The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

Os estudos em animais foram realizados sob um protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care e usar Comité na Virginia Polytechnic Institute e State University. 1. Instalação (Time: ~ 45 min) <ol><li> Lojas de congelados descongelamento de tripsina a 0,25%, tampão de isolamento para mitocôndrias (IBM) 1 e IBM2 em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Enxágüe copos e instrumentos de dissecação em etanol a 70%, seguido por água de alta pureza. </li><li> Preparar a solução de tripsina a 0,05% a partir de 0,25% estoque de tripsina diluindo 1 parte de tripsina em 4 partes IBM1. </li><li> Misturar protease e fosfatase cocktail inibidor com tampão de lise celular (1: 100 rácio) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com tampa de rosca. </li><li> Alíquotas de 5 ml (5 ml / rato) de tripsina a 0,05% para um tubo de plástico de 15 ml. </li><li> Ajuste motorizado homogeneizador de tecidos a 80 RPM. </li></ol> 2. Isolamento de mitocôndrias Músculo Esquelético (Tempo: ~ 90 min) <ol><li> Euthanize um rato por CO 2 </sub&gt; inalação, seguido por deslocação cervical. </li><li> Remover músculo vermelho do músculo gastrocnémio e quadríceps, que inclui o sóleo (~ 75-100 mg no total) tal como descrito nas etapas a seguir: <ol><li> Descasque a pele para o mouse. </li><li> Remova a almofada de gordura sobre o ponto de origem do quadríceps. Corte o tendão do quadríceps que está ligado à patela com uma tesoura de ponta fina. Nota: O quadríceps é identificado por sua posição anatômica na porção anterior do fêmur proximal. </li><li> Lentamente cortar o aponeurosis entre o osso e os quadríceps, evitando a artéria femoral, para libertar os quadríceps do osso. Corte o tendão com uma tesoura de ponta fina no ponto de origem no fêmur para liberar o músculo quadríceps e coloque o músculo quadríceps em refrigerados PBS. </li><li> Remover o tecido adiposo visível sobre o quadríceps com uma tesoura. Virar o quadríceps de forma que a parte do músculo que se recobre o fémur é virado up. Abra o músculo quadríceps com uma pinça em um movimento de ventilação. Retire as duas porções musculares vermelhas visíveis de cada lobo com uma tesoura de ponta fina e coloque em um copo contendo 5 ml de refrigerados IBM1. Nota: músculo quadríceps aparecem como dois lobos com uma tira de músculo vermelho localizado perto da borda lateral de cada lóbulo. </li><li> Corte a pele que recobre o tendão de Aquiles com tesouras com ponta fina e descascar a pele na direção do mouse. Cortar o tendão de Aquiles exposta e descasque o músculo em direcção ao corpo do rato. </li><li> Corte o tendão no côndilos lateral e medial do fêmur com uma tesoura de ponta fina para libertar o gastrocnêmio e coloque o gastrocnêmio anexado aos seus tendões em refrigerados PBS. </li><li> Virar o gastrocnêmio sobre e descolar o músculo sóleo e coloque no copo contendo 5 ml de refrigerados IBM1. Fan abrir o gastrocnêmio. Remova os três porções visuais vermelhas musculares (duas tiras vermelhas lateral e um medial superficial) com tesoura de ponta finas e transferi-los para o copo contendo 5 ml de refrigerados IBM1. </li></ol></li><li> Remover outro ~ 75-100 mg de vermelho de músculo a outra perna do rato (conforme descrito no passo 2.2) e colocar num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com protease e fosfatase cocktail inibidor e tampão de lise celular (50 mM Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de dodecil sulfato de sódio, 0,5% de desoxicolato de sódio, 1% de polioxietileno (9) nonilfeniléter, ramificada. Imediatamente piscar-congelar esta segunda amostra em azoto líquido para posterior utilização em transferência Western (ver passo 6.1). </li><li> Colocar uma superfície de plástico pré-gelada, plana sobre gelo em um balde grande. Pour uma gota de IBM1 sobre a superfície de plástico e utilizar uma pinça para colocar todo o músculo vermelho segmentado (passo 2.2.4 e 2.2.7) em IBM1 gota. Picar o tecido muscular durante 2 minutos usando 3 individuais lâminas de barbear borda, alterando lâminas de barbear a cada 40 seg. </li><li> Transferir o tecido moído para um novo recipiente com 5 ml de IBM1 fresco, mantendo a superfície de plástico sobre o the proveta e raspando o músculo para a proveta com uma lâmina de barbear. Tome esta solução e drená-lo através de um filtro de células 100 mm colocados em um tubo de 50 ml. </li><li> Seque o tecido com um limpador tarefa delicada e, em seguida, transferi-la para 5 ml de solução de tripsina a 0,05%. Use pinças para remover o tecido a partir da tarefa do limpador. </li><li> Incubar o tecido muscular em gelo durante 30 min em solução de tripsina a 0,05%. </li><li> Rodar as tubo de 15 ml contendo mistura de tripsina / músculo a 200 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Despeje o sobrenadante tripsina em um recipiente de resíduos e ressuspender o sedimento com 3 ml de gelo frio IBM1. Transferir o tecido para um tubo de 45 ml homogeneizador de vidro. Lavar as 15 ml tubo cônico com mais 1,5 ml IBM1 para recolher qualquer amostra restante e adicione ao tubo de homogeneizador de vidro. </li><li> Colocar o tubo homogeneizador de vidro para um copo ou recipiente de plástico a meio caminho cheio de gelo de modo que o homogeneizador de vidro move-se minimamente no interior da taça. </li><li&gt; Homogeneizar a mistura tecido / IMB1 com o pilão de PTFE ligados a um homogeneizador de tecido accionada por motor com 10 passagens a 80 rpm. Segure a parte inferior de cada passagem para ~ 2 seg. </li><li> Transferir o homogeneizado de tecido para um novo tubo de 15 mL cónico e enxaguar o tubo homogeneizador de vidro com 6,5 ml de IBM1. Verter a IBM1 para dentro do tubo cónico de 15 ml contendo homogeneizado de tecido. </li><li> Girar o tubo de 15 ml a 700 g durante 10 min a 4 ° C. Delicadamente despeje o sobrenadante para um tubo de centrífuga de alta resistência vidro e descartar o pellet. </li><li> Girar o sobrenadante do passo anterior a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e re-IBM1 suspender o sedimento, adicionando-se lentamente 500 ul de IBM2. Cortar a extremidade de uma ponta de pipeta e homogeneizar suavemente o sedimento em IBM2 com mistura e agitação movimentos. Adicionar mais 4,5 ml de IBM2 à mistura após a pelete é totalmente suspenso. Nota: Evite trituração excessiva ao quebrar pedaços maiores de pelotas como tHis pode danificar as membranas mitocondriais. </li><li> Girar o homogenato / tecido IBM2 a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C. Nota: Esta etapa pode ser repetida num tubo de centrífuga limpo de alta resistência, para a quantificação mais precisa da proteína de mitocôndrias isoladas no Passo 4, uma vez de BSA residual pode contribuir para o conteúdo de proteína total. </li><li> Remover o sobrenadante e suavemente, mas completamente re-suspender o sedimento, adicionando dois incrementos de 25 ul de IBM2 com uma ponta de pipeta com a ponta cortada. Agitar suavemente o sedimento e misturar após cada adição de 25 ul de IBM2. Coloque este estoque mitocondrial no gelo. </li></ol> 3. A homogeneização da Whole Tissue Lysate (Tempo: ~ 45 min; pode ser feito durante Passo 7) <ol><li> Remover o músculo do que foi colocada em azoto líquido a partir do passo 2.3 e incubar à temperatura ambiente até estarem completamente descongelados. </li><li> Picar o tecido para ~ 30 segundos em gelo com uma tesoura de ponta fina. </li><li> Adicione duas colheres de 100 ul de ZircoÓxido nio Beads para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com tampa de rosca a partir do passo 3.2 que contém o tecido picada. Homogeneizar o tecido em um homogeneizador de tecidos moinho de esferas usando dois a três ciclos de 5 min a uma velocidade de 4-6 configuração (ajuste médio). </li><li> Girar-se a mistura a partir do passo 3.3 a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante utilizando uma ponta de pipeta de 1.000 ul, após a centrifugação e transferência para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Desprezar o pelete e colocar o sobrenadante em gelo. </li></ol> 4. Determinação da proteína (Tempo: ~ 30 min) <ol><li> Determinar a concentração de proteína de lisado de todo o tecido (passo 3.4) e da mitocondrial (passo 2.17) utilizando o kit de ensaio de proteínas BCA de acordo com as especificações do fabricante. </li></ol> 5. As mitocôndrias Membrane Integridade; Citrato sintase (CS) Atividade (Tempo: ~ 15 min) <ol><li> Faça dois separados 1: 20 diluições do estoque mitocondrial em água de alta pureza. Adicionar0,1% de Triton X-100 para uma amostra e sonicate-lo em um nível baixo (765 Watts, amplitude de 2). Deixe a outra diluição no gelo. Recolocar a amostra de gelo após sonicação. </li><li> Realizar um ensaio de citrato sintase tanto com a não-sonicada e sonicada diluições mitocondriais utilizando um ensaio espectrofotométrico conforme anteriormente descrito 11,12. </li><li> Determinar a percentagem de membranas mitocôndrias intactas, utilizando as seguintes equações: (CS atividade não-sonicado ÷ sonicado atividade CS) * 100 </li></ol> 100- N- (percentagem obtida a partir de cima) 6. As mitocôndrias Qualidade de isolamento; Western Blotting (Horário: De acordo com Lab Protocol) <ol><li> Realizar Western blotting em todo o lisado de tecido e mitocôndrias isoladas como anteriormente descrito 12. Nota: O uso de anticorpos primários para GAPDH (1: 1000 de diluição em 5% de BSA / TBS-T) e COXIV (1: 1000 de diluição em 5% de gordura não-leite / TBS-T), seguido por anti-cabra, e anticorpos secundários de coelho, respectivamente (1: 10.000). </li></ol> 7. respirométrico Ensaio Run (Time: ~ 90 min) <ol><li> Realizar ensaios respirométricos desejados utilizando baseado O 2 tecnologia de medição do consumo de microplaca, como descrito anteriormente (ver artigo do companheiro e Rogers et al 8). </li><li> Determinar a relação de controle respiratório (RCR) dividindo Estado 3 por Estado 4o (RCR) ou dividindo 3U Estado por Estado 4o. Use o (média) ponto médio, ou o mais elevado (estado 3) e taxas mais baixas (4o Estado) a partir de vestígios ponto-a-ponto ao determinar RCR. </li></ol>

<ol>
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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+modulates+skeletal+muscle+substrate+metabolism.">Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> JoVE. , (2011).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).</li><li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. 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George Rogers is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument for which this protocol was modified.

Os métodos aqui apresentados proporcionam uma descrição detalhada de um procedimento de isolamento de quantidades mínimas mitocondrial (~ 75-100 mg) de rato músculo esquelético. Este procedimento de isolamento é capaz de produzir alto funcionamento, as mitocôndrias puro (~ 450 mg) como evidenciado pela O2 taxas de consumo, valores RCR, atividade da citrato sintase máxima e expressão de proteína de immunoblotting. Importante, as mitocôndrias isoladas a partir deste processo pode ser usado para múl...

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies3-5.
Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays. 
Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several &#181;g per well8. Therefore, we present a modification of previously published methods7 to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O2 consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research9,10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/HCl</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5123</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride 
			White Crystals or Crystalline Powder 
			&#8805;99.0 %</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3581</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771&#160;</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6750&#160;</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>238651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352360</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Halt Protease &#38; Phosphatse Inhibitor Cocktail</td>
			<td rowspan="2">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="2">1861284</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1.5mL microcentrifuge tubes with screw cap</td>
			<td rowspan="2">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="2">3474</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Zirconium Oxide beads</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">C9012112</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody (1D4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-59540</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- COXIV antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4844s</td>
			<td>Any mitochondrial inner membrane protein will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td rowspan="2">Jackson ImmunoResearh</td>
			<td rowspan="2">711-035-152</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)</td>
			<td rowspan="2">Jackson ImmunoResearh</td>
			<td rowspan="2">115-001-003</td>
			<td rowspan="2">N/A</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Disfuncionais mitocôndrias do músculo esquelético desempenha um papel no metabolismo alterado observado com o envelhecimento, obesidade e diabetes tipo II. Ensaios respirométricos mitocondriais isoladas a partir de preparações mitocondriais permitir a avaliação da função mitocondrial, bem como a determinação do mecanismo (s) de acção de drogas e proteínas que modulam o metabolismo. Procedimentos de isolamento atuais requerem muitas vezes grandes quantidades de tecido para produzir mitocôndrias de alta qualidade necessários para ensaios respirométricos. Os métodos aqui apresentados descrevem como de alta qualidade mitocôndrias purificadas (~ 450 mg) pode ser isolado a partir de quantidades mínimas (~ 75-100 mg) de rato músculo esquelético para utilização em medições respiratórias alto rendimento. Nós determinamos que nosso método de isolamento produz 92,5 ± 2,0% mitocôndrias intacto medindo atividade da citrato sintase espectrofotometria. Além disso, a análise de Western blot em mitocôndrias isoladas resultou na expressão fraca da cytosoproteína lic, GAPDH, e a expressão robusta da proteína mitocondrial, COXIV. A ausência de uma banda proeminente GAPDH nas mitocôndrias isoladas é indicativo de pouca contaminação a partir de fontes não-mitocondriais durante o procedimento de isolamento. Mais importante ainda, a medição da taxa de consumo de O2 com a tecnologia de micro-placa de base e a determinação do índice de controlo respiratório (RCR) para ensaios respirométricos acoplados mostra altamente acopladas (RCR;&gt; 6 para todos os ensaios) e mitocôndrias funcionais. Em conclusão, a adição de um passo de picagem separado e reduzindo significativamente accionada por motor de velocidade de homogeneização de um método previamente relatado que permitiu o isolamento de alta qualidade e de mitocôndrias purificadas a partir de pequenas quantidades de rato músculo esquelético que resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com elevada função durante microplacas ensaios respirometirc.

Atividade da citrato sintase serve como uma medida para a integridade da membrana, uma vez sintase de citrato é localizado na membrana mitocondrial interna, e, portanto, não devem estar presentes nas suspensões de mitocôndrias com membranas intactas. A Figura 1 representa a actividade da sintase de citrato em amostras não sonicada mitocondriais em comparação com sonicada amostras do mesmo isolamento. Sonicando os resultados mitocôndria em um aumento estatisticamente significativo na atividade da...

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Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.7K visualizações.  Virginia Tech. Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.