (yüzde yukarıdan elde) 6. Mitokondri İzolasyon Kalite; Western Blot (Saat: Lab Protokole göre) <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi 12 tam doku lizat ve izole mitokondri Batı blotting gerçekleştirin. Not: GAPDH kullanımlar primer antikor (1: 1000 seyreltme,% 5 BSA / TBS-T) ve COXIV (1: 1000 seyreltme içinde% 5 yağsızsüt / TBS-T, sırasıyla anti-keçi, tavşan sekonder antikor, (1) ve akabinde: 10,000). </li></ol> 7. Respirometrik Deneyi Run (Saat: ~ 90 dk) <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi mikroplaka bazlı O 2 tüketimi ölçüm teknolojisi kullanılarak istenilen Respirometrik tahlilleri yapın (arkadaşı makale ve Rogers bkz ark 8). </li><li> Devlet 4o (RCR) tarafından State 3 bölünmesi veya Devlet 4o Devlet 3U bölerek Solunum kontrol oranı (RCR) belirleyin. RCR belirlerken noktadan noktaya izlerinden orta (ortalama) noktası, ya da en yüksek (Devlet 3) ve en düşük fiyatları (Devlet 4o) kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics. , (2013).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li><li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence.">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).</li><li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance,+metabolic+flexibility,+and+mitochondrial+performance.">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS one. 6, e21746 (2011).</li><li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration.">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).</li><li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes.">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).</li><li>Hulver, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+stearoyl-CoA+desaturase-1+expression+in+skeletal+muscle+contributes+to+abnormal+fatty+acid+partitioning+in+obese+humans.">Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans.</a> Cell Metab. 2, 251-261 (2005).</li><li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+modulates+skeletal+muscle+substrate+metabolism.">Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> JoVE. , (2011).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).</li><li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization.">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).</li><li>Asmann, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mitochondrial+functions,+mitochondrial+DNA+copy+numbers,+and+gene+transcript+profiles+in+type+2+diabetic+and+nondiabetic+subjects+at+equal+levels+of+low+or+high+insulin+and+euglycemia.">Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia.</a> Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).</li><li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro.">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li></ol>

George Rogers is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument for which this protocol was modified.

Burada sunulan yöntemler fare iskelet kası minimal miktarlarda (~ 75-100 mg) bir mitokondriyal izolasyon prosedürü ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Bu izolasyon prosedürü O 2 tüketimi oranları, RCR değerleri, maksimal sitrat sentaz aktivitesi ve immunoblotting protein ifadesi ile kanıtlandığı gibi yüksek işleyişi, saf mitokondri (~ 450 mikrogram) elde edebiliyor. Önemli olarak, bu prosedür izole mitokondri, yüksek verimlilik sağlayan mikroplaka göre O2 tüketimi tekno...

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies3-5.
Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays. 
Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several &#181;g per well8. Therefore, we present a modification of previously published methods7 to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O2 consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research9,10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/HCl</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5123</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride 
			White Crystals or Crystalline Powder 
			&#8805;99.0 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3581</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771&#160;</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6750&#160;</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>238651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352360</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Halt Protease &#38; Phosphatse Inhibitor Cocktail</td>
			<td rowspan="2">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="2">1861284</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1.5mL microcentrifuge tubes with screw cap</td>
			<td rowspan="2">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="2">3474</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Zirconium Oxide beads</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">C9012112</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody (1D4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-59540</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- COXIV antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4844s</td>
			<td>Any mitochondrial inner membrane protein will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td rowspan="2">Jackson ImmunoResearh</td>
			<td rowspan="2">711-035-152</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)</td>
			<td rowspan="2">Jackson ImmunoResearh</td>
			<td rowspan="2">115-001-003</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Fonksiyonel iskelet kası mitokondri yaşlanma, obezite ve Tip II diyabeti olan gözlenen değiştirilmiş metabolizmasında rol oynar. İzole mitokondriyal müstahzarlardan mitokondriyal respirometrik deneyler, ilaç ve metabolizmasını modüle eden proteinlerin hareket mekanizması (ler) in mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, hem de belirlenmesi için izin verir. Güncel izolasyon prosedürleri genellikle Respirometrik deneyleri için gerekli yüksek kaliteli mitokondri verim dokusunun büyük miktarlarda gerektirir. Bu tarifnamede sunulan yöntemler (~ 450 ug), yüksek verimli, solunum ölçümlerde kullanmak için, fare, iskelet kası, minimum miktarlarda (~ 75-100 mg) izole edilebilir ne kadar kaliteli saflaştırılmıştır mitokondri tarif eder. Bizim izolasyon yöntemi spektrofotometrik sitrat sentaz aktivitesini ölçerek 92.5 ± 2.0% bozulmamış mitokondri verimleri belirlenmiştir. Buna ek olarak, izole edilmiş bir mitokondride Western blot analizi, cytoso soluk ekspresyonu ile sonuçlandılic proteini, GAPDH ve mitokondriyal protein, COXIV sağlam ifadesi. İzole mitokondri belirgin bir GAPDH bantın yokluğu, izolasyon prosedürü sırasında olmayan mitokondriyal kaynaklardan çok az kirlenme göstergesidir. En önemlisi, O 2 tüketimi mikro plakalı tabanlı teknoloji ile hızı ve yüksek birleştiğinde gösterir akuple Respirometrik deneyleri için solunum kontrolü oranı (RCR) belirlenmesi ölçümü (RCR, tüm tahliller için&gt; 6) ve fonksiyonel mitokondri. Sonuç olarak, ayrı bir kıyma adım eklenmesi ve önemli ölçüde daha önce bildirilen yöntemin motor tahrikli homojenleştirme hızını azaltarak yüksek fonksiyonlu teneffüs yüksek bağlanmış mitokondri sonuçlanır fare iskelet kası küçük miktarlarda yüksek kalitede ve saflaştırılmış mitokondri izolasyonunu sağladı mikro-bazlı respirometirc deneyleri sırasında.

Sitrat sintaz aktivitesi sitrat sentez intakt membranlı mitokondri süspansiyonlar içinde mevcut olmamalıdır böylece iç mitokondriyal zarın içinde bulunan ve bu yana membran bütünlüğü için bir ölçüt olarak hizmet vermektedir. 1 sonike ile karşılaştırıldığında sigara sonike mitokondriyal örnekleri sitrat sentaz aktivitesini temsil etmektedir Şekil Aynı izolasyondan örnekler. Sitrat sintaz aktivitesi istatistiksel olarak önemli bir artış mitokondri sonuçla...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements at JoVE.com

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

isolation-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Görüntüleme.  Virginia Tech. Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.